1.

Colorația GRAM – efectuarea unui frotiu, colorarea și examinarea microscopică

- Principiu-evidenţiază forma, gruparea şi afinitatea tinctorială a germenului, clasificând
germenii Gram pozitivi şi Gram negativi pe baza structurii fizico-chimice a peretelui celular.
Germenii Gram pozitivi au peretele gros, dar simplu care rezistă la decolorare şi păstrează
culoarea violet iniţială. Germenii Gram negativi au peretele subţire dar complex ca structură
după culorare devenind roşii.
Metodologie
• frotiul uscat şi fixat se acoperă cu violet de genţiană 2 minute.
• mordansarea-se acoperă lama cu Lugol care se menţine 2 minute, apoi se varsă
fără a se spăla.
• diferenţierea-se acoperă frotiul cu un amestec alcool-acetonă şi se imprimă
mişcări de inclinare a lamei. După 10 secunde se spală frotiul cu apă de la
robinet.
• recolorarea-se acopera frotiul cu fuxină Ziehl diluată 1/10 timp de 1-2 minute
Se spală cu apă de la robinet. Se usucă şi se examinează la microscop.

2.Coloraţia Ziehl-Neelsen – principui, metodologie, interpretare

Principiu-bacilii acido-alcoolo-rezistenţi au în structura peretelui substanţe lipidice care se
colorează greu dar odată coloraţi nu-şi pierd culoarea nici cu un decolorant puternic rămânând
coloraţi în roşu. Celelalte microorganisme, împreuna cu elementele celulare, se decolorează şi,
după recolorare, devin albastre.
Metodologie
• se acoperă frotiul cu fuxină fenicată. Se aşează flacăra sub frotiu şi se menţine
până la emisie de vapori. Încălzirea durează 5 minute. Se înlătură fuxina, se
spală lama cu apă de la robinet .
• decolorarea cu o soluţie de acid sulfuric 20% timp de 1 minut. Se spală pe
ambele feţe.
• recolorarea cu albastru de metilen 1% timp de 1 minut. Se spală cu apă de la
robinet. Se usucă şi se examinează la microscop cu obiectivul cu imersie.
În coloraţia Ziehl-Neelsen bacilii alcool-acido rezistenţi apar roşii, iar restul florei şi
elementele celulare colorate cu albastru.

3. Caractere de cultura ale germenilor patogeni

Caractere de cultura pe medii solide:
Elementul caracteristic al multiplicării bacteriene în mediul solid este reprezentat de "colonia
bacteriană" care genetic reprezintă multiplicarea în generaţii successive pornind de la un singur individ
iniţial.
■ Dimensiuni:
Mici: dimensiuni cuprinse intre 0,1-1 mm. Exemplu: germeni din genul Haemophylus, Brucella,
Bordetella.
- Mijlocii: dimensiuni de 1-2 mm. Exemplu: Proteus, Salmonella, Streptococcus.
- Mari: dimensiuni de 2-3 mm. Exemplu: Staphylococcus, E. Coli.
■ Formă: Rotunde; Ovalare; Dendritice;Lenticulare;Filamentoase.

1
■ Suprafaţă: Netede: în general tulpinile proaspăt izolate, Rugoase: unele tulpini întreţinute "in vitro "
prin pasaje repetate; Bombate: Stafilococul, E. coli, Vibrionul holeric; Mamelonate: Bacilul tuberculos,
Bacilii difterici - formele "gravis " şi "intermedius "; Aplatizate: Pseudomonas; Ombilicate („în
farfurie"): Pneumococ.

Contur (margini)
Circular, regulat, întreg, majoritatea germenilor la primoizolare;
- încreţit: forma „gravis"
Ondulat-invaziv: cu valuri successive de invadarea a mediului - Proteus Cu prelungiri - lobate,
filamentoase.
Transparenţă-Opacitate (densitate optică) Hipertransparente: vibrion holeric; Transparente.
Haemophyllus („în picătură de rouă"), Shigella; Translucide: Salmonella, Proteus; Opace: Stafilococ, E.
coli.
Strălucire-Matitate
- Lucioase (strălucitoare): Brucella, Streptococ fî-hemolitic (forma "glossy"), Shigella;
- Mate: Streptococ fi-hemolitic (forma "matt"); Uscate, granulare: bacilul tuberculors.
■ Consistenţa
Friabile: bacilul tuberculos; - Mucoase, filante: Klebsiella, Streptococ /3-hemolitic (forma
"mucoides") (figura 9); Untoasă; păstoasă; Spumoasă, ca albuşul de ou bătut spumă.
■ Aderenţa Ia mediu
Neaderente {streptococ, stafilococ, Shigella); Aderente: (bacilulpiocianic); încastrate in
mediu
■ Culoarea: Prin pigment propriu: coloniile pot fi: albe (stafilococ alb); galben-aurii (stafilococ
aureu); galben-citrin (stafilococ citrin); verde fluorescent (Pseudomonas aeruginosa); portocalii
(streptococ de grup B).
- Virarea culorii indicatorului din mediu: culoare galbenă (indicator albastru de bromtimol) sau
roşie (indicator roşu fenol) la bacteriile lactozo-pozitive (E. coli, Klebsiella), culoare galbenă:
stafilococ aureu in cazul tulpinilor manito-pozitive (figura 12); culoare albastră, in cazul tulpinilor
care folosesc citratul ca unică sursă de carbon (indicator albastru de bromtimol): Klebsiella,
Enterobacter (figura 11).

■ Mirosul degajat de unele colonii poate fi caracteristic:

Aromă de flori de tei: Pseudomonas aeruginosa; Putrid: Proteus; „Corn ars": Clostridium
tetanii; Fecaloid: E. coli.
■ Hemoliza La zona de hemoliză se apreciază: Dimensiunile zonei în raport cu diametrul bacteriei:
dimensiuni mari: la stafilococ beta-hemolitic, streptococ a-hemolitic (viridans), Bordetella,
hemofili. dimensiuni mici: stafdococ;
Prin coroborarea a câteva dintre caracterele coloniilor microbiene (contur, suprafaţă), se disting
două mari categorii:
- forma „S" („smooth "): contur circular, suprafaţă netedă, bombate;
- forma „R" („rough"): contur încreţit, suprafaţă rugoasă, sau mamelonată, turtite.
CARACTERE DE CULTURĂ PE MEDII LICHIDE
■ Turbiditatea care se traduce prin tulburarea mediului fie în mod omogen, în toată masa mediului
de cultură {stafilococ, Salmonella, Proteus etc); fie in mod inegal, sub forma unui depozit grunjos la

2
 partea inferioara şi pe pereţii eprubetei si cu un aspect mai limpede in celelalte doua treimi superioare.
(streptococul b-hemolitic); fie sub aspectul unui depozit floconos şi aderent la fundul eprubetei, mediul
fiind clar în rest (bacilul antraxului).
Aspecte la suprafaţa mediului: formare de val subţire la suprafaţă: vibrion holeric, C. diphteriae;
formarea unei pelicule fine (unele tulpini de Proteus); formarea unei membrane groase, rugoase,
încreţite la suprafaţă, restul mediului fiind limpede (bacilul tuberculos); formarea unei membrane
uscate, „scuamoase" (Bacillus subtillis); formarea unui inel aderent la joncţiunea dintre
concavitatea nivelului superior al lichidului şi pereţii eprubetei (unele tulpini de E. coli).
■ Culoarea
Apariţia unei coloraţii diferite de cea a mediului neînsămânţat, dată de eliberarea de pigmenţi
bacterieni hidrosolubili ca fluoresceina, piocianina, melanină (coloraţie verde-albăstruie în cazul
Pseudomonas aeruginosa).
Miros caracteristic: aromat, de flori de tei: Pseudomonas;fecaloid: E. coli;/putrid: Proteus;corn ars:
bacilul tetanic.

5. Antibiograma: principiu si interpretare.

Este testarea sensibilităţii unei tulpini bacteriene la agenţi chimioterapici sau antibiotice.
Principiul metodei constă în punerea în contact a suspensiei bacteriene cu diferite antibiotice.
a) Metoda difuzimetrică-gradientul de concentraţie necesar determinării se realizează în
mediu agarizat prin difuzarea radială a antibioticului dintr-un depozit depus pe suprafaţa
mediului, însămânţată “în pânză” cu bacteria de testat. Acest gradient scade proporţional
cu pătratul distanţei de la antibiotic. Cultura nu apare în aria în care antibioticul realizează
CMI pentru bacteria testată. Metoda difuzimetrică se utilizează numai pentru bacteriile cu
creştere rapidă. Permite testarea mai multor antibiotice pe aceeaşi floră.
b) Metoda diluţiilor permite determinarea concentraţiei minime inhibitorii(CMI). În mediul
lichid, inoculul bacterian se distribuie într-o serie de tuburi sau godeuri, conţinând bulion
Mueller-Hinton cu antibioticul în concentraţii crescânde(0; 0,25; 1; 2; 4; 8; 16 mg/l).
Inoculul constă dintr-o suspensie din tulpina microbiană de testat diluată de ordinul
105germeni/ml. După incubare 24 de ore la 37oC, CMI este indicată de tubul sau godeul
care conţine cea mai mică concentraţie de antibiotic la care creşterea bacteriană nu mai
este vizibilă.

9. Diagnosticul de laborator in tuberculoza.

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC
2.1. Examenul direct
Prezintă o etapă esenţială în diagnosticul de laborator al tuberculozei şi constă în efectuarea de frotiuri direct din
produsul patologic. Produsele patologice (în special sputa) sunt supuse în prealabil omogenizării prin tratare cu
hidroxid de sodiu şi agitare (fluidificarea produsului şi repartizarea uniformă a bacililor) şi concentrării bacililor în
stratul superior cu xilol şi apă distilată.
Se efectuează:
- „screeningul" prin fluorescentă cu auramină şi rodamină şi examinare în ultraviolet (puncte strălucitoare pe
fondul pal-verzui al câmpului, în caz de prezenţă a bacililor Koch). Probele pozitive trebuie controlate prin coloraţia
Ziehl-Neelsen;
- baciloscopie directă prin coloraţia Ziehl-Neelsen permite diagnosticul de certitudine: barili roşii, dispuşi în
cordoane, celelalte elemente (floră de asociaţie, polimorfonucleare, celule epiteliale întregi sau detritusuri) albastre
(figurile 1 şi 2).

3
 2.2. Izolare:
Se face:
• in vitro pe mediul Lowenstein-Jensen (bogat în substanţe nutritive şi conţinând verde-malahit ca inhibitor al
florei de asociaţie) (figura 3) cu incubare la 37°C timp de 2 luni;
• in vivo: se utilizează cobai masculi de 400 g, se inoculează subcutanat, pe faţa internă a coapsei 1-2 ml produs
patologic.
• 2.3. Identificare \
• Caractere cultură:
Pe mediul Lowenstein: colonii „R" (margini neregulate, suprafaţa mamelonată), „conopidiforme", uscate,
alb-gălbui; cele de tip uman cresc după 14 zile, cele de tip bovin după 30 de zile, cele atipice cresc în primele zile şi
sunt colorate (figurile 4, 5, 6 şi 7).
• Caractere morfologice:
Frotiul din cultură (colorat Ziehl-Neelsen) evidenţiază bacili acido-alcoolo-rezistenţi, roşii, uneori dispuşi
în cordoane prin bogăţia de factor „cord" (factor de patogenitate), alături de celule epiteliale, leucocite, floră de
asociaţie, colorate în albastru (figura 8).
• Caractere biochimice:
- Testul catalazei diferenţiază mycobacteriile atipice la care reacţia este pozitivă de bacilul Koch, unde reacţia este
negativă. Se acoperă coloniile obţinute pe suprafaţa mediilor solide cu soluţie de pirocathelor, perhidrol şi apă
distilată. După 2-5 minute se face citirea reacţiei. Reacţia este pozitivă dacă se observă apariţia bulelor de gaz.
- Testul la niacin (Konno) este utilizat pentru punerea în evidenţă a niacinei.
• Caractere de patogenitate
Animalul de elecţie pentru reproducerea experimentală a infecţiei tuberculoase e cobaiul, care se inoculează subcutanat
pe faţa internă a coapsei, iar evoluţia bolii se face timp de 2-6 luni, după care cobaiul slăbeşte şi moare. După 10-15
zile, de sănătate aparent deplină, cobaiul devine apatic, pofta de mâncare scade, iar la locul inoculării apar
modificări, în sensul că regiunea se împăstează, apoi devine fluctuentă, iar la nivelul plicii inghinale se palpează un
ganglion, care creşte şi se ramoleşte, abcedând. La scurt timp sunt prinşi ganglionii regionali. La autopsie se poate
observa invadarea întregului sistem limfatic şi a viscerelor.
DIAGNOSTICUL IMUNOBIOLOGIC
Prezenţa imunităţii celulare, principala modalitate de apărare specifică antituberculoasă, se testează prin IDR la
tuberculină. Organismele infectate cu bacili tuberculoşi reacţionează diferit faţă de tuberculină, comparativ cu cele
indemne. Intradermoreacţia la tuberculină testează răspunsul imun celular (hipersensibilitate întârziată), faţă de
tuberculină. Se injectează pe faţa anterioară a antebraţului 0,2 ml tuberculină, dintr-o diluţie de 1/10.000. Reacţia se
citeşte după 72 de ore de la injectare, când la locul inoculării apare un eritem şi un edem cu diametru diferit, în
funcţie de gradul de răspuns imun faţă de tuberculină.

11. Diagnosticul de laborator in infectiile cu E.Coli

Sunt germeni condiţionat patogeni ce pot determina:
- infecţii urinare (cistite, pielite, pielonefrite);
- infecţii intestinale (enterite, colite, enterocolite). La sugar, copil mic, în cazurile cu rezistenţă scăzută a
organismului, pot apare şi septicemii. suprainfecţia plăgilor;
infecţii purulente (apendicite, pcritonite, colecistite).
E. coli poate determina diareea malignă a nou-născutului;
1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE
Se pot recolta:

4
 • materii fecale din scaunul emis spontan sau recoltate cu sonda Nelaton (infecţii ale tractului digestiv);
urină pentru urocultură; bilă (în infecţii ale căilor biliare); -
• sânge pentru hemocultură (în caz de septicemii);
• puroi de la nivelul plăgilor; exudate diverse focare inflamatorii);
alimente, produs de vărsătură (toxiinfecţiile alimentare);
• probe de organe de la cadavru (diaree malignă a nou-născutului);
• sputa (infecţii ale tractului respirator); exudat nazo-faringian; '
LCR (localizări meningeale).
2. DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC (BACTERIOLOGIC)
2.1. Examenul direct
Este important pentru produsele patologice normal sterile (LCR, urină, bilă); frotiul colorat Gram efectuat
direct din produsele patologice, evidenţiază bacili Gram negativi, drepţi sau uşor încurbaţi, nesporulaţi,
necapsulaţi, mobili (E coli)

2.2. Izolarea
Izolarea acestor enterobacterii se realizează prin însămânţarea prelevatului pe două tipuri de medii: medii simple,
fără inhibitori (geloză glucozată 2%) şi medii cu inhibitori (slab sau moderat selective:
EMB/Levine, Istrate-Meitert). Aceste medii vor fi incubate la 37°C 18-20 de ore.
2.3. Identificarea germenilor Caractere de cultură Geloză simplă
Escherichia coli determină colonii S, convexe, umede, cu suprafaţă lucioasă,
margini netede, uşor emulsionabile în ser fiziologic, sau colonii R, uscate, cu
margini crenelate, care se emulsionează greu şi neuniform în ser fiziologic. Uneori,
E. coli poate să determine şi colonii mucoide .
■ Mediul Istrate-Meitert
E. coli: determină colonii lactozo pozitive, varianta „S", opace, galbene,
individualizate chiar pe traseul de însămânţare; mediul special de cultură pentru E. coli este mediul Levine;
Geloză-sânge
E. coli: poate determina hemoliză incompletă, relativ restrânsă, fără legătură cu patogenitatea.
c. Caractere metabolice
E. coli (figurai3):
• fermentează glucoza cu producere de gaz în cantităţi moderate; acidifwă
partea înclinată a mediului TSI (lactoză/zaharoză pozitivă); nu produce H2S;
- este mobilă pe MIU; uree negativă; indol
pozitivă; lizindecarboxilază pozitivă;
ornitindecarboxilază variabilă; citrat
negativă;
• fenilalanină negativă.
d. Caractere antigenice
Această etapă se practică pentru: - E. coli enteropatogen (EPEC) care poate determina diareea
malignă a nou-născutului (până la vârsta de 2 ani).
Reacţia folosită în acest scop este reacţia de aglutinare pe lamă folosind trusa de seruri imune standard anti-E.
coli. Identificarea se realizează în 2 etape: aglutinarea cu serul polivalent anti-E. coli;
Tot pentru identificarea E. coli se poate folosi reacţia de imunofluorescenţă indirectă.

6. Diagnosticul de laborator al infectiilor stafilococice.

7. Reactia ASLO: pricipiu, interpretare, importanta practica medicala.
8. Secretia uretrala: rolul examenului direct microscopic in cadrul examenului de laborator
al uretritelor.
10. Diagnosticul de laborator in infectii cu E. Colli.

5
11. Diagnosticul de laborator in infectii cu Salmonella.
12. Diagnosticul de laborator cu Shigella.
13. Diagnosticul de laborator pentru sifilis.
14. Coprocultura cu bacterii conditionat patogene.
15. Coprocultura cu bacterii patogene.
16. Urocultura.