LP. 7.

Determinarea glutenului din alimente

Sub denumirea de gluten este cunoscută familia de proteine ce se găsesc în grȃu, secară, orz și ȋn
cantitate mai mică, în ovăz. Drept urmare, glutenul se găsește în pâine, bere, paste făinoase, produse de
patiserie, cerealele pentru micul dejun, dar şi în multe alte produse: mezeluri, sosuri pentru salată gata
preparate, sos de soia, supe.
Ȋn 1907, Osborne a prezentat categoriile de proteine existente în cereale, pe care le-a clasificat ȋn
prolamine, gluteline, albumine și globuline.

Structura chimică a glutenului

Glutenul cuprinde un amestec complex de proteine de tip prolamine (cunoscute sub denumirea de
gliadine ȋn grȃu) și de tip gluteline (cunoscute sub denumirea de glutenine ȋn grȃu).
Din punct de vedere al solubilității lor în soluțiile alcoolice, aceastea se pot clasifica astfel:
 prolaminele sunt componentele solubile în soluțiile alcoolice;
 gluteninele sunt insolubile în soluțiile alcoolice;
Ambele fracții conțin component proteice numeroase, caracterizate de un conținut ridicat în glutamină și
prolină.
A. Prolaminele sunt în principal proteine monomerice cu mase moleculare de aproximativ 28.000-
55.000 kDa care se subclasifică în funcție de structura lor primară în 4 subtipuri:
o alfa-gliadine(prolamine);
o beta- gliadine(prolamine);
o gamma-gliadine(prolamine);
o omega-gliadine (prolamine).
Toate prolaminele se pot grupa în trei categorii principale:
-cele cu conținut bogat în sulf(S-rich)
-cele cu conținut scăzut în grupări de sulf(S-poor)
-prolaminele cu masă moleculară mare (HMW). (Fig.1)

Figura 1. Structura familei prolaminelor din componența glutenului

1
 Polipeptidele din aceste grupuri conțin câteva regiuni structurale similare:
- o regiune de peptide pentru translocarea în compartimentele celulare;
-o regiune N- terminală non-repetitivă;
-o regiune C terminală non- repetitivă;
-o regiune centrală lungă repetitivă;
Regiunile centrale conțin secvențe bogate în glutamină și prolină specifice fiecărui grup în parte.(Fig. 2)

Figura2. Structura prolaminelor din componența glutenului

B. Gluteline cuprind proteine legate intercatenar prin punți disulfidice. După reducerea punților
disulfidice, subunitățile de glutenină ce rezultă, vor avea o solubilitate asemănătoare cu cea a
prolaminelor în soluțiile alcoolice. Din punct de vedere al structurii lor primare, subunitățile de
glutenina au fost divizate in subunități cu masă moleculară mare(HMW) și subunități cu masă
molecular mică(LMW).

Patogeneza intoleranței la gluten

Peptidele glutenului implicate în patogeneza bolii celiace,pot fi divizate în două categorii:

-peptide toxice;
-peptide imunogenice.
Peptidele toxice determină apariția leziunilor la nivelul mucoasei intestinale după administrare in
vivo, în timp ce peptidele imunogenice stimulează specific celulele T imunocompetente, isolate din
sângele periferic al pacienților diagnosticați cu boala celiacă.
Astfel, peptidele glutenului diferă unele de celelalte în ceea ce privește gradul de antigenitate. Cel
mai puternic răspuns antigenic este dat de fragmentul de 33 de aminoacizi situate la capătul N-terminal al

2
alfa-gliadinei. În urma procesului de digestie, alfa-gliadina se fragmentează în 2 fragmente: 25-mer (p31-
43) și 33-mer(p57-89).Peptidul 25-mer al alfa-gliadinei induce direct producția Il-15 de la nivelul
enterocitelor și a celulelor dendritice. Peptidul 33-mer activează celulele T-imunocompetente care vor
determina creșterea producției de interferon-gamma ce rezultă în apariția efectului citotoxic de la nivelul
mucoasei intestinale.
Așadar potențialul antigenic cel mai puternic este determinat de fragmentul 33-mer situate în
regiunea N-terminală repetitivă a alfa-gliadinei din structura glutenului. Acesta este considerat a fi
mecanismul causal implicat în patogenia bolii celiace. Fragmentul peptidic 33-mer al alpha-gliadinei
cuprinde șase regiuni de epitopi suprapuse care au potențial antigenic(Fig 3).

Figura 3.Fragmentul antigenic 33-mer din structura alfa-gliadinei

Semnificație clinica
Sensibilitatea la gluten se poate manifesta sub mai multe forme:
 Alergia la gluten apare atunci cȃnd sistemul imun al unui individ este sensibilizat la proteinele
din gluten. Această patologie este mai comună la copii. Odată cu ȋnaintarea ȋn vȃrstă, ȋnsă,
majoritatea copiilor se vindecă. Simptomele alergiei la gluten pot include greață, vărsături, diaree,
iritații ale pielii, congestie nazală, prurit ocular, dispnee sau chiar șoc anafilactic, ȋn cazurile
grave. Aceste simptome se manifestă, de obicei, la cȃteva minute după consumul de gluten.
Diagnosticul se stabilește pe baza testelor cutanate (skin-prick tests) care confirmă glutenul ca
alergen. Tratamentul constă ȋn evitarea alimentelor care conțin gluten, precum și administrarea de
adrenalină, ȋn reacțiile severe.
 Boala celiacă este o patologie intestinală cronică, mediată imun, ȋn care organismul devine
intolerant la gliadină, componentă a glutenului.Indivizii cu boală celiacă prezintă intoleranță pe
toată durata vieții la grȃu, secară, orz și ovăz. Gliadinele determină la indivizii susceptibili
genetic, o enteropatie autoimună cu atrofia vilozităților intestinale, datorită unor secvențe
specifice de aminoacizi din structura acestora.Boala celiacă afectează 1-2% din populația
generală și se poate asocia cu alte boli autoimune (diabet zaharat tip 1, tiroidită autoimună,
vitiligo, psoriazis, hepatită autoimună, dermatită herpetiformă etc.). Boala celiacă poate fi
asimptomatică sau se caracterizează prin simptome gastrointestinale (diaree cronică, meteorism
abdominal, inapetență, malabsorbție, deficit de fier) sau non-gastrointestinale (poate afecta
practic orice alt organ).Diagnosticul se stabileşte coroborând manifestările clinice cu analizele de
laborator (anticorpi anti-transglutaminază, anti-endomisium, anti-gliadină, anti-peptide gliadinice
deamidate) şi examenul histopatologic al biopsiei intestinale obţinută prin endoscopie digestivă
superioară. Singurul tratament disponibil pentru boala celiacă este o dietă strictă fără gluten.

3
  Intoleranța la gluten sau sensibilitatea la gluten non-celiacă se caracterizează prin simptome
similare bolii celiace (fatigabilitate cronică, meteorism abdominal, dureri abdominale, diaree,
dureri articulare, migrene), ȋnsă fără prezența modificărilor patologice de la nivelul intestinului
subțire și fără asocierea anticorpilor ȋn sȃnge. Ca și ȋn boala celiacă singura terapie care
ameliorează simptomele este o dietă fără gluten.

Aplicație practică

Determinarea glutenului din produse alimentare cu ajutorul testelor rapideAgraStrip® Gluten 12

Principiu

Principiul determinării are la bază reacția de aglutinare a glutenului pe suprafața bandeletei

reactive cu apariția unei modificări de culoare (roșu). Examenul se realizează cu ajutorul unor bandelete
reactive (strip-uri) care determină in mod calitativ (de la 5 ppm) glutenul din produsul alimentar testat.
Acest test are la bază o metodă de determinare imunometrică (de tip sandwich). Pe suprafața strip-ului
sunt fixați atȃt anticorpi monoclonali anti-gliadină, cȃt și anticorpi anti-gliadină marcați cu o enzimă care
va determina o modificare de culoare. Antigenul (gliadina) va reacționa simultan cu cei 2 anticorpi și,
ulterior, se va produce reacția de culoare. Modificărilevor fi comparate cu scara etalon, livrată odată cu
testul.
Anticorpul G12 care se utilizează în cadrul acestui test interactioneaza cu secventa peptidica
QPQLPY din fragmentul 33-mer al alfa-gliadinei prezente in gluten. Fragmentul 33-mer are o rezistență
ridicată la acțiunea enzimelor digestive fiind o moleculă potrivită pentru determinarea analitică calitativă
(Fig 4).

Figura 4.Situsul de legarea anticorpului G12 la nivelul fragmentului 33-mer

4
 Se măsoară 0,2g din
materialul de analizat și se
adaugă în tubul de
extracție împreună cu
soluția de extracție.
Se omogenizeazăames- Se amestecă 3 picături
tecul de reacție. din mixul de extracție
cu soluția de diluție.

Se transferă în tubul Se introduce stripul și Se citește rezultatul

de diluție si se se asteaptă ca lichidul de pe strip după 10
amestecă. să ajungă la linia min.
indicatoare.

Reactivișimateriale
 Bandeleta reactivă
 Solutie pentru extractie a glutenului
 Solutie pentru dilutie
 Eprubeta cu capac pentru extractie
 Eprubeta cu capac pentru dilutie
 Produs de patiserie

Mod de lucru
1. Se omogenizează proba de testat folosind un aparat de omogenizat de tip blender.
2. Se măsoară 0.2g dincantitatea de omogenizat.
3. Se adaugă proba măsurată ȋn tubul pentru extracție.
4. Se adaugă soluția pentru extractie pȃnă la nivelul indicat.
5. Se ȋnchide tubul și se agita energic manual timp de 1 minut.
6. Se deschide tubul si se ataseaza capacul cu pipeta.
7. Se transferă 3 picaturi (100 μL) din supernatantul din tubul de extracție ȋneprubeta pentru diluție.
8. Se adaugăsoluție de diluție (eticheta roșie) ȋn tubul de diluție pȃnă la linia de demarcație
de20ppm.

5
 9. Se ȋnchide tubul de diluție și se agită energic timp de 15 secunde.
10. Se imersează bandeleta reactivă ȋn epubeta de diluție (pȃnă la fundul eprubetei) cu săgețile
ȋndreptate ȋn jos timp de 45 secunde (sau pȃnă lichidul ajunge la linia indicată pe bandeletă).
11. Se scoate bandeleta reactivă și se pune ȋn poziție verticalăȋn sistemul de susținere timp de 10
minute pentru uscare.
12. Se compară zonele C și T de pe bandeletă cu cele corespunzătoare de pe o bandeletă etalon astfel:
 rezultat negativ: o singura linie albastra in dreptul controlului (C)
 rezultat pozitiv: o linie albastra in dreptul C si o linie rosie (indiferent de intensitate) in
dreptultestului (T).

CitireaRezultatelor:

Aplicație clinică
Testul AgraStrip® Gluten 12 detectează prezența glutenului din grȃu, secară și orz de la concentrații de5
ppm (părți per milion).Conform FDA produsele gluten-free conțin gluten sub 20 ppm (0.002% sau 20mg
gluten/kg produs). Cu ajutorul acestui test simplu și rapid, pacienții cu alergie la gluten, intoleranță la
gluten sau boală celiacă, pot testa diverse produse alimentare ȋn vederea prezenței sau absenței glutenului,
pentru a putea fi consumate ȋn siguranță fără apariția simptomelor asociate.

Link film demonstrative pentru determinarea glutenului din produse alimentare cu ajutorul
testelor rapideAgraStrip® Gluten 12

https://www.youtube.com/watch?v=MIHCzGkHG14