IDENTIFICAREA PROTEINELOR PRIN WESTERN BLOTTING

Metoda Western blot este una din metodele de baz utilizate in laboratoarele de
biologie celular i molecular. Folosit corect, aceast metod duce la rezultate u or de
interpretat, unice, lipsite de ambiguitate, care pot fi utilizate ca atare sau in completarea altor
metode de imunomarcare, in cercetare sau n diagnosticul de laborator.

1. Noiuni generale: definiia metodei, denumirea metodei

Definiie: WB, cunoscut i sub denumirea de imunoblot, este o tehnic analitic
pentru identificarea unei proteine specifice dintr-o prob de omogenat tisular sau celular, ori
din probe biologice lichide (ser sau LCR).
Tehnica WB aduce informaii concrete i utile care nu pot fi puse la dispoziie prin alte
metode de imunomarcare.
Dac proteina, dei prezent n prob, este modificat calitativ sau cantitativ, se poate
observa prin prezena unei benzi mai subiri, mai groase, poziionat mai sus sau mai jos fa
de banda proteinei martor sau chiar prin prezena a doua benzi n loc de una. Aceste
modificri fa de o prob martor, cu o protein normal, ne d urmatoarele indica ii: fie
proteina int este degradat, fie este cantitativ redus sau n exces, fie este glicozilat sau
formeaz multimeri. De asemenea ne poate ghida ctre o investigaie genetic in cazul unei
deleii pariale sau duplicaii n gena respectivei proteine.
De asemenea metoda WB permite compararea expresiei proteinei tint n mai multe
probe, fie in acelai esut, fie in esuturi diferite, n scop de cercetare sau diagnostic, indicnd
modificri

patologice

sau

ca

rspuns

la

un

anumit

tratament.

W. Neal Burnette a denumit aceast tehnic, n 1979, ca un joc de cuvinte derivat de

la tehnica Southern blot, o tehnic utilizat pentru detectarea ADN, pus la punct de Edwin
Southern (1975). n mod similar, tehnica de detectare a ARN, a fost denumit Northern blot,
iar detectarea modificrilor post-translaionale a proteinelor se numete Eastern blot. Metoda
WB a fost pus la punct n laboratorul prof. George Stark, la Stanford, de ctre Harry Towbin
i col., n 1979, iar ulterior a suferit multe modificri i imbuntiri.

2.Principiul metodei
Pentru identificarea proteinei tint, proteinele din proba biologic trebuie ntai separate
n funcie de greutatea lor molecular prin electroforeza n gel de poliacrilamid, transferate
apoi pe un suport solid, membran de nitroceluloz sau PVDF, urmnd imunodetec ia
proteinei urmrite, cu anticorpi specifici.
Odat detectat, sceasta proteina va fi vizualizat printr-una din metodele ce pot fi utilizate n
acest sens, in funcie de posibilitaile i experiena laboratorului: chemiluminiscena chimic,
imagistica.
WB este asadar o tehnic in 4 pai:
Electroforeza n gel a probei care conine proteina de interes
Transferul electroforetic al proteinei inta de pe gel pe membran (Blotare)
Imunomarcarea proteinei de interes cu anticorpi specifici
Vizualizarea proteinei int

Fig.1 Principalele etape ale metodei Western blot: 1) Electroforeza SDS-PAGE; 2) Transferul
proteinelor de pe gel pe membran (blotarea); 3) Imunomarcarea i Vizualizarea proteinei de
interes din probele biologice.

3. Pregtirea probelor biologice

a) Obinerea lizatului tisular
Este esenial ca probele de esut sa fie pstrate n bune condiii, astfel ncat proteinele s nu fie
distruse. nc de la recoltarea probelor biologice, acestea trebuie pstrate la rece, pe gheat, n
timpul transportului i manipulrii, pentru a reduce la maxim proteoliza, defosforilarea sau
denaturarea proteinelor.
-

esutul se omogenizeaza astfel ncat proteinele celulare s fie eliberate i solubilizate.

Se utilizeaz o solutie tampon de liz, care conine obligatoriu inhibitori de proteaze
i/sau fosfataze, n care se omogenizeaz esutul, cu ajutorul unui omogenizator.
Raport optim: 1-5 mg tesut/1 ml tampon de liz.

Centrifugare la 40C, 20 minute, la 12.000 rpm.

Se recolteaz supernatantul. Se pstreaz timp de 2-3 luni la -20 0C sau pentru mai
mult timp la -800C.
b) Obinerea lizatului celular

- Celulele se recolteaz din recipientul de cultur,

- se spal se centrifugheaz,
- depozitul de celule se resuspend n tampon de liz cu inhibitori de proteaze. Toate aceste
operaii se fac pe ghea.
Denaturarea proteinelor se face pe de o parte prin fierbere (la 95-1000C, 5 minute),
n prezena de SDS (Sodium Dodecyl Sulfat).
Se pierde structura secundar si teriara a proteinei, se faciliteaz accesul
anticorpilor la epitopi (secvena de aminoacizi recunoscut de anticorp). SDS este coninut n
reactivul Laemmli, n soluia tampon de electroforez (de migrare) i uneori se poate adauga
i in soluia tampon de liz (n funcie de reteta utilizat).

Fig.2 Pregtirea probelor biologice nainte de electroforez: omogenizarea probei

biologice n tampon de extracie cu un omogenizator Potter; calcularea concentraiei proteice;
denaturarea termic a proteinelor.
Electroforeza n gel
Electroforeza SDS-PAGE, este procedeul prin care proteinele migreaz, n gel, ntr-un
cmp electric i se separ n funcie de greutatea lor molecular. Se utilizeaz o solu ie
tampon de migrare care conine SDS i care se adaug n tancul de electroforez.

Fig. 3 Suporturi cu geamuri montate pentru turnarea gelurilor.

Fig. 4 Electroforeza SDS-PAGE: tanc pentru electroforeza; suport cu electrozi pentru

geluri.
5. Transferul proteinelor (Blotarea)
Dup ce proteinele s-au separat pe gel, urmeaz transferul lor pe un suport mai dur si u or de
manipulat, pentru analiza lor ulterioar. Metoda de blotare n camp electric (Towbin et al.,
1979) este utilizat n cele mai multe laboratoare, fiind rapid i eficient. Cmpul electric
este orientat perpendicular pe suprafaa gelului i membranei.
Exist dou sisteme principale de transfer al proteinelor de pe gel pe membran:
semi-uscat
umed
- Gelul i membrana sunt asamblate ntr-un sistem sandwich, ntre hrtii de filtru,
eventual burei, care s le protejeze i s le menin n contact strns. Important:
plasarea membranei s se faca ntre gel i electrodul pozitiv, astfel ca proteinele
ncarcate negativ s migreze dinspre gel spre membran. n timpul montrii
-

sandwich-ului trebuie s se ndeprteze cu grij bulele de aer.

Soluia tampon utilizat n acest caz este soluia tampon de transfer, (asemanatoare
celei de la electroforez), dar nu conine SDS. Conine metanol, care ajut proteinele

s se lege de membran.
Membranele pentru transfer sunt membrana de nitroceluloza i membrana PVDF
(polyvinylidene difluoride).
- Transferul se face dinspre catod spre anod. Se menine fie amperajul, fie voltajul
constant.

Transferul umed. Se utilizeaza un tanc plin cu soluie tampon de transfer, n care se

scufund caseta/casetele cu sandwich-ul gel/membrana/hartie de filtru/burei, puse ntr-o
anumit ordine i in conexiune cu poziia fat de catod i anod.
n tanc se pune obligatoriu i un suport care conine gheat (n funcie de tipul de suport se
utilizeaz ap sau tampon ingheat), deoarece n timpul transferului se degaj caldur.

Fig. 5 Ordinea componentelor sandwich-ului de transfer n cazul modului de

transfer umed

Fig. 6 Transferul umed: tanc de transfer cu capac, suport cu electrozi, suport pentru
sandwich-ul de transfer alctuit din gel, membran, hartie de filtru si burei.

6. Imunomarcarea
Imunomarcarea proteinei de interes se face cu anticorpi specifici.

Se pot utiliza:
marcarea direct care utilizeaz un anticorp primar direcionat contra proteinei int,

legat cu o substant de marcaj.

Marcarea indirect, utilizeaz un anticorp primar anti-protein int i un anticorp
secundar direcionat contra anticorpului primar, acesta fiind legat cu substana de
marcaj.
Pasii imunomarcrii:
Blocarea: previne legarea nespecific a anticorpilor pe suprafaa membranei,prin
incubarea cu o soluie proteic, neutr n raport cu protocolul de imunomarcare. Se
recomand lapte degresat 5% n tampon TBS (solutie tampon TRIS), ori BSA
(bovine serum albumine) 3-5% n TBS. Pentru detecia fosfoproteinelor se
recomand blocarea cu BSA, deoarece laptele conine fosfoproteine (caseina) care
pot interfera cu imunodetecia. Timpul de blocare: 30 minute Dupa blocare,

membrana se spal cu TBST (TBS+Tween20, un detergent), 5 min.

Incubarea cu anticorpi specifici: se incubeaz membrana cu soluia de anticorpi
specifici (marcai sau nu), timp de 2 ore la temperatura camerei sau peste noapte la
rece. Peste membrana se toarn soluie de anticorp de detecie (dilua i
corespunzator n TBS. Optimizarea diluiei anticorpilor s se fac de fiecare dat

cand se lucreaz cu un anticorp nou).

Pentru a intensifica semnalul, se utilizeaz anticorpi secundari cuplai cu biotina.
Dup incubarea cu anticorpul primar, membrana este spalat cu TBST.
Atat blocarea, splrile, ct i incubarea cu anticorpi a membranei trebuie facute
cu suficient reactiv ct s spele bine membrana, pe un agitator. Membrana nu

trebuie n nici un caz s se usuce.

Se adaug anticorpul secundar (cuplat cu o enzim, peroxidaza, HRP horseradish
peroxidase sau fosfataza alcalin, AP) detectabil prin utilizarea unui substrat

care produce un semnal vizibil, sau un marker fluorescent.

Not: n cazul sistemului ce utilizeaz anticorpi biotinilai, se adaug o enzim
cuplat la streptavidin, care permite cuplarea la biotina de pe anticorp.

Fig.7 Detecia proteinei de interes prin imunomarcare pe membran: incubare cu

anticorpul primar specific; incubare cu anticorpul secundar cuplat cu o enzim; vizualizarea
substanei de marcaj cu ajutorul unui substrat enzimatic.
7. Vizualizarea proteinei de interes.
Cea mai utilizat enzim ca substan de marcaj, legat de anticorpul primar, este HRP. HRP
este detectat cnd vine in contact cu o soluie cu substrat pentru aceasta enzim, un reactiv
chimic cu care interactioneaz i produce un semnal vizibil, detectabil colorimetric sau
chemiluminiscent.
Substratul pentru HRP este DAB (diaminobenzidina), care produce o culoare maro. Detec ia
dureaz de la cateva minute la cateva ore, pan apar benzile vizibile unde se afl proteina
int.
Alternative moderne: chemiluminiscena, ECL ( enhanced chemiluminescence). Substratul
utilizat este luminolul, care este oxidat de HRP in prezena H 2O2, producnd lumina. Aceasta
este detectata prin expunera membranei unui film radiologic Timpul de detecie este scurt, de
la cateva secunde, la 30 minute (rareori mai mult). Filmul developat, poate fi pstrat
permanent, iar vizibilitatea este foarte bun.

Metoda WB aplicat in diagnosticul medical

Diagnosticul infeciilor virale
-

Confirmarea testelor HIV n cazuri neconcludente

Hepatita B
Confirmarea testelor FIV la feline, n medicina veterinar

Diagnosticul infeciilor bacteriene

-

Boala Lyme

Diagnosticul infeciilor parazitare

-

Protozoare (exemple: Toxoplasma gondii, Plasmodium falciparum)

Viermi (exemple: Trichinella spiralis, Fasciola hepatica, Capillaria sp.)

Diagnosticul unor boli prin detectarea proteinelor umane specifice acestora

-

Encefalopatia spongiform bovin (boala Creutzfeldt-Jakob)

Distrofii musculare
Unele forme de cancer

BIBLIOGRAFIE
Moore C - Introduction to Western Blotting, LIT CMr 2009 1 MorphoSys UK Ltd 2009
All rights reserved Published by MorphoSys UK Ltd Endeavour House, Langford Business
Park, Langford Lane, Kidlington, Oxford OX5 1GE, UK
Bolt M and Mahoney P High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following
sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, Anal Biochem. (1997) 247, 185192
Burnette W N - Western Blotting: Electrophoretic transfer of proteins from sodium
dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection
with antibody and radioiodinated protein, Anal Biochem (1981) 112, 195-203
Hames B D and Rickwood D - Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach 3
Rd Edition, The Practical Approach Series, Oxford University Press, 1998.
Towbin H et al - Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to
nitrocellulose sheets: procedure and some applications, Proc Natl Acad Sci U S A (1979) 76,
4350-4354
Towbin H and Gordon J - Immunoblotting and dot immunobinding--current status
and outlook, J Immunol Methods (1984) 72, 313-340