Tehnici speciale utilizate in biologia celulara si moleculara

Culturi de celule
Prin cultura de celule se obtine o multiplicare "in vitro" a celulelor provenite dintr-un fragment de tesut. Se poate studia comportamentul celulelor in conditii strict definite: prin adaugarea sau extragerea de molecule specifice. Observatiile efectuate se verifica in comparatie cu comportamentul celulelor "in vivo". Metoda permite: 1. Studiul caracterelor morfologice si proprietatilor biologice ale celulelor din diferite tesuturi. 2. Studiul unor probleme de biologie tisulara. Tipuri de culturi de celule I. Dupa felul substratului, culturile de celule pot fi: pe suport organic nutritiv pe suport organic nenutritiv pe suport anorganic in suspensie in mediul lichid

II. Dupa modul de initiere a culturii: A.Culturi initiate cu fragmente de tesut: o o o pe suport nutritiv culturi in picatura suspendata culturi in flacoane culturi in tuburi rotate pe suport nenutriv in suspensie in mediul lichid

B. Culturi initiate cu celule dispersate: culturi de celule libere in mod natural culturi de celule obtinute prin dispersarea celulelor din fragmente de tesut.

III.Dupa tipul de material biologic cultivat: A. Culturi de organe B. Culturi de celule cultura de tesuturi obtinuta prin fragmente de tesut cultura celulara propriu-zisa

Materiale de lucru Culturile de celule se prepara intr-un spatiu de lucru steril, amenajat special. Nevoile de baza dintr-un laborator de culturi de celule sunt: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Arie de lucru sterila Sticlarie, instrumente fine Dispozitive de curatat si sterilizat Recipiente de stocare pentru mediu, ser, sticlarie si altele Incubator si hota cu flux laminar Sursa de apa Microscop, agitator magnetic, balanta analitica Substante chimice

Spatiul de lucru steril necesita o iluminare adecvata, un trafic scazut de aer, suprafete de lucru usor de curatat, o hota laminara si lampi ultraviolete. Sticlaria trebuie sa fie neutra, perfect trasnsparentam fara neregularitati. Instrumente fine: bisturie, lame sterile, pene fine, foarfeci chirurgicali, autoclave. Reusita culturii celulelor "in vitro" depinde in mare masura de pregatirea sticlariei, spalarea si sterilizarea ei, de pregatirea instrumentarului si in special de tehnicile aseptice aplicate.

Tehnicile aseptice Presupun urmatoarele reguli: o o o o o accesil limitat in zona de culturi celulare suprafetele se decontamineaza cu etanol 70% inainte si dupa utilizare nu se pipeteaza cu gura, nu se fumeaza sau mananca in zona de lucru se spala mainile inainte si dupa operatie se controleaza emisiile de aer, se sterilizeaza incinta cu lampi UV

Mediile de cultura celulara Mediile de cultura celulare trebuie sa asigure: 1. Echilibrul ionic obtinut cu solutii izotone 2. pH optim 3. Temperatura optima 4. Elemente nutritive, indispensabile metabolismului 5. Evitarea contaminarii cu germeni patogeni prin adaugarea de antibiotice si antifungice 6. Stimularea multiplicarii si cresterii celuleor prin adaugarea de extracte embrionare Mediile de cultura se clasifica dupa mai multe criterii:
a. dupa constistenta: lichide, semilichide b. dupa compozitie: naturale, semisnintetice, sintetice c. dupa valoarea nutritiva si scopul urmarit: medii de crestere, medii de mentinere

Mediile nutritive contin: o solutie salina, elemente proteice, elemente stimulatoare ale cresterii, vitamine, antibiotice. Tehnica culturii celulare a. Recoltarea se face din cele mai variate tesuturi provenite de la om, animal, insecte sau plante. Tesuturile se impart in: b. tesuturi normale: embrionare, adulte c. tesuturi tumorale

Recoltarea trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii:

sa evite contaminarea tesuturilor cu microorganisme sa evite traumatizarea in timpul recoltarii si in cursul manevrelor ulterioare sa se realizeze cat mai curand dupa deces, de la recoltare si pana la preparearea culturii tesutul se pastreaza la rece intr-o solutie salina cu antibiotice timp de 3-4 ore. Pentru tesuturi embrionare umane recoltarea se face de la embrioni de 1-3 luni. Se evita excesul de dezinfectante. Sterilizarea se face cu alcool iodat. Se aleg fragmente de tesut embrionar cu pense sterile. Se pun intr-o epubreta de centrifuga sterila si se obtine o masa cu aspect omogen. Celulele se separa sub actiunea tripsinei si agitarii. Cu o pipeta Pasteur se ia o cantitate din suspensia de tesut embrionar si se intinde pe una din suprafetele unui recipient de cultura. Recipientele sunt astupate cu dop de caucun si incubate intr-un termostat la 37 de grade C, unde trebuie tinute nemiscate timp de 3-4 zile. Pentru tesuturile adulte fragmentele recoltate se introduc in solutie salina cu antibiotice unde se lasa 2-3 ore si apoi se efectueaza etapele de prelucrare ca la embrion. Controlul culturii 1. Controlul mediilor: control pentru contaminati, control al constantelor fizicochimice, control de eficienta 2. Controlul morfologic: tehnici de microscopie fotonica, tehnici de histoautoradiografie, tehnici de microscopie electronica.

Criofracturarea
Criofracturarea presupune inghetarea celulelor fara formarea cristalelor de gheata. Tesuturile inghetate instantaneu sunt sectionate cu ajutorul unui ciroultramicrotom, un cutit racit la temepraturi sub -190 de grade, cu azot lichid. Aceasta metoda are avantajul ca permite vizualizarea unor structuri, ca partea interna a memebranelor unitare.

Fractionarea celulara

Fractionarea celulara este tehnica care implica omogenizarea sau destructia legaturilor celulelor prin diferite procedee memcanice sau chimice. Primul pas consta in ruperea peretelui celular sau a membranei plasmatice. Spargerea membranei se realizeaza prin agitarea suspensei celulare cu o viteza foarte mare intr-un "malaxor". La centrifugarea in gradient de densitate la echilibru, organitele sunt separate dupa densitate, nu dupa marime.

Cromatografia
Este o metoda de separare de mare performanta ce reuneste o serie de metode de analiza bazate pe separarea componentelor unei probe, prin migrarea lor diferentiala intre 2 faze, dintre care una este stationara, cealalta mobila. Caracteristicile metodei cromatografice sunt : capacitatea de rezolutie foarte mare, concretizata in posibilitatea separarii unor amestecuri speciale de componenti asemanatori sensibilitatea remarcabila universalitatea domeniilor de aplicare simpla, accesibila, rapida

Clasificarea 1. 2. 3. 4. Cromatografie de absorbtie: cromatografie lichid-solid, gaz-solid Cromatografie de repartitie: cromatografie lichid-lichid, gaz-lichid Criomatografie prin schimb ionic Cromatografie de excludere-difuzie.

In functie de natura fazei stationare si de natura fazei mobile avem: 1. Faza stationara solida: faza mobila solid-lichid, faza mobila gazoasa solid-gaz 2. Faza stationara lichida: faza mobila lichida lichid-lichid, faza mobila gazoasa lichid-gaz.

Separarea proteinelor prin cromatografie

Cel mai utilizat tip de cromatografie estea cea de partitie, o picatura de proba este aplicata pe un suport, cum ar fi o bucata de hartie absorbanta sau o bucata de plastic. Unui amestec de solvent ii este permis sa patrunda in banda dintr-un capat. Solventii sunt selectati astfel ca unul din ei sa fie mai absorbit mai puternic pe materialul absorbant decat celalalt. In acest timp, moleculele care sunt mai solubile in solventul absorbit sunt relativ intarziate. Proteinele sunt adeseori fractionate prin cromatografie pe coloana. In acest mod, diferitele proteine pot fi colectate separat pe masura ce scurg pe la baza coloanei. Matricile utilizate pentru separarea proteinelor sunt dietilaminoetilceluloza si carboximetilceluloza si fosfoceluloza.

Electroforeza
Si-a adus contributii majore la dezvoltarea bazei informationale atat pentru nivelele macromoleculare (proteine si acizi nucleici) cat si pentru cele de dimensiuni reduse ( monomeri). Prin aceasta tehnica se realizeaza purificarea si fractionarea macromoleculara. In functie de natura sarcinii molecului acestea migreaza catre un catod sau anod. Lungimea deplasarii depinde de masa moleculara si sarcina ei, cat si de pH-ul mediului. Cea mai importanta tehnica de electroforeza este cea care utilizeaza gelul poliacrilamidic sau din agaroza, medii propice separarilor de proteine si acizi nucleici. Avantajele gelului sunt: reproductibilitatea lui, puterea de rezolutie mare, posibilitatea de control a marimii porilor, transparenta perfecta, rezistenta mecanica si flexibilitate. Gelul de poliacrilamida se obtine prin copolimerizarea acrilamidei si a N,N'. In cazul proteinelor, aceste geluri pot fi preparate sub forma de straturi netede sau sub forma unor coloane cilindrce. Inainte polarizarii moleculele se gasesc intr-un ametec, apoi odata cu aplicarea campului electric toate proteinele trec rapid prin porii gelului, iar in cazul procesului de separare ele se distanteaza datorita sarcinii electrice specifice. Metodele de electroforeza pe gel sunt mai mult utilizate in secventionarea ADN-ului, diverse protocoale ( Sanger, Maxam si Gilbert), modelarea miscarii de drift a particulelor sau dimensionarizarea porilor.

Difractia cu Raze X

Difractia cu raze X ofera rezolutii mai bune chiar decat cele mai sofisticate tehnici de microscopie electronica. Razele X au o putere de penetrare cu mult mai mare decat electronii, permitand asfel analiza unei probe stratificate. Structura unui cristal se prezinta la scara microscopica ca o retea cu simetrie cubica, avand ca cel mai mic element al arhitecturii cristalului laticea, in varfurile careia se gasesc plasati atomii corespunzatori ai moleculei. Laticea este unitatea periodica fundamentala de difractie. Razele X sunt difractate mai ales de electroni, difractia pe nuclee fiind in cele mai multe cazuri neglijabila. In cristalografia X recombinarea facuta de cristalograf trebuie sa fie bazata pe informatia din: pozitia spoturilor, intensitatea lor de pe placile fotografice si fazele undelor. Aceasta permite vizualizarea tridimensionala a macromoleculelor proteinelor si acizilor nucleici, facand astfel posibila analiza detaliata a tuturor elementelor spatiala existente la nivel subcelular.