TEHNICI MODERNE N BIOLOGIA CELULAR

STUDIUL PROCESELOR CELULARE

2 aspecte: Tehnici si metode adecvate de urmrire a fenomenelor celulare Modelarea experimental a fenomenelor celulare

MODALITI DE STUDIU
1.
2. 3.

in vivo
in situ in vitro

MODALITI DE STUDIU
in vivo - cand celulele sau organele ale carui celule dorim sa le studiem sunt abordate in organismul intact. Avantaje: rezultatele obinute sunt edificatoare pentru procesul studiat la nivel de organism Dezavantaje: rezultatele experimentelor sunt dificil de interpretat datorit influenelor celorlalte componente ale organismului
4

MODALITI DE STUDIU
in situ cand organul de interes este mentinut la locul sau in organism dar sunt controlate unele influente cum sunt cele nervoase sau endocrine Avantaje: se pot studia variaiile procesului n condiii controlate Dezavantaje: nu se poate identifica rezultatul cu cel n vivo
5

MODALITI DE STUDIU
in vitro cand organul , esutul sau celulele sunt izolate din organism Avantaje: se permite un control riguros al experimentului. Dezavantaje: nu se poate garanta obinerea acelorai rezultate in vivo.
6

Tehnici in vitro
Baia de organ Cultura de celule

Baia de organ
- permite meninerea viabilitii unor fragmente de organ sau esuturi. -variate n funcie de organul supus experimentului - asigur o temperatura constant , oxigenarea materialului biologic , posibilitatea controlrii compoziiei mediului din baie i culegerea de date funcionale i eantioane
8

Culturi de celule - Etape

Digestia enzimatica a tesutului cu obtinerea unei suspensii de celule Izolarea unei populaii celulare pure Insmnarea n flacoane de cultur sau plci Petri obinndu-se astfel o cultur primar Pasarea - resuspendarea celulelor din cultura primara urmat de de rensmnarea n flacoane de cultur sau plci Petri obinndu-se culturi secundare

Culturi celulare - Evoluie

1.

2. 3.

4.

Faza de lag sau de inducie - celulele i refac suprafaa i se acomodeaz cu mediul de cultur Faza exponenial - celulele se divid rapid, exponenial Faza staionar - numrul de celule rmne constant. In aceast faz se efectueaz pasarea Faza de declin - scderea nr. de celule datorit mbtrnirii i morii .
10

Medii de cultur Componente

1. 2.

3.

4.
5. 6.

Amimoacizi i vitamine Sruri necesare meninerii echilibrului ionic i pH mediului de cultur Glucoza pentru necesarul energetic Ser fetal Antibiotice Rosu fenol ca indicator de pH

11

1.
2. 3.

4.
5. 6. 7. 8.

9.
10.

Morfologia si morfometria Citometria in flux Fractionarea celulara Citochimia si citoenzimologia Imunocitochimia Fluorescenta si imunofluorescenta Microfiziologia si microinjectia Radioautografia Metode biochimice Tehnici si metode de biologie moleculara
12

MORFOMETRIA
-

utilizeaz un analizor de imagine. se stabilete criteriul dupa care se va efectua analiza, precum i limitele maxim i minim ale acestuia Rezultat: diferite populaii celulare.

Rezultatul analizei cantitative este afisat sub forma unei histograme.

13

Citometria n flux
- permite analiza i separarea celulelor pe baza unor caractere morfologice i biochimice Ofer informaii asupra : 1. mrimii relative a celulelor 2. granularitii interne (neomogenitatea intern citoplasmatic) relativ 3. intensitatea relativ a fluorescenei.

14

Citometria n flux - utilitate

msurarea caracteristicilor fizice ale celulei 2. identificarea si separarea populaiilor de celule sanguine ( granulocite, monocite , limfocite T sau B) 3. msurarea cantitii de ADN din celul 4. msurarea cantitii intracelulare de Ca
1.

15

Citometria in flux

16

Fracionarea celular
- tehnic ce permite izolarea

diferitelor elemente ultrastructurale si biochimice ale celulelor

17

Fracionarea celular Etape

Omogenizarea distrugerea integritii tisulare i apoi celulare cu obinerea unei suspensii de organite i membrane veziculate n mediul de omogenizare

Separarea prin centrifugare i/ sau ultracentrifugare

18

OMOGENIZAREA
a. prin soc osmotic. Diferena de osmolaritate ntre mediul i.c. si cel e.c. duce la umflarea celulelor pana la ruperea membranelor. b. prin ultrasonicare presupune ruperea membranelor sub aciunea undelor ultrasonice c. cu omogenizatoare se realizeaza sub aciunea forelor de frecare i torsiune care 19 contribuie la ruperea membranelor.

SEPARAREA
diferenial cand organitele se depun la baza tubului , n ordinea densitii lor prin centrifugari repetate la fore din ce n ce mai mari n gradient de densitate printr-o singur centrifugare la fore suficient de ridicate se obin organitele ca fracii separate .

20

Sepa ra rea constituentilor ce lula ri prin viteze de ce ntrifuga re c resc a nde

Purifica re in gra die nt de de nsita te

Mitocondrii Lizozomi

Me mbra ne ce lula re Golgi microsomi

NUCL EI
Ultrasonic a re

Ribosomi

retic ul e ndopla smic

21

AUTORADIOGRAFIA
-tehnica de investigare celular ce permite

identificarea morfologic i ultrastructural a unor compui radioactivi.

trasori radioactivi : - aminoacizi, glucide, nucleotide Marcarea unor componente - fosfat sau sulfat radioactiv celulare
receptori sau - liganzi radioactivi specifici anticorpi radioactivi
22

METODE BIOCHIMICE
ELECTROFOREZA IMUNOELECTROFOREZA TRANSFERUL ELECTROFORETIC

23

ELECTROFOREZA
PRINCIPIU: particulele ncrcate electric migreaz ntr-un mediu vscos , sub aciunea unui cmp electric. Aplicaii practice: studiul proteinelor i a acizilor nucleici.
24

ELECTROFOREZA PROTEINELOR
unidimensional , cand migrarea se realizeaz n gel ntr-o singur direcie b. bidimensional , cnd migrarea se realizeaz succesiv n dou direcii
a.

Aplicaii practice electroforeza unidimensional

SDS PAGE FOCALIZAREA IZOELECTRICA

25

ELECTROFOREZA SDSPAGE
-realizeaz separarea proteinelor dintr-

un amestec pe baza gabaritului molecular direct proporional cu masa molecular.

Principiu: adsorbia dodecilsulfatului de sodiu unitar pe proteine, realiznd o densitate de sarcin negativ uniform.

26

ELECTROFOREZA SDSPAGE

27

Focalizarea izoelectrica
-

separarea proteinelor dintr-un amestec se face pe baza punctului lor izoelectric.

Principiu: migrarea proteinelor n funcie de punctul izoelectric, pn n zona cu pH-ul identic cu cel al punctului lor izoelectric, unde devin neutre oprindui miscarea.
28

Focalizarea izoelectrica

Benzi proteice la punctul izoelectric

29

Electroforeza bidimensionala
-migrarea proteinelor n dou direcii : 1. in prima direcie n funcie de punctul lor izoelectric - FOCALIZARE IZOELECTRICA 2. a doua direcie - SDS PAGE , n funcie de greutatea molecular a proteinelor. Rezultatul se prezinta sub forma unei hri cu
proteinele separate n planul gelului.
30

Electroforeza bidimensionala
Electroforeza la punct izoelectric

S DS -

31

IMUNOELECTROFOREZA
- o variant a electroforezei ce combin migrarea n cmp electric a proteinelor cu realizarea unei reactii imune de tip Ag-Ac

Reactia imuna: -dupa terminarea migrarii electroforetice, -concomitent (imunoelectroforeza n rachet) apreciere cantitativ a Ag (= suprafaa descris de linia de precipitare cu linia de start). 32

IMUNOELECTROFOREZA

33

TRANSFERUL ELECTROFORETIC
-metod de extragere a proteinelor

separate electroforetic dintr-un gel , cu adsorbirea lor pe niste hrtii cu proprieti speciale. Proteinele sufer reacii de recunoatere specific prin intermediul unor interaciuni de tip receptor ligand sau Ag Ac.
34

Bloturile
-

Metod de transfer a unor proteine, secvente ADN sau ARN, dintr-un gel electroforetic pe un suport care permite vizualizarea lor ulterioar Utilizate pentru identificarea prezenei unor proteine/ secvene ADN ntr-un lizat celular
35

Southern Blot
-

Utilizat pentru identificarea unei anumite secvene ADN, prin folosirea unei probe ce conine secvena complementar celei cutate. Proba de hibridizare este marcat fluorescent sau radiografic, permind depistarea ulterioar a preparatelor care conin secvena cutat
36

Northen Blot
-

Detectarea anumitor secvente de ARN Similar ca procedur Southern Blot ului Furnizeaz informaii legate de exprimarea anumitor gene n anumite populaii celulare

37

Western Blot
identificarea unei anumite proteine ntr-un omogenizat tisular -Proteinele din preparat sunt separate prin electroforez n gel, apoi transferate pe o membran suport unde, prin adugarea Ac specific, se va identifica prezena/absena proteinei sau cantitatea ei n proba dat.
-

38

Western Blot
Utilizri: Cea mai folosit metod pentru determinare cantitativ de proteine Ofer informaii legate de modificarea cantitativ a unei proteine n funcie de tipul celular sau tratamentele aplicate unei populaii celulare
39

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

- Folosit pentru obinerea unui numr mare de copii a unei anumite secvene de ADN Etape 1. denaturarea ADN cu separarea catenelor complementare 2. adaugarea primerilor (secvene ADN complementare secvenei-int) 3. sub aciunea Taq-polimerazei se sintetizeaz noi secvene de ADN dc
40

41

RT PCR (REVERSE TRANSCRIPTASE PCR)

-

Metod foarte sensibil de detectare i cuantificare a ARNm Iniial din ARN-ul int se sintetizeaz secvena cADN, apoi urmeaz etapele PCR Utilizat n diagnosticul unor boli genetice, cuantificarea expresiei diverselor gene prin determinarea cantitii de ARNm

42

Animale transgenice
-

Animale de laborator crora li se inser gene mutante pentru a studia efectul lor asupra organismului gazd. Mediu de studiu pentru evoluia unor boli cu determinism genic i a opiunilor terapeutice

43

Animale de laborator transgenice

44

Animale knockout
-

nlocuirea genei de interes cu o gen inactiv sau o alel mutat Animalul purttor nu va exprima aceast gen, putndu-se studia efectul absenei ei in organism.

45

leptin knockout mouse

46