L12. Enzime. Testul optic.

Metode de determinare a enzimelor in lichidele

biologice
Spectrofotometria este o metodă analitică ce măsoară modificarea proprietăților optice
ale substanței analizate (absorbanța).
Absorbanța și transmitanța sunt parametri utilizați în analiza spectrofotometrică. Acești
parametri se referă la cantitatea de radiație electromagnetică transmisă printr-o soluție.
Transmitanța unei soluții reprezintă cantitatea de radiație transmisă și se calculează ca
raport între intensitatea radiației transmise și intensitatea radiației incidente. Absorbanța unei
soluții reprezintă cantitatea de radiație absorbită. Un alt termen folosit este extincția (E). Valoarea
absorbanței este în legătură cu transmitanța și cu intensitatea radiației transmise, respectiv
incidente prin următoarea relație:

Io
A = log
It

Absorbanța unei soluții este direct proporțională cu grosimea stratului absorbant și cu

concentrația.

A=ε·C· b

A = absorbanța (extincția) soluției;

Ɛ = coeficientul molar de extincție;
C = concentrația soluției;
b = grosimea stratului absorbant.

Determinarea activităţii enzimelor serice/plasmatice constituie una dintre cele mai

solicitate investigaţii în laboratorul clinic. Aprecierea activităţii enzimatice are o deosebită
importanţă pentru diagnosticul, urmărirea evoluţiei, tratamentului şi prognosticului bolilor.
Pentru interpretarea corectă a rezultatelor obţinute la determinările activităţii enzimatice
este necesar să se cunoască locul de producere al enzimelor studiate, mecanismele prin care ele
ajung în sânge, cât şi modul şi viteza cu care ele sunt eliminate din plasmă.
Prin determinările enzimatice poate fi apreciat sediul unor leziuni sau funcţionalitatea unui
organ. După ce sunt eliminate în sânge, activitatea enzimelor începe să scadă. Cunoaşterea
intervalului în care enzimele încep să se modifice, în sensul scăderii lor, are o importanţă
deosebită pentru diagnostic dar şi pentru recoltarea probelor de sânge.
Exemplu: în IMA (infarct miocardic acut), CK (creatin kinaza) începe să crească după 4-8
ore şi apoi scade revenind la normal în 3-6 zile. LDH (lactat dehidrogenaza) pătrunde mai lent în
torentul circulator şi începe să crească semnificativ după 8-12 ore, valorile ei începând să scadă
după 10-15 zile.
O importanţă deosebită o are şi cunoaşterea căilor de eliminare a enzimelor. Acest fapt
permite punerea unui diagnostic după un interval de timp mai larg de la debutul bolii şi chiar
aprecierea retrospectivă a debutului afecţiunii. Exemplu: α-amilaza este îndepărtată din sânge pe

1
cale urinară (are greutate moleculară scăzută), deci după un anumit interval de timp de la debutul
unei pancreatite acute, amilazuria poate fi un indicator de bază al acestei boli.
Cel mai frecvent, activitatea enzimatică se exprima în unităţi internaţionale (UI).

1 UI = cantitatea de enzimă ce transformă 1 µmol de substrat / minut la 25°C, în

condiţii optime (concentraţia substratului, pH, forţa ionică a tamponului). În determinările pe
produse biologice (ser, urină) exprimarea se raportează la un litru.

Cofactori enzimatici
Enzimele = biocatalizatori organici cu specificitate mare.
• holoenzime (structură strict proteică)
• heteroenzime = parte proteică (apoenzimă) + parte neproteică (cofactor enzimatic,
fără care enzima nu prezintă activitate).
Cofactorii enzimatici:
• ioni metalici (Cu2+, Fe2+, Fe3+, Mg2+, Mo2+, K+, Zn2+) → intervin direct în procesul de
cataliză.
• coenzime → structură organică, neproteică. Majoritatea sunt vitamine (acidul
ascorbic) sau derivate de vitamine (NAD+, NADP+, coenzima A, tetrahidrofolatul) sau
de la alţi compuşi (ATP, ADP, GTP, tetrahidrobiopterina). Sunt legate slab de
apoenzimă şi pot fi mobilizate uşor. Se mai numesc şi al doilea substrat sau cosubstrat.
• grupări prostetice → structură organică, neproteică. Sunt legate covalent de partea
proteică a enzimei. Regenerarea lor se face in situ. Majoritatea sunt vitamine (biotina)
sau derivate de vitamine (FMN, FAD, dezoxiadenozil-cobalamina, metil-cobalamina,
piridoxal-fosfat) sau de la alţi compuşi (acidul lipoic).
!!! Cofactorii derivaţi de la niacină (NAD+, NADP+ şi formele lor reduse NADH,
respectiv NADPH) se utilizează efectiv la determinarea activităţii enzimatic datorită
proprietăţilor lor.
Determinarea activităţii enzimatice
În practica de laborator se utilizează 2 metode:
Metodele în două puncte
Se utilizează un martor (cu enzima inactivată) şi o probă cu enzima activă. După un timp
fix de incubare se inactivează şi enzima din probă şi activitatea se apreciază prin diferenţa
dintre probă şi martor privind concentraţia substratului sau a produsului de reacţie.
În acest mod de analiză nu se observă cinetica de transformare a substratului.
Metodele cinetice → desfăşurarea reacţiei se urmăreşte continuu, vizual sau cu aparate
înregistratoare. Determinările cinetice sunt mai simple şi mai rapide.

Testul optic → determinarea enzimelor implicate în transferul de hidrogen. Este

aplicabil în cazul enzimelor care au cofactor un derivat de niacină (NAD(P)+ sau NAD(P)H).
În principiu, se măsoară direct oxidarea NAD(P)H sau reducerea NAD(P)+.
XH 2 + NAD + X + NADH + H +
2
 Acest lucru este posibil deoarece în spectrul de absorbţie al celor două forme, redusă şi
oxidată, există o diferenţă: NADH absoarbe puternic în domeniul 300 – 370 nm, pe când NAD+
absoarbe foarte puţin (figura 1). De obicei se lucrează la 340 nm sau la 366 nm. Raportul molar
Substrat:NADH = 1:1, astfel încât atunci când se cuantifică cantitatea de NADH consumat în
reacție se măsoară cantitatea de substrat transformat, astfel încât este posibil calculul activității
enzimatice.

Figura 1. Spectrul de absorbţie al NAD+ şi NADH

Exemplu:
Calculul cantității de NADH transformat pe baza coeficientului molar de extincție (Ɛ)
pentru o soluție de NADH de concentrație 1M:

1 mol/l NADH ..........A= 6220

x mol/l NADH ..........∆A/min = 0,1033
x= 16,61 µmol/l → 16,61 µmoli substrat (piruvat) → Activitatea = 16,61 UI.
Prin test optic se înţelege determinarea în UV a activităţii enzimelor NAD+ şi NADP+
dependente. Se practică trei variante de utilizare a testului optic, prin aceasta existând
posibilitatea determinării aproape a tuturor enzimelor cu semnificaţie în laboratorul clinic.

Variantele tehnice ale testului optic

a. Testul optic simplu – dacă enzima pe care o determinăm necesită prezenţa de
NAD+ sau NADH, reacţia se efectuează între substrat, enzimă (prezentă în ser), coenzimă şi
se urmăreşte variaţia absorbţiei la λ=340 nm pe un interval de timp stabilit. Exemple:
- determinarea lactat dehidrogenazei în ser – enzima LDH-NAD+-dependentă
catalizează reacţia:
pH=7.5
piruvat + NADH + H+ lactat +NAD+
pH=9.0

3
 Enzima este prezentă în toate celulele, are activitate mare şi se determină aproape exclusiv
prin testul optic.

b. Testul optic cuplat cu o reacţie indicatoare – anumite enzime nu implică direct

coenzima NAD(P)+, totuşi se pot determina pe baza principiului testului optic cuplat cu o reacţie
indicatoare specifică. Enzima de determinat catalizează formarea unui produs, iar acesta
urmează să fie determinat prin intermediul unei alte enzime NAD+-dependente.
- Determinarea glutamat-piruvat transaminazei (GPT) – enzima este prezentă în ficat.
Determinarea constă în două etape:
- etapa I - enzima de măsurat - GPT, catalizează reacţia:
L-alanină + acid α -cetoglutaric acid piruvic + acid glutamic
Piruvatul rezultat (activitatea directă a GPT) constituie substratul pentru a doua reacţie,
NAD+-dependentă.
- etapa a II-a - reacţia indicatoare (prin LDH):
piruvat + NADH + H + lactat + NAD+
Fiecare moleculă de piruvat va oxida NADH trecându-l în NAD+ odată cu formarea de
lactat. Reacţia se realizează în cuva spectrofotometrului în care se introduce tampon, LDH, L-
alanină şi ser (sursa de enzimă-GPT). După adăugarea coenzimei reduse, NADH, absorbţia creşte
rapid, urmează stabilizarea absorbţiei (aproximativ un minut), după care se declanşează reacţia
prin adăugarea α-cetoglutaratului. Urmează diminuarea absorbţiei la λ=340 nm. Deoarece
concentraţia NADH-ului este direct proporţională cu concentraţia substratelor enzimei urmărite
(GPT), variaţia absorbţiei este direct proporţională cu activitatea enzimei. Determinarea GPT în
ser este un indicator fidel al stării funcţionale hepatice.
- Determinarea glutamat-oxalacetat transaminazei (GOT) – enzima este prezentă în
ficat şi miocard:
- etapa I – enzima de determinat GOT care catalizează reacţia:
L-aspartat + acid α-cetoglutaric acid oxalacetic + acid glutamic
- etapa a II-a – reacţia indicatoare prin enzima malat dehidrogenază NAD+- dependentă:
oxalacetat + NADH+ H+ malat + NAD+
Concentraţia serică a enzimei GOT este un indicator pentru integritatea funcţiei hepatice şi
a celei miocardice.
c. Testul optic cuplat cu o reacţie auxiliară şi o reacţie indicatoare – în cazul în care
produsul final al reacţiei enzimatice nu poate fi măsurat direct printr-o reacţie indicatoare,
este necesar să se intercaleze o reacţie auxiliară, catalizată de un alt sistem enzimatic.
- Determinarea creatin kinazei în ser – enzima este localizată în musculatura cardiacă şi
scheletică. Reacţia care permite determinarea creatinkinazei se cuplează cu reacţia altei enzime:
piruvatkinaza (reacţie auxiliară) şi este indicată de enzima lactatdehidrogenaza (reacţie
indicatoare).
- etapa I – enzima de determinat, creatinkinaza:
creatină + ATP creatin-P + ADP

4
 - etapa a II-a – enzima auxiliară, piruvatkinaza:
fosfoenolpiruvat + ADP piruvat + ATP
+
- etapa a III-a – enzima indicatoare LDH – NAD - dependentă:
piruvat + NADH + H+ lactat + NAD+

Pentru a avea o proporţionalitate directă între viteza de dispariţie a creatinei şi formarea

NAD+-ului, reactanţii se adaugă în exces.
În determinările bazate pe variantele b şi c intervin sisteme enzimatice care acţionează
unul după celălalt:
k1 k2
S P1 P2

În această situaţie activitatea sistemului indicator trebuie să fie mult mai mare decât a
celui de măsurat, adică toţi componenţii săi trebuie să fie în exces. Practic, în cazul folosirii unei
reacţii indicatoare, sistemul cuplat trebuie să aibă o activitate de 100 de ori mai mare, iar în cazul
cuplării şi a unei reacţii auxiliare sistemul indicator trebuie să aibă o activitate de 1000 de ori mai
mare.

Calculul activităţii enzimatice

În metodele cinetice se stabileşte absorbţia la diferite intervale de timp şi se calculează
variaţia ei pe minut. Apoi se foloseşte formula:
∆E/min V
UI = ⋅ 10 6 ⋅ F
ε⋅d VA µmoli⋅min-1⋅l-1
∆E/min = variaţia absorbţiei probei pe minut
VA = volumul materialului de analizat, în ml
VF = volumul final, în ml
d = grosimea cuvelor, în cm
ε = coeficientul molar de absorbţie al substratului ori al produsului

Tipul de calcul de la metodele cinetice se foloseşte şi în cazul testului optic.

Aplicaţie practică - Determinarea activităţii LDH serice – metoda cinetică

enzimatică (test optic simplu)
LDH este un tetramer compus din subunităţi A (numite şi M, se găsesc în muşchii
scheletici) şi subunităţi B (numite şi H, se găsesc în miocard). Diferite ţesuturi produc cantităţi
diferite din cele 2 subunităţi, care apoi se combină în mod aleator şi formează 5 tetrameri diferiţi
(izoenzime): M4, M3H1, M2H2, M1H3 şi H4. Aceste izoenzime diferă în mică măsură prin
proprietăţile lor. M4 facilitează transformarea piruvatului în lactat în muşchii scheletici, iar
izoforma H4 catalizează conversia lactatului în piruvat în miocard.

Principiu
LDH din ser catalizează reacţia reversibilă de transformare a piruvatului în lactat.
Piruvat + NADH+H+ ↔ lactat + NAD+
5
 La pH 7,5 are loc conversia piruvatului în lactat cu oxidarea concomitentă a NADH+H+ la
NAD . Rata de scădere a NADH+H+ este măsurată spectrofotometric la 340 nm şi este direct
+

proportională cu activitatea LDH seric.

Reactivi si materiale necesare
1. Reactiv de lucru (conţine tampon Tris cu pH=7,5; NaCl, piruvat, NADH+H+);
2. Ser (conţine LDH);
3. Spectrofotometru UV-VIS;
4. Cuve pentru spectrofotometru;
5. Pipete automate 100–1000 µl si 20–200 µl.
Modul de lucru
Se setează la spectrofotometru lungimea de undă de 340 nm. Se realizează ajustarea la
zero a aparatului faţă de aer sau apă distilată. Lângă aparat, în cuvă se pipetează:
• Reactiv de lucru 1000 µl
• Ser 20 µl
Se omogenizează rapid cu pipeta automată, se introduce cuva în spectrofotometru, se
citeşte şi se notează absorbanţa iniţială A0. Se lasă cuva pe loc în spectrofotometru şi se repetă
citirea absorbanţei la exact 1, 2 şi 3 minute. Se notează aceste trei citiri cu A1, A2 şi A3. Se
observă că absorbţia de radiaţie la 340 nm scade.
Modul de calcul a activităţii enzimatice a LDH în ser
Se calculează variația absorbției de radiație/minut (∆A/min) si se multiplică cu un factor
de 4127. Acest factor a fost calculat pe baza coeficientului molar de extincție al enzimei, grosimii
cuvei de reacție, volumului final de reacție și al volumului de ser supus analizei.
∆A/min = [(A0 – A1) + (A1 – A2) + (A2 – A3)]/3
Activitatea LDH în ser exprimată în UI/L:

∆E/min V
UI = ⋅ 10 6 ⋅ F
ε⋅d VA

ALDH= ∆A/min x 4127

Interval biologic de referință pentru activitatea LDH în serul uman:
Adulți = 135 – 225 U/L.

Activitatea LDH în ser crește în: infarct miocardic (activitatea LDH crește 36-55 ore de la
debut), afecțiuni hepatice (ciroză, alcoolism, hepatită acută virală), tumori solide, leucemii,
limfoame, afecțiuni musculare (distrofii, traumatisme), anemii megaloblastice și hemolitice,
hipoxie.
6