STABILIREA GRADULUI DE DISTRUGERE A CELULELOR MICROBIENE O importanta deosebita in proiectarea etapei de separare a unui anumit produs de biosinteza o are

localizarea acestuia: extracelulara, sau intracelulara. Astfel, daca produsul este intracelular este necesara distrugerea prealabila a masei celulare, prin metode adecvate, pentru eliberarea acestuia, fiind, apoi, separate din solutia rezultata prin diferite tehnici: extractie, schimb ionic, cromatografie, precipitare, distilare, tehnici membranare. In anumite cazuri, atat pentru facilitarea eliberarii continutului intracellular, cat si pentru usurarea separarii ulterioare a produsului util, se pot aplica o serie de metode, dintre care se remarca: - efectuarea unui tratament chimic (modificarea pH-ului, utilizarea unor agenti de floculare, a unor electroliti, etc.), sau fizic (utilizarea caldurii) pentru a se favoriza distrugerea membranelor celulare; - utilizarea unor enzime specifice pentru a se distruge peretii celulari; - utilizarea in procesul de fermentatie a unor tulpini de microorganisme capabile sa reduca sau sa elimine formarea unor compusi secundari care ar putea influenta negativ performanta separarii; - modificarea conditiilor de fermentatie, pentru obtinerea aceluiasi efect ca mai sus. Tehnicile de distrugere a celulelor microbiene sunt determinate de forma si dimensiunile celulelor, de structura peretilor celulari si de compozitia lichidului intracelular. Forma si rezistenta membranelor celulelor microbiene depind de natura componentilor macromoleculari din care sunt alcatuite, precum si de gradul de realizare a unor legaturi dintre acestia si alti componenti ai peretelui. Cea mai puternica rezistenta la distrugerea celulelor este creata de lagatura covalenta stabilita intre componentii structurali ai membranelor celulare. Structura si compozitia peretilor celulari cunosc o mare diversitate, fiind determinata nu numai de informatia genetica, ci si de conditiile de cultivare a microorganismelor, sau pentru fungi, de stadiul de dezvoltare. Distrugerea celulelor microbiene, in scopul eliberarii continutului intracelular, se poate realiza prin doua categorii principale de metode: a. Metode mecanice: - in faza lichida:- cu ultrasunete - prin agitatie mecanica - la presiuni ridicate - in faza solida: - prin macinare - prin presare b. Metode nemecanica: - uscare: - uscare cu aer - uscare sub vid - liofilizare - uscare cu solventi

- liza fizica: - soc osmotic - inghetare/dezghetare

- socuri de presiune - chimica - cu substante tensioactive - cu antibiotice - cu acizi, baze, saruri, esteri etc.

enzimatica - cu lizozime Majoritatea metodelor prezentate sunt aplicabile la nivel de laborator, sau pilot. Alegerea unei metode de distrugere a biomasei, pe langa criteriile referitoare la natura celuleor si a componentilor intracelulari (compatibilitatea cu microorganismul respectiv, stabilitatea compusilor intracelulari, usurinta eliberarii acestora din celule), are la baza si considerente tehnice si economice, cum ar fi simplitatea si costul operatiei. Indiferent de tehnica de distrugere utilizata, stabilirea gradului de distrugere se realizeaza prin metode specifice, grupate in doua categorii principale: - metode directe, care stabilesc numarul sau masa celulelor ramase intacte: - metode indirecte, care determina componentii celulari eliberati. Metodele directe se bazeaza pe numararea celulelor ramase intacte cu ajutorul unui microscop, sau al unui numarator electronic de particule. Uneori, insa, compusii obtinuti prin distrugerea celulelor (de exemplu, unii componenti macromoleculari, sau fragmente celulare mari) pot afecta precizia metodei. Usurarea numaratorii se poate realiza prin colorarea celulelor, astfel incat sa poata fi diferentiate mai bine celulele intregi de cele distruse. Metoda necesita un timp mai lung si nu poate fi aplicata cu destula precizie bacteriilor. Metodele indirecte constau in dozarea concentratiei componentilor citoplasmatici eliberati in mediu, sau in masurarea unor parametrii care depind in mod direct de concentratia acestora (conductivitatea electrica, activitate) si compararea cu valorile standard corespunzatoare unui grad de distrugere de 100%. In acesta categorie intra: tehnica dilutiei, tehnica bilantului de masa, masurarea cnductivitatii etc. Scopul lucrarii consta in stabilirea gradului de distrugere a celulelor microbiene prin tehnicile centrifugarii diferentiale si a gradientului de densitate.

STABILIREA GRADULUI DE DISTRUGERE A CELULELOR MICROBIENE PRIN CENTRIFUGARE DIFERENTIATA Cea mai utilizata tehnica de separare a componentelor unui amestec pe baza diferentelor dintre densitatea si diemnsiunea particulelor o reprezinta centrifugarea. Insa, in absenta miscarii Browniene si a amestecarii cauzate de diferenta de temperatura, centrifugarea nu este neaparat necesara, dar aceasta tehnica accelereaza considerabil procesul de separare. In urma procesului de distrugere a biomasei rezulta un amestec care contine produsi intracelulari (proteine, enzime, vitamine etc.), fragmente celulare de diferite dimensiuni si celule intacte. Utilizarea centrifugarii pentru determinarea gradului de distrugere consta in separarea celulelor si a fragmentelor celulare, proces favorizat de diferenta dintre vitezele terminale (de sedimentare) ale particelelor din amestec. Viteza terminala, vt, se calculeaza cu ajutorul legii lui Stokes: vt =2/9R2/(p-)a in care: R raza particulei p densitatea particulei vascozitatea suspensiei densitatea suspensiei Din ecuatie se observa ca viteza de sedimentare este direct proportionala cu raza si cu densitatea pariculei, astfel incat particulele mai mari si mai grele se vor depune intr-un timp mai scurt. In acest sens, un amestec de celule microbiene (sau de fragmente celulare) va contine particule de dierite dimensiuni, densitati, sau forme, care pot fi separate in functie de viteza de sedimentare. Modul de lucru si interpretarea rezultatelor Se suspenda ......................g biomasa (drojdie, fungi) in ...........ml solutie .................g/l zahar. Suspensia se supune distrugerii printr-o agitatie intensa intr-un vas prevazut cu amestecare (efectul este amplificat daca distrugerea se realizeaza in prezenta bilelor de sticla), timp de 15 min. Amestecul rezultat se supune centrifugarii in urmatoarele conditii: la 100 rot/min timp de 10-15 min, cand vor sedimenta celulele intacte si fragmentele celulare grele; supernatantul obtinut este centrifugat la 1000 rot/min timp de 20-30, cand are loc separarea particulelor subcelulare (mitocondrii, lizozomi); cele mai mici si mai usoare particule (ribozomi, fragmente endoplasmatice, membrane celulare, microzomi) se separa prin centrifugarea supernatantului rezultat la 10.000 rot/min timp de 60 min. Supernatantul final va contine fractia solubila a citoplasmei. Precipitatele colectate dupa fiecare centrifugare se cantaresc si prin raportarea cantitatilor corespunzatoare se poate stabili gradul de distrugere a celulelor microbiene. Pentru determinarea influentei conditiilor de operare (turatie, dimensiunea si concentratia bilelor de sticla, concentratia biomasei, caracteristicile constructive ale agitatorului) asupra eficientei distrugerii, se repeta experimentele, modificandu-se acesti parametri.