LP 3. EXAMENUL MICROSCOPIC ÎN INVESTIGAREA MICROORGANISMELOR.

CATEGORII MICROSCOPICE BACTERIENE

I. OBIECTIVE
1. Să manipuleze corect microscopul optic cu scopul de a depista si identifica
microorganismele;
2. Să poată efectua un preparat microscopic în laboratorul de microbiologie;
3. Să precizeze etapele coloraţiilor diferenţiale (Gram, Ziehl-Neelsen);
4. Să cunoască importanţa, avantajele şi dezavantajele examenului microscopic;
5. Să examineze şi să descrie caracterele microscopice ale bacteriilor pe un frotiu
examinat cu obiectivul cu imersie.

II. MICROSCOPUL este alcătuit din:

1. Partea mecanică (talpa, corpul ansamblului mişcărilor – braţ, suportul condensorilor,
masa port-obiect)
2. Sistemul optic (sistem de lentile – obiective, oculare, capul binocular)
3. Sistemul de iluminare (sursa de lumină, sistemul de dirijare a fasciculului de lumină
către preparat şi condensorul care focusează lumina pe preparat)

Puterea de mărire a unui microscop = produsul dintre puterile de mărire ale obiectivului,
ocularului şi capului binocular.

III. TIPURI DE PREPARATE MICROSCOPICE

1. Umede (native), necolorate – preparat lamă-lamelă

Indicaţii:
 Obiectivarea mobilităţii microorganismelor
 Observarea spirochetelor mobile (microscopia pe fond întunecat este metoda de
elecţie) şi a microorganismelor mai mari (fungi, protozoare).

2. Colorate (uscate, fixate, colorate) – frotiuri

Definiţie frotiu: materialul microbian (produs patologic, cultură bacteriană) etalat în strat
cât mai subţire şi uniform pe suprafaţa unei lame de microscop.
Etapele efectuării unui frotiu: etalare, uscare, fixare, colorare.
Indicaţii: evidenţierea caracterelor morfologice (formă, dimensiune, aşezare, structuri
speciale – capsulă, spori) şi eventual afinitatea tinctorială (colorații diferențiale).
Tipuri de coloraţii:
 Simple – albastru de metilen
 Diferenţiale – Gram, Zhiel-Neelsen
 Speciale – pentru evidenţiere flageli, spori, capsulă

1
Principiul coloraţiei: peretele bacterian nu este colorabil, dar prin structura sa chimică
condiţionează colorabilitatea protoplastului (citoplasmei). În coloraţiile diferenţiale
structura diferită a peretelui permite diferenţierea bacteriilor.

Coloraţia simplă cu albastru de metilen

 Utilizează un singur colorant
 Indicații:
1. evidenţierea caracterelor morfologice (formă, dimensiune, aşezare, structuri
speciale – capsulă, spori)
2. observarea celulelor inflamatorii și a celulelor epiteliale scuamoase
 Tehnica de colorare:
1. Frotiul se acoperă cu o soluție de albastru de metilen
2. Se menține 30-60 de secunde
3. Se spală cu apă de robinet
4. Se usucă și se examinează
5. Rezultat – toate elementele (bacterii, leucocite, etc) apar colorate în albastru

Colorația diferențială Gram

 Utilizează doi coloranți

 Indicații: evidenţierea caracterelor morfologice (formă, dimensiune, aşezare, structuri
speciale – capsulă, spori) şi afinitatea tinctorială
 Tehnică de colorare:
1. Colorarea
 Frotiul se acoperă cu o soluție de violet de metil
 Se menține 1 minut
 Se spală cu apă de robinet
2. Mordanțarea
 Frotiul se acoperă cu soluție Lugol, care după câteva secunde se varsă
 Se acoperă din nou cu soluție Lugol
 Se menține 2 minute
 Se varsă și, fără a se spăla, se trece la timpul următor
3. Diferențierea (decolorarea)
 Frotiul se acoperă cu amestecul alcool-acetonă și se dau ușoare mișcări de
înclinare lamei
 După circa 5 – 10 secunde frotiul se spală cu apă de robinet
4. Recolorarea
 Frotiul se acoperă cu o soluție de fucsină Ziehl diluată 1/10
 Se menține 30 secunde
 Se spală cu apă de robinet
 Se usucă și se examinează la microscop
Interpretare rezultat – bacteriile gram pozitive = violet, bacteriile gram
negative = roșii, leucocitele și celulele tisulare apar cu citoplasma roz și
nucleul roșu.

2
 Controlul de calitate al colorației Gram:
 Frotiu martor – suspensie care conține un amestec de bacterii gram pozitive și
bacterii gram negative (ex. coci gram pozitivi și bacili gram negativi)
 Pe frotiurile efectuate din produs patologic – leucocitele trebuie să fie roșii.
Surse de eroare: subdecolorarea, supradecolorarea.

Colorația diferențială Ziehl-Neelsen

 Utilizează doi coloranți

 Indicații: evidenţierea micobacteriilor (caracterelor morfologice şi afinitatea tinctorială
ale bacteriilor acido-alcoolo-rezistente).
 Tehnică de colorare:
1. Colorarea
 Frotiul se acoperă cu o soluție de fucsină Ziehl
 Încălzește (fără ca soluția să fiarbă) cu lampa de spirt până la emiterea de
vapori
 După răcire, se spală abundent cu apă de la robinet
2. Diferențierea (decolorarea)
 Frotiul se acoperă cu amestecul alcool-clorhidric și se decolorează până când
nu mai apar urme de colorant în soluție
 În final, după spălarea cu apă de robinet, frotiul trebuie să rămână alburiu
3. Recolorarea
 Frotiul se acoperă cu o soluție de albastru de metilen
 Se menține 30 secunde
 Se spală cu apă de robinet
 Se usucă și se examinează la microscop
Interpretare rezultat – bacteriile acido-alcoolo-rezistente (micobacteriile) = roșii,
bacteriile neacido-alcoolo-rezistente, leucocitele și celulele tisulare = albastre
Controlul de calitate al colorației Ziehl-Neelsen:
 Frotiu martor – suspensie care conține un amestec de bacterii acido-alcoolo-
rezistente și bacterii neacido-alcoolo-rezistente

Importanța medicală a colorației diferențiale:

 Reprezintă prima etapă în identificarea bacteriilor

 Orientează antibioticoterapia de primă intenție

Microscopia permite evidențierea detaliilor morfologice (formă, dimensiune, așezare, structuri

speciale) și afinității tinctoriale ale microorganismelor. Caracterele morfo-tinctoriale ale
microorganismelor permite încadrarea lor într-o categorie microscopică.

3
IV. Microscopia cu imersie și examinarea unui frotiu
Examinarea
 Pune o picătură de ulei de cedru pe preparat
 Fixează lama pe măsuța microscopului
 Adu în axul optic obiectivul cu imersie
 Ridică condensorul la maxim
 Acționează butonul mișcării grosiere – macroviza (privind lateral) pentru a ridica
masuța microscopului pentru a aduce în contact obiectivul cu uleiul de cedru de pe
lamă
 Coboară foarte încet măsuța microscopului, privind prin ocular, prin mișcarea
macrovizei în direcția opusă până la prinderea unei imagini
 Reglează claritatea imaginii (cu microviza)

La terminarea examinării:

 Îndepărtează obiectivul de preparat

 Ia lama de pe masa microscopului
 Îndepărtează complet uleiul de cedru
 Scoate obiectivul din ax
 Acoperă microscopul cu husa/pune-l în cutie

Descrierea frotiului – elementele trebuie descrise în termeni de:

1. Categoria microscopică a bacteriilor – formă, dimensiune, aşezare, structuri

speciale – capsulă, spori şi afinitatea tinctorială
2. Numărul lor
3. Raporturile cu celule din prelevatul patologic – celule inflamatorii, celule
epiteliale scuamoase

Exemple de desciere ale categoriilor microscopice:

Forma – coci, bacili; Variația formei – coci rotunzi (stafilococi), ovali (streptococi),
lanceolați (pneumococi), reniformi (neisserii); bacili cu capete rotunjite
(enterobacteriacee), cu capetele tăiate drept (Bacillus spp), cu capetele măciucate (bacili
difterici)
Așezare: în grămezi (stafilococi), în lanțuri (streptococi), în diplo (pneumococi,
neisserii), în litere chinezești (bacilii difterici)
Mărime relativă: mic, mare
Afinitate tinctorială: gram pozitiv, gram negativ, acido-alcoolo-rezistent, neacido-
alcoolo-rezistent
Prezența capsulei: pneumococi
Prezența sporului: forma – oval (clostridii), sferic (Clostridium tetani, Bacillus spp);
așezare – central (Bacillus spp), terminal (C. tetani), subterminal (clostridii),

4
dimensiune – mare, cu deformarea corpului celular (clostridii), mic, nedeformant
(Bacillus spp.).