REFERAT BIBLIOGRAFIC

Metabolismul protidic: determinarea proteinelor totale din lichidele biologice la ecvine

Disciplina: Biochimie i Biologie Molecular An II, Sem. I, MV, 2012-2013

Cuprins

Proteinele totale. Generaliti Proteine din urin Determinarea proteinelor totale din ser

pag. 3 pag. 4 pag. 5

Concentraiile serice de proteine din caii sntoi clinic determinate prin electroforez n gel de agaroz pag. 8 Determinarea proteinelor din snge Concluzie pag. 9 pag. 12

1.1 Proteinele totale. Generaliti

Proteinele totale reprezint cantitatea global a proteinelor sanguine exprimate n grame, din 100 ml ser sanguin.

Proteinele sunt substane organice complexe ale materiei vii, fiind alctuite din carbon, hidrogen, oxigen i azot, care se combin pentru a da natere lanurilor de ami noacizi. Ele sunt necesare pentru creterea organismului, pentru refacerea celulelor uzate, precum i pentru producerea de energie caloric. Majoritatea proteinelor din organismul viu provin din alimente, fie de origine animal (carne, lapte, brnza, ou), fie de origine vegetal (fasole, mazre, soia, linte etc.). Analiza proteinelor se face din serul sanguin. Exist mai multe feluri de analize care exploreaz diferite componente ale proteinelor, astfel: electroforeza, teste hepatice etc. Spre deosebire de carbohidrai i grsimi, proteinele nu sunt depozitate in organism. Ele sunt mereu metabolizate i transformate n aminoacizi care sunt folosii la formarea de noi proteine, hormoni, enzime si ali compui necesari organismului. Testul pentru proteine totale se efectueaz pentru a msura cantitatea total de proteine din snge. De asemenea, cu ajutorul acestui test, se mai msoar i cantitile a dou grupe majore de proteine din snge: albumina i globulina. Albumina este o protein din snge produs de ficat care reprezint aproximativ 60% din proteinele plasmei sangvine. Ea este esenial pentru meninerea presiunii osmotice necesar distribuiei normale a lichidelor corpului, ntre esuturi i vase. Albumina ajut i la transportul medicamentelor sau a altor substane i mai este important pentru dezvoltarea esuturilor i procesul vindecare. Globulina este alctuit din 3 proteine diferite numite alfa, beta i gama. Anumite globuline sunt produse de ficat iar altele de sistemul imunitar. Unele dintre ele formeaz legturi cu hemoglobina iar altele transport metale (cum ar fi fierul) n snge i lupt impotriva infeciilor. Acest test al proteinelor totale arat separat valorile pentru proteine totale, albumin i globulin. De ce se face testul? Testul pentru msurarea albuminei se efectueaz pentru: - verificarea strii de funcionare a rinichilor; - verificarea cantitii de proteine care provine din dieta alimentar; - identificarea cauzelor inflamrii gleznelor sau abdomenului, acumularea de lichid n plmni. Testul pentru msurarea globulinei se efectueaz pentru: - estimarea anselor de a avea o infecie; - identificarea unor boli rare de snge. Rezultate Nivelul ridicat de albumin din snge poate fi cauzat de deshidratare. Nivelul ridicat de globulin din snge poate fi cauzat de: - boli ale sngelui (anemie hemolitic, leucemie i altele) - boli autoimune (sarcoidoza, artrit reumatoid, lupus); - afeciuni renale;
3

- afeciuni hepatice; - tuberculoza. Nivelul sczut de albumin din snge poate fi cauzat de: - arsuri grave; - afeciuni renale; - afeciuni hepatice; - diabet netratat; - hipotiroidism; - insuficien cardiac. Ce poate afecta testul? Motivele pentru care rezultatele testului nu sunt concludente includ: - administrarea de hormoni ca estrogeni, corticosteroizi, androgeni, insulin, hormoni de cretere; - prezena de infecii sau rni grave; - repaus pe o perioad lung de timp; - boala cronic; - sarcin.

1.2 Proteine din urin

Nivelul de proteine n urin este msurat folosind un eantion aleatoriu de urin i/sau prin utilizarea unui eantion de urin de 24 de ore. Testul de urin este de asemenea cunoscut sub numele de test dipstick". Detectarea unei proteine ca albumina n urin indic n principal probleme renale. Acest test este cunoscut sub numele de "proteinurie" sau "albuminurie" sau "albumina in urin". Albumina este prezent n abunden n snge. Proteinele, sunt necesare pentru a consolida funciile celulare, muchii, oasele, prul i unghiile. Proteinele ajut la ntrirea sistemului imunitar i la prevenirea bolilor. Pierderea acestora prin urin poate duce la diferite complicaii de sntate.

fig. 1

1.2.1 Cum sunt transportate i cum se reduce nivelul de proteine in urin? Nivelul normal de proteine in urin valorile normale de proteine pentru un eantion aleatoriu de urin: aproximativ 0-8 mg/dL. n mod normal, un test de rutin dipstick" nu va arta niciun nivel de proteine n urin. Rinichii ajut la separarea substanelor nefolositoare din snge i lichid interstiial. Ei sunt parte a sistemului excretor i joac un rol vital n producerea urinei prin filtrarea substanelor toxice pentru organism. Moleculele proteice sunt relativ mai mari i nu pot trece rapid prin filtrele sau glomerulii rinichilor. Astfel, acetia menin proteinele n snge, deoarece sunt necesare pentru organism. Micile cantiti de proteine care trec prin glomeruli sunt n mod normal reabsorbite i utilizate pentru a genera energie. Prezena proteinelor n urin indic disfuncii ale rinichilor. Uneori, n cazul n care exist un nivel foarte ridicat de proteine n snge, acestea pot fi prezente n urin n ciuda funcionrii normale a rinichilor. Deci, mpreun cu proteinele din urin sunt msurate i proteinele din snge.

1.3 Determinarea proteinelor totale din ser

Scderea proteinelor sanguine se ntlnete n diferite boli. Astfel, cnd ficatul care este laboratorul ce fabric proteinele, se imbolnvete, scade i concentraia proteinelor din snge. La fel se ntmpl cnd organismul pierde proteinele prin hemoragii sau prin urin (albuminurie). Vrsturile, care mpiedic alimentaia normal, bolile de stomac, intestin i pancreas care perturb digerarea proteinelor, diareea, reprezint numai o parte din cauzele care scad concentraia sanguin de proteine. De asemenea, efortul fizic intens, stresul nervos, precum i bolile care produc febr prin consumul crescut de proteine, contribuie la scderea acestora. Scznd proteinele din snge, organismul caut s le nlocuiasc apelnd la proteinele din organele sale i mai ales din muchi, fapt ce duce la slbirea i la scderea n greutate a corpului. Deoarece proteinele sanguine au capacitatea de a reine ap n vase, prin scderea lor, apa trece in esuturile corpului (maini, picioare etc.) producnd,edeme. Mai rar, proteinele sanguine pot s aib valori crescute, ca n unele boli genetice i parazitare sau n hipertensiune arterial.

1.3.1 Electroforeza serului

DEFINIIE I CARACTERISTICI: Electroforeza este o metod de separare a fraciunilor proteice din serul sanguin i evaluarea concentraiei componentelor prin metoda fotometric. Proteinele totale din ser sunt descompuse n 5 categorii de substane numite fraciuni proteinice: albumin, alfa 1, alfa 2, beta i gama. Grupul beta poate fi mprit n beta 1 i beta 2. Albumina, care este produs n ficat, reprezint aproape 60% din proteinele din snge, iar globulinele reprezentnd restul de 40%.
5

n afara imunoglobulinelor i a ctorva proteine complementare, majoritatea globulinelor sunt produse n ficat. CE INDIC: Analiza electroforezei este utilizat pentru a indentifica prezena sau absena proteinelor anormale, a proteinelor monoclonale, producerea excesiv a imunoglobulinei specifice i pentru a determina cnd diferitele grupe de proteine au valorile crescute sau sczute n ser. Electroforeza proteinelor se msoar pentru a ajuta la determinarea, diagnosticul i monitorizarea cursului i tratamentului unor afeciuni asociate cu proteinele anormale. Proteinele, n mod normal, sunt metabolizate, iar cnd se prezint n cantiti prea mari in urin poate indica existena unor probleme renale i/sau producerea anormal de proteine. CND SE EFECTUEAZ: Electroforeza proteinelor se poate testa cnd medicul investigheaz simptome ce sugereaz prezena mielomei multiple: dureri de oase, anemie, oboseal, fracturi inexplicabile i infecii recurente, precum i pentru a monitoriza cauza unei bolii i eficacitatea tratamentului. Electroforeza proteinei serice se poate testa cnd simptomele indic o afeciune inflamatorie, o boal autoimun, o infecie acut sau cronic, o dereglare a rinichilor sau a ficatului sau pierderi de proteine. REZULTATELE: Analiza electoforezei proteice i cu imunofixare poate indica medicului n ce cantitate este prezent fiecare protein. Valorile electroforezei cu imunofixare se estimeaz pe baza identificrii prezenei unui anumit tip de imunoglobulin.

fig.2

Valori sczute: Scderea albuminei serice (hipoalbuminemie) survine n stri patologice variate i are semnificaii diferite (malnutriie, malabsorbie, sindrom nefrotic, neoplazii). Deficitul de alfa 1-globulina este asociat cu anumite boli pulmonare (emfizem cu debut precoce) i hepatice (hepatit neonatal). Scderea alfa 2-globulinelor se poate ntlni in pancreatite acute severe, leziuni hepatocelulare, sindroame de coagulare intravascular disemintat, anemii hemolitice, anemii megaloblastice. Nivelul seric de beta globuline scade n boli autoimune aflate n nevroz, afeciuni hepatice, neoplazii, infecii acute i cronice. Procentul de gama globuline scade n agamaglobulinemie, hipogamaglobulinemie i sindroame nefrotice. Valori crescute: Creteri ale albuminei apar in urma deshidratrilor. Creteri ale alfa 1-globulinei se nregistreaz n toate reaciile inflamatorii (de aceea mai este si numit reactant de faz acut). Creterea alfa 2-globulinei apare n infecii acute, reumatism articular acut, arterit, sindrom nefrotic, diabet zaharat, neoplazii. Nivelul seric de beta-globuline crete in anemia feripriv si ciroza biliar. Creterea gama globulinelor indic un proces imunologic cronic asociat cu afeciuni hepatice (hepatit cronic activ, ciroz), boli de colagen (LES, poliartrit reumatoid), neoplazii, leucemie mielo-monocitar cronic.

Limite i interferene n electroforeza proteinelor serice Anumie medicamente determin scderea albuminei: acid valproic, allopurinol, asparaginaza, azatioprina, clorpropamid, cisplatin, contraceptive orale, dapsona, dextran, estrogeni, fenitoin, ibuprofen, izoniazida, nitrofurantoin, prednison (doze mari), sargramostim. Tratamentul cu citostatice sau imunopresoare scade concentraia de gama globuline. Metoda folosit pentru determinarea electoforezei proteinelor serice Electroforetica (in gel agar) urmat de scanarea densitometric a fraciunilor obinute.

1.3.2 Probe hepatice

Probele hepatice sau testele de disproteinemie, sunt analize care exploreaz capacitatea ficatului de a sintetiza proteinele normale, necesare organismului. ntr-un ser cu proteine normale n prezena reactivilor cu care se fac probele hepatice, nu se produce modificri vizibile. Dar un ser cu proteine modificate, n urma unor boli, produce cu reactivii
7

respectivi o tulburare. Cu ct tulburarea este mai mare, cu att i modificrile biochimice ale proteinelor sunt mai intense. n categoria analizelor care exploreaz funcia hepatic intr reacia cu Timol, reacia Takata, Gros etc. Aceste analize devin anormale (pozitive) mai ales n bolile de ficat: hepatit acut i cronic, ciroz, colecistit. Dar ele devin pozitive i n alte boli, n care se produc fraciuni proteinice anormale: boli de rinichi, de plmni, de splin, boli de snge i tumorale. Deci nu orice prob hepatic cu valori crescute arat o boal de ficat dup cum nu indic totdeauna nici gradul de gravitate al bolii. De altfel aceste probe se pot modifica de la o lun la alta dup tratament i regim alimentar. De aceea probele hepatice se interpreteaz ntotdeauna n corelaie cu alte analize ajuttoare: proteinele totale, electroforez, etc. Serul prea gras falsific rezultatele probelor hepatice. De aceea, nu se recomand hrnirea animalelor timp de 12 ore nainte de recoltarea sngelui.

1.4 Concentraiile serice de proteine din caii sntoi clinic determinate prin electroforez n gel de agaroz
CONTEXT: Electroforeza proteinelor serice este un test util n medicina de laborator ecvin. Metoda poate furniza informaii valoroase despre modificri ale concentraiilor de albumin i de alfa-, beta- i gama- globulin i astfel ajut la caracterizarea proteinelor la pacienii ecvini. Valorile de referin pentru cai, folosind gel de agaroz ca un mediu de sprijin nu au fost raportate. OBIECTIVE: Scopul acestui studiu a fost de a stabili intervalele de referin pentru concentraiile de proteine serice la caii aduli utiliznd electroforeza n gel de agaroz i s evalueze diferenele dintre caii de traciune i caii de clrie. METODE: Probele de snge au fost obinute de la 126 de cai clinic sntoi, dintre care 21 de cai de traciune, iar 105 cai pur-snge, de la ambele sexe, cu vrsta cuprins ntre 2-20 de ani. Concentraia de proteine total a fost determinat printr-o metod de biuret automat. Electroforeza proteinelor serice a fost efectuat cu ajutorul unui sistem semi-automat de electroforez pe gel de agaroz. Datele de la caii de traciune i clrie au fost comparate folosind testul Mann-Whitney U. REZULTATE: Coeficientul de variaie a fost <5% pentru toate fraciunile proteice. Nicio diferen semnificativ nu a fost gsit ntre caii de traciune i caii de clrie i aa combinatele intervale de referin (2.5-97.5%) care au fost calculate din proteinele totale (51.0-72.0 g/L), dintre care albumine (29.6-38.5 g/L), alfa 1-globulina (1.9-3.1 g/L), alfa 2-globulina (5.3-8.7 g/L), beta 1-globulina (2.8-7.3g/L), beta 2-globulina (2.2-6.0 g L), i gama-globulina (5.8 12.7 g/L). CONCLUZIE: Utilizarea gelului de agaroz ca matricea de sprijin pentru electroforeza proteinelor serice la cai a dus la o rezoluie excelent i rezultate precise, care a facilitat standardizarea proteinelor n 6 fraciuni.
8

1.5 Determinarea proteinelor din snge

1.5.1 Determinarea proteinelor din snge prin metoda biuretului Principiul metodei Proteidele n mediu alcalin i n prezena sulfatului cupric, a tartratului de sodiu i a iodurii de potasiu formeaz un complex solubil de culoare violet (reacia biuretului), a crui concentraie se poate msura fotocolorimetric. n paralel se poate efectua o prob etalon cu albumina seric bovin. Mod de lucru Reactivi (cm3) Ser H2O distilat sau ser fiziologic Etalon Reactiv biuret

Proba 0,1 0,4 5

Martor 0,5 5

Etalon 0,5 5

Dup 30 de minute de pstrare la 250C , se msoar densitatea optic a soluiilor probei, etalonului i a martorului, la o extincie de 540 nm, folosind apa deionizat drept martor. Calculul

g/dl

Viteza de dezvoltare a culorii este rapid la nceput dar scade considerabil dup 10 minute. Dup 30 minute dezvoltarea culorii se produce n proporie de 99%. Temperatura influeneaz dezvoltarea culorii, de aceea se recomand ca reacia s fie efectuat n condi ii controlate, cel mai bine la 250C.

Valori normale Cabaline Bovine 4,7 7,0 g/dl 7,0 7,6 g/dl

Hipoproteinemia: se ntalnete frecvent n subnutriia proteic, n policarene nutriionale, parazitism (asociat cu anemia), n anemii posthemoragice acute, n hidremia afeciunilor renale cronice, n afeciuni hepatice ascitogene. Hiperproteinemia: se ntlnete n boli febrile, n cazul mieloamelor multiple, n infecii cronice. Reactivi hidroxid de sodiu 6M: se dizolva 240g NaOH in apa distilata si se aduce la 1 dm 3. Soluia se pstreaz in vas de polietilen. reactivul biuret: se dizolv 3g CuSO4 x 5H2O in 500 cm3 ap, se adaug 9g tartrat de sodiu i potasiu i 5g Kl. Apoi se adaug 100 cm3 soluie de NaOH 6M i se completeaz la 1 dm3. Se pastreaz n vas de polietilen. concentraia soluiei de etalon (albumin seric bovin): 50 mg/ml

1.5.2 Dozarea proteinelor totale prin metoda Lowry Principiul metodei Metoda se bazeaz pe reducerea reactivului fosfomolbidenowolframic (reactiv Folin-Cioclteu) de ctre tirozina si triptofanul prezent n protein. Mod de lucru Reactivi Proba Martor Etalon 0,2 Ser ml 1,8 2,0 1,8 H2O distilata ml 0,2 Etalon ml 5 5 5 Amestec A+B ml 0,5 0,5 0,5 Reactivi FolinCioclteu ml Se agit puternic. Se las la temperatura camerei exact 30 de min. Se citete extincia la 660 nm. mg protein/100 ml ser = (Ep-EM)/(ES-EM) x Cet x 100

Reactivi reactivul A: 4g NaOH pelete, 20 g carbonat de sodiu x 10 H2O. 10g tartrat dublu de sodiu si potasiu x 4 H2O, apa distilat, ad.1000 ml. reactivul B: 5 g sulfat de cupru x 5 H2O, ap distilat la 1000 ml reactivul C: 25 ml reactiv A + 0,5 reactiv B reactiv fosfomolibdenowolframic D: 100 g wolframat de sodiu dihidrat, 25 g molibdat de sodiu dihidrat, 700 ml ap distilat, 50 ml acid fosforic, 100 ml acid clorhidric concentrat. Soluia se prepar ntr-un balon cu fundul rotund de 1500 ml. Se fierbe amestecul timp de 10 ore la reflux. Se adaug apoi 150 g sulfat de litiu, 50 ml ap

10

distilat i cteva picturi de brom, pn la culoare aurie. Se rcete i se dilueaz pn la 1000 ml. Aceast soluie este aproximativ 2 N. soluie de lucru: 1 ml reactiv D. Se amestec cu 2 ml ap distilat, la folosire. soluia etalon albumin 1 mg/1 ml ser

1.5.3 Dozarea albuminei. Determinarea indirect a globulinelor serice Principiul metodei Albumina seric se cupleaz cu colorantul verde de bromcrezol (VBC), producnd o coloraie verde a crei intensitate se msoar fotometric. Absorbia complexului colorat care se formeaz este mai intens dect a colorantului liber, necuplat. Diferena dintre absorbia probei de albumin cuplat i absorbia colorantului liber este proporional cu concentraia de albumin din prob. Mod de lucru Se lucreaz pe ser nehemolizat diluat n raport 1/50 (V/V) Reactivi (ml) Eprubet prob de analizat (P) 0,5 Eprubet prob etalon (E) Eprubet prob martor (M) 0,5

Ser diluat Soluie fiziologic (NaCl 0,9%) 0,5 Soluie etalon albumin bovin 2,0 2,0 2,0 Soluie VBC Se amestec imediat. Se determin extinciile la 632 nm n decurs de 30-40 de secunde de la introducerea colorantului (VBC). Calcul g albumina/100 ml ser = (Ep-EM) x Cet/(Eet-EM) Cet = 4 g albumina/100 ml

1.5.4 Determinarea globulinemiei se detemin proteinemia n g/100 ml ser, prin reacia biuretului se scade valoarea albuminei n g/100 ml ser determinat Reactivi 1. soluie verde de bromcrezol: a) 8 g acid succinic se dizolv la cald n 600 ml ap distilat
11

b) 77 mg VBC se dizolv n 2 ml NaOH 0,5 N. Se adaug 4,4 ml Brij 35 (soluie 30%) Se amestec soluiile a si b ajustndu-se pH-ul la 4,2 cu soluie NaOH 10 N. n final volumul total al soluiei se aduce la 900 ml de ap distilat. 2. Soluie fiziologic NaCl 0,9% 3. Soluie etalon albumin bovin 4% n ser fiziologic

1.4 Concluzie
n concluzie proteinele reprezint piatra de temelie a organismului deoarece au un rol structural i plastic, organismul folosind proteinele pentru a construi, repara i menine funcionale aproape toate esuturile care l alctuiesc. Pentru determinarea proteinelor din lichide biologice precum urin, snge i ser au fost elaborate mai multe metode precum electroforeza serului, testul dipstick pentru determinarea cantitii de proteine din urin, metoda biuretului i metoda Lowry. Aadar este necesar s avem o diet echilibrat n care proteinele animale i vegetale s fie pe primul loc, deoarece acestea alturi i de ceilali compui organici ne asigur sntatea organismului.

12

Bibliografie

http://www.sfatulmedicului.ro/Analize-de-laborator/analize-biochimice-analiza-proteinelorsanguine-proteine-totale-proteino_1292 http://www.i-medic.ro/analize/proteine-totale-sange http://www.sfatulmedicului.ro/comunitate/investigatii/proteine-in-urina_38816 http://www.medipedia.ro/Dictionarmedical/Analize/tabid/94/analiza/Electroforezaproteinelor-serice/Electroforeza-proteinelor-serice.aspx http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19171019 Camelia Tulcan, Lucia Olariu, Mihaela Scurtu, Noiuni de chimie organic i metode de analiz biochimic n laboratorul clinic veterinar, Ed Eurostampa, Timioara, 2010.

13