CROMATOGRAFIA

Cromatografia cuprinde o familie de metode fizico-chimice de separare, analitică sau

preparativă, a amestecurilor complexe de molecule, bazate pe distribuţia repetată a moleculelor
între o fază mobilă şi una staţionară. Operarea acestor procese, cuplate cu mişcarea fazei
mobile, rezultă într-o migrare diferenţiată a moleculelor de-a lungul fazei staţionare. Pe
parcursul sistemului cromatografic se stabileşte de mai multe ori echilibrul dintre cele două faze.
Lungimea corespunzătoare stabilirii unui echilibru, referitoare la o componentă a amestecului,
se numeşte lungimea unui taler teoretic. Condiţia unei separări bune este ca lungimea
talerelor teoretice să fie mică pentru toate componentele amestecului şi procesul, în totalitate,
să cuprindă un număr cât mai mare de talere.

Cu toate că denumirea aminteşte de faptul că metodele cromatografice s-au folosit

prima dată la separarea substanţelor colorate, astăzi aceste metode constituie un instrument util
în chimia analitică a oricărei clase de substanţe chimice sau biologice.

Criterii de clasificare

Clasificare după starea fizică a fazelor staţionară şi mobilă care constituie

sistemul cromatografic

a) faza staţionară solidă:

- faza mobilă gaz: cromatografie gaz - solid (CGS)

- faza mobilă lichid: cromatografie lichid - solid (CLS)

b) faza staţionară lichidă:

- faza mobilă gaz: cromatografie gaz - lichid (CGL)

- faza mobilă lichid: cromatografie lichid - lichid (CLL)

Clasificare după natura interacţiunilor dintre componentele amestecului şi fazele

mobilă şi/sau staţionară

Distribuţia moleculelor între cele două faze este guvernată de una sau mai multe din
cele patru procese de bază: adsorbţia, schimbul ionic, repartiţia şi gel filtrarea. În acest caz
cromatografia poate fi:

a) Cromatografia de adsorbţie (CA)

În cromatografia de adsorbţie (Figura 16) faza staţionară este un solid iar faza mobilă
este o soluţie apoasă sau neapoasă. Pe măsură ce materialul se mişcă de-a lungul coloanei,
procesul de adsorbţie-desorbţie este repetat de multe ori. Viteza de mişcare a moleculelor
depinde de gradul lor de adsorbţie la suportul solid. Forţele implicate în adsorbţie sunt
interacţiuni dipol-dipol, forţe van der Waals, legături de hidrogen, interacţiuni hidrofobe.
Adsorbanţii disponibili sunt limitaţi, de exemplu răşini bazate pe polistiren (pentru molecule
nepolare), silice, oxid de aluminiu şi fosfat de calciu (pentru moleculele polare). Cei mai mulţi
dintre adsorbanţi trebuie activaţi prin încălzire la
110-120˚C înainte de utilizare deoarece capacitatea lor de adsorbţie scade în prezenţa apei
legate. Cromatografia de adsorbţie poate fi realizată în coloană sau pe strat subţire, folosind o
varietate mare de solvenţi organici.

Figura 16. Cromatografia de

adsorbţie (faza staţionară
polară)

b) Cromatografia de partiţie (CP)

În cromatografia de partiţie (de repartiţie) (Figura 17) distribuţia moleculelor între fazele
lichide, mobilă şi staţionară, se bazează pe solubilităţile moleculelor în cele două faze. O
substanţă, solubilă în două faze nemiscibile, se va distribui (va partiţiona) între aceste două faze
în acord cu solubilitatea ei. Coeficientul de partiţie (repartiţie) reprezintă raportul
concentraţiilor substanţei în cele două faze (solvenţi) şi este constant, indiferent de concentraţia
absolută.

Figura 17. Cromatografia de

partiţie lichid – lichid cu fază
inversă (faza staţionară nepolară)

Substanţele care sunt mai solubile în faza mobilă vor trece rapid prin sistem în timp ce
cele mai solubile în faza staţionară vor fi încetinite. Faza staţionară lichidă este menţinută pe loc
de un solid poros, cum ar fi o hârtie de filtru (fibre de celuloză). În acest caz, hârtia de filtru
umedă (un strat polar de molecule de apă legate la grupările hidroxilice ale celulozei) reprezintă
faza staţionară normală, iar stratul de lichid de deasupra hârtiei umede (de obicei un solvent
organic relativ nepolar) reprezintă faza mobilă. Distribuţia moleculelor între cele două faze are
loc repetat pe măsură ce materialul se mişcă în susul sau în josul hârtiei. Moleculele nepolare
se vor mişca mai repede în acest sistem decât într-unul polar. În cazul cromatografiei de partiţie
cu fază inversă, faza staţionară este un solvent nepolar (exemplu o hidrocarbură C18 ca
octadecilsilanul) care este legat chimic la o matrice suport poroasă (exemplu silice), în timp ce
faza mobilă poate fi aleasă dintr-un număr mare de solvenţi, de obicei apă sau o soluţie tampon
apoasă, conţinând unul sau mai mulţi solvenţi organici - exemplu acetonitril (ca în cromatografia
de înaltă presiune cu fază inversă, FI-HPLC).

c) Cromatografia de schimb ionic (CSI)

În cromatografia de schimb ionic (Figura 18) moleculele sunt separate pe baza sarcinii
lor nete. Faza staţionară este o răşină schimbătoare de ioni (un polimer reticulat cu multe
grupări funcţionale încărcate electric) iar faza mobilă este o soluţie apoasă. Moleculele sunt
întârziate în mişcarea lor de-a lungul coloanei, depinzând de semnul şi mărimea sarcinii lor. Are
loc repetat legarea electrostatică a moleculelor la grupările cu sarcini opuse ale răşinii
schimbătoare de ioni şi ruperea acestor legături. Ideal, proba este aplicată pe coloană la un pH
la care moleculele au sarcina opusă celei a grupărilor răşinii, astfel încât moleculele se leagă la
coloană. pH-ul tamponului de eluţie este apoi schimbat, astfel schimbându-se şi sarcina netă a
moleculelor. Când moleculele şi grupările funcţionale ale răşinii poartă sarcină de acelaşi semn,
moleculele sunt respinse de grupările răşinii şi sunt eluate de pe coloană. Moleculele pot fi, de
asemenea, eluate de pe schimbătorul de ioni prin creşterea tăriei ionice (concentraţiei) a
eluentului.

Schimbătorii de ioni pot fi cationici sau anionici, depinzând de ionul pe care îl schimbă.
O răşină care are grefate grupări negative şi schimbă ioni pozitivi este un cationit şi viceversa
pentru un anionit. Fiecare tip de schimbător este clasificat ca puternic sau slab, în funcţie de
tăria ionizării grupărilor funcţionale. Un schimbător cu o grupare aminică cuaternară este astfel
un schimbător anionic bazic puternic, în timp ce grupări aminice secundare alifatice sau
aromatice duc la un schimbător anionic bazic slab. Un cationit acidic puternic conţine grupări
acidice sulfonice. Tabelul 3 prezintă o listă cu cei mai comuni schimbători de ioni.
 Tabel 3. Răşini schimbătoare de ioni

Denumire Grupă funcţională Matrice Clasă

Schimbători anionici

AG 1 tetrametilamoniu polistiren puternic

AG 3 amină terţiară polistiren slab

DEAE-celuloză dietilaminoetil celuloza slab

PEI-celuloză polietilenimină celuloza slab

DEAE-Sephadex dietilaminoetil dextran slab

QAE-Sephadex dietil-(2-hidroxipropil)- dextran puternic

aminoetil

Schimbători cationici

AG 50 sulfonil polistiren puternic

Bio-Rex 70 carboxil acrilic slab

CM-celuloză carboximetil celuloză slab

P-celuloză fosfat celuloză intermediar

CM-Sephadex carboximetil dextran slab

SP-Sephadex sulfopropil dextran puternic

Abilitatea unui schimbător de ioni de a adsorbi contraioni este definită cantitativ de

capacitate. Capacitatea totală a unui schimbător de ioni este cantitatea de grupări încărcate
sau potenţial încărcate per unitate de masă de material uscat. Se exprimă de obicei în
miliechivalenţi de grupări ionizabile per miligram substanţă uscată şi poate fi determinată
experimental prin titrare. Capacitatea unui schimbător ionic este funcţie şi de porozitatea răşinii.
Matricea este reticulată prin legături covalente, formând o “sită moleculară”, şi grupările
funcţionale ionizate din interiorul matricei nu sunt accesibile moleculelor mari, care nu pot intra
în pori. Doar sarcinile de suprafaţă vor fi accesibile acestor molecule pentru schimb.
 Figura 18. Cromatografia
de schimb ionic (cationit)

Porozitatea răşinii depinde de gradul ei de reticulare. Răşinile pur sintetice (polistirenice

sau acrilice) au o reticulare între 2 şi 16%, cu 8% fiind cele mai bune în acest scop. Schimbătorii
de ioni celulozici au reticulare redusă sau de loc, în timp ce cei bazaţi pe dextran sunt disponibili
în două grade de reticulare. Având în vedere diferitele opţiuni experimentale, este dificil să se
selecteze condiţiile cele mai potrivite pentru o anume separare.

CSI poate fi utilizată pentru separarea unor amestecuri foarte variate de biomolecule
ionice: aminoacizi, peptide, proteine, nucleotide.

d) Cromatografia de gel-filtrare (CGF) (de excluziune sterică sau cernere

moleculară)

În acest tip de cromatografie (Figura 19), faza staţionară constă din particule sferice de
gel cu mărime şi porozitate controlată (polimeri reticulaţi) şi este în general folosită sub formă de
coloană. Faza mobilă este lichidul trecut prin coloană. Moleculele sunt fracţionate pe baza
mărimii şi formei lor. Aceşti doi parametri determină viteza şi extinderea difuziunii moleculelor.
Moleculele mai mici difuzează mai uşor în porii particulelor de gel decât cele cu dimensiuni
mari, având aceeaşi formă generală. Cu cât penetrarea în pori este mai mare, cu atât mai
întârziată va fi mişcarea moleculelor prin coloană. Mişcarea în interiorul şi în afara particulelor
de gel are loc repetat pe măsură ce materialul se mişcă prin coloană. Moleculele care sunt mai
mari decât porii particulelor de gel sunt excluse din gel şi se mişcă mai rapid prin spaţiul dintre
particulele de gel. Astfel, pentru moleculele care au aproximativ aceeaşi formă, cu cât este mai
mică masa lor moleculară, cu atât mişcarea lor este mai înceată de-a lungul coloanei şi necesită
un volum de eluţie mai mare. Principalul factor de separare în gel-filtrare este masa moleculară
a particulelor. Pe lângă aceasta, trebuie luaţi în considerare (în unele cazuri) şi alţi factori, cum
ar fi interacţiuni de sarcină, efecte de adsorbţie.
 Condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească un gel spre a fi utilizat în cromatografia de
gel-filtrare sunt:

- matricea gelului trebuie să fie inertă chimic;

- gelurile trebuie să fie stabile fizico-chimic;

- trebuie să prezinte un conţinut mic în grupări ionice pentru a evita efectele de schimb
ionic;

- să aibă grad de umectare mare;

- să poată fi obţinută o gamă largă de tipuri de gel cu aceeaşi constituţie chimică, dar cu
porozitate şi mărime a particulelor diferită, pentru a acoperi diferite domenii de fracţionare;

- mărimea particulelor şi distribuţia pe mărimi a particulelor să fie riguros controlată;

- granulele gelului să fie rigide, stratul cromatografic să nu se compacteze şi să opună

rezistenţă la eluţie (rezistenţă mecanică bună).

Figura 19. Cromatografia

de
gel filtrare

Diferite firme comerciale au produs o serie de geluri având la bază diferiţi polimeri.
Câteva exemple sunt prezentate în Tabelul 4.
 Tabelul 4. Geluri utilizate în cromatografia de gel-filtrare

Denumire comercială Firma producătoare Tip de polimer

Sephadex G Pharmacia Fine Chemicals dextran

Bio-Gel P Bio-Rad poliacrilamidă

Sagavac SAG SERAVAC agar

Bio-Gel A Bio-Rad agaroză

Gelarose Litex agaroză

Sepharose B Pharmacia Fine Chemicals agaroză

Volumul total (Vt) al coloanei de gel filtrare are trei componente:

Vi = volumul din interiorul particulelor; volumul accesibil solventului; este cunoscut ca

volumul intern;

Vg = volumul cu care contribuie pereţii solizi şi lanţurile reticulate interne ale particulelor
de gel; volum inaccesibil solventului;

Vo = volumul de lichid din afara şi dintre particulele de gel; este cunoscut ca volumul
liber.

Deci :

Vt = Vi + Vg + Vo (1)

Volumul de eluţie (Ve) al unei specii de molecule este acel volum de eluent care
părăseşte coloana din momentul în care proba a penetrat coloana pentru prima dată şi până în
acel moment în care proba (molecula) apare în efluentul coloanei. În practică acest volum este
de obicei (dar nu întotdeauna) luat ca volumul eluat de pe coloană din momentul aplicării probei
până în momentul apariţiei peak-ului probei în fracţia de eluţie.
 Figura 20. Determinarea masei moleculare prin gel-filtrare. Graficul volumului de
eluţie în funcţie de logaritmul masei moleculare pentru proteine. Gel utilizat: Sephadex G-
75. Coloana: 1,10 x 24 centimetri. Eluent: tampon Tris 0,05M (pH 7.5), conţinând KCl 0,1M.

Utilizând proteine cu aceeaşi formă generală şi cu mase moleculare cunoscute se poate

calibra o coloană de gel filtrare reprezentând grafic volumul de eluţie în funcţie de logaritmul masei
moleculare. Utilizând o coloană identică, se poate determina masa moleculară a unei proteine
necunoscute din volumul de eluţie (Figura 20).

O altă modalitate este de a reprezenta grafic Ve/Vo în funcţie de logaritmul masei

moleculare. În acest caz, masa moleculară a unei proteine necunoscute poate fi determinată
utilizând o coloană având orice mărime dorită şi determinând valoarea Ve/Vo pentru proteina
necunoscută.

e) Cromatografia de afinitate (CA)

Este cel mai selectiv tip de cromatografie şi constă în stabilirea unor legături între
componenta de separat şi un ligand. În cromatografia de afinitate, ligandul (o moleculă, un grup,
ion sau atom) este ataşat covalent la matrice (polimerul suport). Legătura dintre ligand şi
molecula de separat este strict specifică şi se bazează, de obicei, pe activitatea biologică a
moleculelor (antigen-anticorp, enzimă-substrat, hormon-proteină de transport sau receptor,
ADN sau ARN-secvenţă de baze complementare, etc).

De exemplu, ligandul poate fi reactantul sau produsul la care enzima se leagă in vivo.
Pe măsură ce un amestec de proteine este trecut prin coloană, numai proteina ţintă se leagă
specific la matrice. Coloana este spălată apoi de câteva ori cu tamponul în care proteinele au
fost dizolvate pentru a elua proteinele care au fost legate nespecific. În final, proteina ţintă este
eluată prin trecerea prin coloană a unui solvent conţinând o concentraţie mare de ligand liber,
sau o soluţie salină concentrată.

În CA, ligandul trebuie să prezinte o interacţiune specifică dar reversibilă cu molecula de

purificat. Trebuie de asemenea să conţină o grupare funcţională reactivă, independentă de cele
ale centrului biospecific activ, care va permite ataşarea covalentă la matricea suport. Aceasta
nu trebuie să prezinte efecte de adsorbţie nespecifice şi să aibă suficiente grupări funcţionale
reactive pentru ataşarea ligandului. O matrice suport ideală este agaroza. Dacă ligandul este
mic şi molecula de purificat este mare, legarea poate fi restricţionată datorită prezenţei prea
apropiate a suprafeţei matricei. Această problemă poate fi rezolvată prin introducerea unui “braţ
distanţier” (exemplu o catenă hidrocarbonată cu 6 atomi de carbon) între ligand şi matrice
(Figura 21).

Figura 21. Cromatografia de

afinitate
 Un dezavantaj al CA este faptul că trebuie realizat un ligand diferit pentru fiecare
separare individuală, ceea ce duce la consum de timp iar procesul devine scump. Poate fi mult
mai practică utilizarea unor “adsorbanţi de grup” ce conţin liganzi cu afinitate pentru o clasă de
substanţe înrudite biochimic.

Exemple de adsorbanţi cu specificitate de grup includ:

• Lectinele (un grup de proteine produse de fungi, plante şi animale) leagă specific resturi
glucidice. Sunt foarte utile pentru purificarea macromoleculelor ce conţin glucide precum
glicoproteine, lipoproteine serice, proteine-receptor membranare.
• Proteina A (proteină membranară de suprafaţă din bacteria Staphylococcus aureus) are
afinitate pentru regiunea constantă (Fc) a anticorpilor IgG ai multor specii de mamifere.
• Coloranţii imobilizaţi (exemplu Cibacron Blue F3G-A, disponibil ca suport de afinitate sub
denumirea de Blue Sepharose) se utilizează pentru purificarea unui număr mare de enzime
şi proteine. Aceşti coloranţi au similarităţi de structură cu cofactori nucleotidici ca NAD+ şi
NADP+ şi se utilizează pentru purificarea enzimelor care necesită aceşti cofactori.
• Poli(uridinil)-agaroza poate fi utilizată pentru izolarea de ARNm datorită cuplării biospecifice
a poli(uridinil) cu secvenţa terminală poli(adenil) caracteristică moleculelor de ARNm. Poate fi
de asemenea utilizat pentru izolarea proteinelor şi enzimelor care se leagă la ARN, cum ar fi
reverstranscriptazele.
Cromatografia de afinitate singură poate uneori să purifice o proteină de
1000-10000 de ori.

Clasificare după forma şi construcţia fazei staţionare

În funcţie de tipul fazei staţionare, cromatografia poate fi clasificată în:

a) Cromatografia capilară

b) Cromatografia în strat subţire (CSS)

c) Cromatografia pe hârtie (CH)

Cromatografia pe hârtie este o formă specială a cromatografiei de partiţie care a avut o

utilizare largă între anii 1940-1960 într-o serie întreagă de domenii şi mai ales în biochimie. În
prezent a fost însă practic înlocuită cu cromatografia în strat subţire. Ca material de suport se
utilizează celuloza sub forma unei hârtii speciale, tăiată în formă de benzi dreptunghiulare sau
în formă de ic, în rondele întregi sau sectorizate. Acestea conţin faza staţionară, de obicei apa,
sau sunt uneori impregnate cu substanţe hidrofobe (cromatografie în fază inversă).

În diferite variante de tehnici, faza mobilă irigă ascendent sau descendent hârtia. O
substanţă dată migrează cu atât mai repede cu cât are un coeficient de partiţie mai mare în
raport cu faza mobilă.

Proba (amestecul de componente de separat) se depune într-un punct de start, în

cantitate foarte mică (1-10 microlitri). Hârtia este uscată, apoi irigată (developată) cu un solvent
în sistem mono sau bidimensional.

După migrare, hârtia este din nou uscată, apoi substanţele sunt vizualizate (prin reacţii
de culoare, lumină UV) şi apar sub forma unor pete (spoturi) sau benzi, fapt care permite
evidenţierea calitativă a componentelor, evaluarea lor cantitativă şi obţinerea componentelor în
scop preparativ (prin decuparea spoturilor şi apoi eluare, sau prin scurgerea continuă a
componentelor în recipiente separate).

Aparatura este extrem de simplă şi uşor de întrebuinţat. Metoda prezintă însă o serie de
dezavantaje şi anume:

• durata mare a timpului de separare

• separarea defectuoasă a unor substanţe
• formarea de trenuri şi delimitări difuze ale spoturilor în urma interferenţei unor
efecte parazite de tipul schimbului ionic şi de adsorbţie.

Cu toate acestea cromatografia pe hârtie a cunoscut aplicaţii largi în analiza

amestecurilor de aminoacizi, zaharuri, componente lipidice, acizi organici, porfirine şi pigmenţi
biliari, alcaloizi, hormoni şi medicamente într-o serie întreagă de produse biologice în scop de
cercetare sau diagnostic.

Ambele (CSS şi CH) se pretează la cromatografia bidimensională.

Mişcarea substanţelor în cromatografia pe hârtie sau în strat subţire este caracterizată

de valoarea Rf (Retention factor = factorul de retenție). Aceasta reprezintă raportul dintre
distanţa parcursă de probă şi cea parcursă de solvent, amândouă măsurate de la linia de
origine (start) :

distanţa parcursă de probă

Rf = (2)
distanţa parcursă de solvent

Valoarea Rf este proporţională cu solubilitatea probei în faza mobilă.

 Alternativ, se poate exprima mişcarea substanţelor raportând-o la un standard cu
mobilitate cunoscută, RX, unde:

distanţa parcursă de probă

RX = (3)
distanţa parcursă de standard

d) Cromatografia pe coloană

Faza staţionară, în general sub formă de particule sferice (un adsorbent, o răşină sau un
gel) este conţinută într-un tub de sticlă, plastic sau oţel. Eluentul este introdus în coloană cu
ajutorul unei pompe debitoare sau se lasă să curgă prin coloană sub acţiunea gravitaţiei.

Amestecul de separat este introdus la acel capăt al coloanei unde pătrunde eluentul.
Efluentul, care se colectează la celălalt capăt al coloanei, se trece printr-un dispozitiv analizor,
care sesizează prezenţa componentelor. Componentele separate părăsesc succesiv coloana şi
pot fi colectate separat (Figura 22).

Figura 22. Componentele sistemului Figura 23. Caracteristicile peak-ului

cromatografic în coloană (stânga) la o separare cromatografică (dreapta)

Analizoarele (cu detectoarele) cele mai utilizate sunt:

 1. pentru cromatografia de lichide:
• refractometru diferenţial
• detector fotometric (cel mai adesea UV dar şi vizibil)
• detector de fluorescenţă
• detectori electrochimici (amperometrici sau coulometrici)
2. pentru cromatografia de gaze:
• detector cu ionizare în flacără
• detector bazat pe conductivitatea termică
• detector cu captare de electroni

Pentru evaluarea separării se construieşte un profil de eluţie (o cromatogramă) prin

reprezentarea grafică a cantităţilor de substanţe eluate în funcţie fie de timp, fie de volumul de
eluţie, fie de numărul de fracţii. Această reprezentare ar trebui să prezinte peak-uri simetrice
pentru fiecare substanţă (Figura 23).

Se poate exprima migrarea unei anumite substanţe la o viteză de migrare dată în

termeni de:

• timp de retenţie (tR) - reprezintă timpul necesar pentru eluţia maximă a unei
componente; se măsoară din momentul injecţiei probei în coloană până la apariţia
cantităţii maxime din respectiva substanţă, eluată din coloană;
• volum de retenţie (VR) - reprezintă volumul de solvent necesar pentru a elua
componenta respectivă, calculat tot din momentul introducerii probei în coloană.
Se poate calcula cu formula:

VR = FtR (4)

unde F = viteza de eluare

Eficienţa de separare a unei coloane este măsurată prin abilitatea de a distinge între
două substanţe similare, exprimată în termeni de:

• selectivitate - reprezintă diferenţa între timpii de retenţie a două peak-uri

(exemplu ta-tb).

• rezoluţie (RS) - reprezintă raportul dintre dublul selectivităţii şi suma lăţimii bazelor
(W) celor două peak-uri:

2 ta - tb
RS = (5)
Wa + Wb
unde indicii a şi b se referă la substanţele a, respectiv b (Figura 25). Pentru cele mai multe
scopuri practice, valori RS de 1 sau mai mari sunt satisfăcătoare, corespunzând la o separare a
peak-urilor de 98% în cazul peak-urilor simetrice.

După compoziţia fazei mobile

În timpul separării prin cromatografie pe coloană se poate modifica compoziţia eluentului

(concentraţie, pH, compoziţie, etc) după un program bine stabilit. Acest mod de lucru poartă
numele de cromatografie prin gradient. Dacă în timpul separării nu se schimbă compoziţia
eluentului, cromatografia este izocratică.

Cromatografia lichidă de înaltă performanţă (HPLC)

Cromatografia pe coloană utilizează cantităţi mari de faze staţionare “moi”, care necesită
curgeri prin coloană a fazei mobile la presiune scăzută pentru a evita compresia; separările
necesită de obicei timp lung iar rezoluţia este scăzută (performanţă scăzută).

Rezoluţia metodelor cromatografice convenţionale este mult îmbunătăţită prin utilizarea

tehnicii HPLC. Matricea (suportul) în HPLC constă din particule sferice care sunt mult mai mici
şi mai uniforme ca dimensiune, şi mult mai strâns împachetate decât particulele din coloanele
cromatografice convenţionale. Eluentul este trecut prin coloană cu o presiune mare (până la
400 bari). Astfel viteza, rezoluţia şi sensibilitatea sunt mult crescute utilizând HPLC, deşi
separarea se bazează pe aceleaşi principii care guvernează cromatografia de schimb ionic, gel-
filtrarea, cromatografia de afinitate, etc.

Coloanele HPLC sunt de obicei confecţionate din oţel inoxidabil, şi toate componentele,
valvele, etc, sunt realizate din materiale care rezistă la presiunile înalte utilizate. Separarea unor
macromolecule (în special proteine şi acizi nucleici) necesită, de obicei, sisteme
“biocompatibile”, în care componentele din oţel inoxidabil sunt înlocuite cu titan, sticlă,
fluoroplastice; se utilizează presiuni mai scăzute pentru a evita denaturarea, exemplu sistemul
Pharmacia FPLC.

Comparativ cu formele clasice ale cromatografiei de lichide (CH, CSS, CC), HPLC
prezintă o serie de avantaje:

- Rezoluţia şi viteza de analiză depăşesc cu mult metodele clasice;

- Coloanele HPLC pot fi reutilizate fără reîmpachetare sau regenerare;
- Reproductibilitatea este mult îmbunătăţită deoarece parametrii care afectează
eficienţa separării pot fi controlaţi îndeaproape;
- Manevrarea aparatului şi analiza datelor pot fi uşor automatizate;
- HPLC este adaptabil la proceduri preparative la scară mare;
- HPLC este utilizată pentru separarea unui număr foarte mare de biomolecule
nepolare, polare şi ionice, incluzând peptide, proteine, oligozaharide, vitamine.
 Componentele unui sistem HPLC sunt prezentate în Figura 24.

Figura 24. Componentele unui sistem HPLC

Cromatografia de gaz (CG)

CG clasică utilizează coloane de oţel cu diametrul intern de 1-2 milimetri şi cu lungime

de 2-3 metri, umplute cu particule solide, acoperite cu filmul fazei staţionare.

CG modernă utilizează coloane cromatografice capilare (diametrul intern 0,1-0,5

milimetri) cu lungime de până la 50 metri (Figura 25).

Faza staţionară este în general un polimer siliconic reticulat, depus sub formă de film
pe peretele interior al capilarei; la temperaturile de operare acesta se comportă într-o manieră
similară unui film de lichid, dar este mult mai robust.

Faza mobilă (“gazul purtător”) este de obicei azot sau heliu. Separarea selectivă se
realizează prin partiţia diferenţiată a componentelor individuale între gazul purtător şi faza
polimerică siliconică.
 Figura 25. Componentele unui sistem gaz-cromatografic

Separarea majorităţii biomoleculelor este influenţată de temperatura coloanei, care

poate să fie constantă în timpul analizei (izotermă-de obicei 50-250˚C) sau, mai adesea, poate
să crească după un program (exemplu de la 50˚C la 250˚C, crescând cu 10˚C pe minut).

Temperatura este asigurată prin plasarea coloanei într-un cuptor termostatat. Probele
sunt injectate în “capul” coloanei printr-un sistem de injecţie conţinând un septum, sub forma
unei soluţii foarte diluate. Datorită temperaturii ridicate toate componentele soluţiei sunt
vaporizate, preluate de gazul purtător şi trecute prin coloana cromatografică pentru separare.
Ieşirea din coloană se poate monitoriza cu sistemele prezentate. Sistemele de detecţie
spectrometrice includ spectrometria de masă (CG-SM) şi spectroscopia în infraroşu (CG-IR).

CG poate fi utilizată în cazul probelor capabile de volatilizare la temperatura de operare

a coloanei, exemplu acizi graşi cu catenă scurtă. Alte substanţe necesită modificări chimice
pentru a obţine produşi mai volatili (exemplu acizii graşi saturaţi cu catenă lungă sunt analizaţi
de obicei sub forma esterilor lor metilici în timp ce monozaharidele sunt convertite în derivaţii lor
trimetilsilil).

Aplicaţie practică

A. Cromatografia pe hârtie a aminoacizilor

Principiu

Aminoacizii dintr-un amestec se pot separa prin CH, conform metodei prezentate.
 Reactivi

1. Amestec de aminoacizi: soluţie 0,3% de acid aspartic, alanina şi leucina.

2. Eluent: amestec de n-butanol, acetonă, acid acetic, apă, în raport volumetric de
3,5 : 3,5 : 1,0 : 2,0.
3. Soluţie de ninhidrină: 0,2% în n-butanol cu 1% acid acetic. Se foloseşte pentru
vizualizarea aminoacizilor migraţi.
4. Hârtie Whatman nr.1 (mijlocie lentă), tăiată în fâşii de 12 x 2,5 centimetri.

Materiale şi aparatură

• cameră cromatografică;
• pulverizator;
• sursă de aer cald;
• reşou electric sau etuvă;
• cilindru gradat, micropipetă.

Mod de lucru

În camera cromatografică se introduc 10 mililitri eluent. Se ataşează capacul. Se agită

uşor, în plan orizontal, pentru a crea o atmosferă saturată în vapori de eluent.

Pe hârtia cromatografică se trasează uşor, cu creionul, la 1,5 centimetri de la bază, o

dreaptă. În centrul ei se aplică o picătură (aprox.5 microlitri) din soluţia de aminoacizi, utilizând
micropipeta. Se usucă imediat hârtia cu uscătorul de păr. Se suspendă banda de hârtie în
camera cromatografică în aşa fel încât să pătrundă în eluent circa 5 milimetri. Dreapta trasată,
unde s-a depus soluţia de aminoacizi, nu are voie să pătrundă în eluent. Se menţine hârtia în
camera acoperită până când frontul solventului ajunge la circa 2 centimetri de partea superioară
a hârtiei. Se scoate hârtia din cameră. Se marchează, cu creionul, frontul solventului. Se usucă
cu uscătorul de păr. Se pulverizează hârtia cu soluţia de ninhidrină. Se încălzeşte deasupra
reşoului (sau în etuvă la 100˚C) până apar spoturile violete ce marchează prezenţa
aminoacizilor.

Calcul

Se calculează valorile Rf pentru cei trei aminoacizi (vezi şi Figura 26). Ordinea de
migrare, în funcţie de hidrofobicitatea aminoacizilor, de la cel mai rapid la cel mai lent, este:
leucina, alanina, acid aspartic

Importanţă clinică
 Procedeul este folosit mai ales pentru punerea în evidenţă
evidenţă a hiperaminoaciduriilor în
cadrul erorilor înnăscute
scute de metabolism (cistinurii, fenilalaninurii,
fenilalaninurii, glicinurii, etc) ca şi în cadrul
unor afecţiuni
iuni renale ca diabetul gluco-aminat,
gluco aminat, nefroze, acidoza tubulară;
tubulară unele avitaminoze,
rahitism

Figura 26.
26. Cromatografia pe hârtie a aminoacizilor

Interpretarea rezultatelor

Cromatografierea pe hârtie se execută conform tehnicii prezentate anterior. Pentru

identificarea precisă a aminoacidului eluat se execută,
execut în acelaşi şi timp, cromatografierea unor
soluţiiii etalon din respectivii aminoacizi şi se determină valorile Rf corespunzătoare.
corespunză Se compară
valorile Rf ale aminoacizilor din fracţii
frac cu aceste valori. Fracţiileiile care conţin
con aminoacizii se
păstrează.

B. Separarea proteinelor prin gel-filtrare

gel

Principiu

După cum s-a a prezentat anterior, separarea componentelor unui amestec prin
cromatografie de gel-filtrare
filtrare se bazează
bazeaz pe forma şii dimensiunile diferite ale moleculelor din
amestec. Gelurile utilizate pentru separare au particulele cu dimensiuni şşi porozităţi diferite, în
funcţie de mărimea
rimea particulelor de separat.

În procesul de fracţionare
ţionare a proteinelor poate interveni şi precipitarea frac
fracţionată cu
sulfat de amoniu. Fracţiile
ţiile proteice separate vor conţine
con ine o cantitate mai mare sau mai mică
mic de
sulfat de amoniu, substanţă ţă ce ar putea deranja în procesele ulterioare de purificare, sau la
utilizarea proteinei separate. Îndep
Îndepărtarea
rtarea unor particule de dimensiunea ionilor sulfat şi amoniu
se poate realiza prin dializă (caz în care volumul soluţiei creşte destul de mult) sau prin
cromatografie de gel filtrare. Acest ultim procedeu are avantajul că nu măreşte prea mult
volumul soluţiei proteice; timpul de separare este mult mai scurt; se realizează şi o purificare
suplimentară a proteinei, etc.

Prezenţa proteinelor în probele eluate de pe coloana cromatografică se poate pune în

evidenţă prin spectrofotometrare la 280 nm, iar a ionului amoniu cu reactiv Nessler cu care
formează un compus intens colorat galben-portocaliu. Moleculele proteice, având dimensiuni
mari, vor fi eluate de pe gel înaintea ionilor amoniu şi sulfat care, având dimensiuni foarte mici,
sunt reţinuţi în porii gelului şi întârziaţi la eluare.

Reactivi

1. Soluţie de albumină 5 mg % cu 1% sulfat de amoniu;

2. Tampon fosfat 0,01M, pH 7,0;
Soluţii: A. 1,38 g fosfat monobazic (NaH2PO4.H2O) se dizolvă în 1000 mililitri apă
distilată - se obţine o soluţie 0,01M;

B. 1,4195 g fosfat bibazic (Na2HPO4) se dizolvă în 1000 mililitri apă distilată – se

obţine o soluţie 0,01M;

Pentru a obţine o soluţie tampon 0,01M, pH 7,0 se amestecă 39,0 mililitri sol. A cu 61,0
mililitri sol. B;

3. Sephadex G 25 coarse activat şi tamponat cu tamponul fosfat 0,01M, pH 7,0;

4. Reactiv Nessler – într-o cantitate mică de apă se dizolvă 50 grame KI; se adaugă o soluţie
saturată de HgCl2 până la formarea unui precipitat. Se adaugă 200 mililitri soluţie NaOH 5 N şi
se diluează la 1000 mililitri. Se lasă să se depună şi se separă lichidul limpede. Reactivul este
folosit pentru identificarea şi determinarea amoniacului.

Materiale şi aparatură

• spectrofotometru UV-VIS;
• coloană cromatografică 1x5 centimetri;
• stativ;
• cleme;
• pâlnie de picurare;
• eprubete 10x100 mm, marcate la volumul de 2 mililitri;
• pipete de un mililitru;
• micropipetă.

Mod de lucru
 Se fixează coloana cromatografică pe stativ în poziţie perfect verticală. Se umple
coloana cromatografică cu 5 mililitri gel suspendat în tampon fosfat. Se tratează gelul cu
4-5 mililitri tampon pentru stabilizarea gelului. Se scurge tamponul până la nivelul gelului. Se
aplică pe coloană cu micropipeta 50 microlitri soluţie proteică. Se lasă să pătrundă în gel. Se
spală suprafaţa gelului de 2 ori cu câte 0,5 mililitri tampon. Se lasă să pătrundă în gel. Se
eluează coloana cu tampon fosfat. Din momentul aplicării probei se culeg la baza coloanei
fracţii de efluent de câte 2 mililitri în eprubete în care a fost introdusă în prealabil câte o picătură
de reactiv Nessler.

Se colectează probe până la apariţia coloraţiei galbene, care indică începerea eluării
ionului amoniu. Probele colectate se spectrofotometrează la 280 nm pentru a determina
prezenţa proteinelor.

După apariţia coloraţiei galbene se continuă spălarea coloanei cu tampon, eluatul

colectându-se într-un vas oarecare. Spălarea se continuă până la reacţie negativă cu reactivul
Nessler. În acest moment coloana a fost complet spălată de toate componentele supuse
separării.

Interpretarea rezultatelor

Se măsoară absorbţia probelor, în ordinea colectării lor, la 280 nm. Având în vedere că
fiecare probă colectată are 2 mililitri, se construieşte un grafic, reprezentând absorbţia de
radiaţie în funcţie de volumul de eluţie. Proba care prezintă absorbţia maximă conţine
concentraţia maximă de proteină, liberă de sulfat de amoniu.