LP. 8.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR

TRACTUSULUI RESPIRATOR INFERIOR.
IDENTIFICAREA STREPTOCOCILOR ALFA-HEMOLITICI.
I.

OBIECTIVE

S cunoasc condiia microbiologic a tractusului respirator inferior (TRI).

S cunoasc entitile nosologice i etiopatogenice.
S cunoasc agenii etiologici ai pneumoniilor acute i ai tuberculozei pulmonare.
S tie cum se realizeaz diagnosticul de laborator n pneumoniile acute i algoritmul de
identificare a streptococilor -hemolitici.
S tie cum se efectueaz diagnosticul de laborator n tuberculoza pulmonar, etapele identificrii
Mycobacterium tuberculosis.
II. CONDIIA ANATOMO-HISTOLOGIC A TRI
Tractusul respirator inferior (TRI): se extinde din etajul subglotic al laringelui pn la alveolele
pulmonare, via trahee, bronhii lobare, segmentare, lobulare, bronhiole.
Epiteliu de tip respirator (epiteliu pseudostratificat, ciliat, dublat cu un strat de mucus) acoper
mucoasa traheo-bronic.
III. CONDIIA MICROBIOLOGIC A TRI (vezi curs microbiota indigen)
Etajul infraglotic al TR este n permanen contaminat, dar necolonizat datorit unor mecanisme
de aprare eficiente. Care sunt mecanismele de aprare ale TRI?
IV. ENTITI NOSOLOGICE I CONDIII ETIOPATOGENETICE TRI
Infeciile TRI se manifest ca: traheit (trahee), traheobronit (trahee+bronhii), bronit (bronhii),
broniolit (bronhiole mici terninale si respiratorii), pneumonie cu alveolit, pneumonie interstiial,
pneumopatie cronic (pulmon).
V.

INFECII PULMONARE AGENI ETIOLOGICI

Pneumonia cu alveolit (pneumonia acut lobar) este determinat de bacterii condiionat

patogene care aparin florei comensale a TRS: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae,
Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoiae.
Pneumonia interstiial (pneumonia atipic primar) este determinat de patogeni primari care
includ virusuri (ex. virusuri gripale, paragripale), Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila spp.,
Coxiella burnetii, etc.
Tuberculoza pulmonar (pneumopatie cronic) este cauzat de Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum.
VI. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR N PNEUMONIA CU ALVEOLIT (pneumonia
lobar acut = pneumonie care evolueaz cu leziuni inflamatorii exsudative n alveole),
fiind determinat de bacterii obinuite se realizeaz prin metode directe presupune
examenul microbiologic al sputei

Prelevat: sputa.
1

Recoltare sput: sputa provine din cile respiratorii inferioare i se recolteaz prin tuse spontan i
profund.
Vezi LP 6, reguli de prelevare ale produselor destinate examenului microbiologic.
Cnd recoltm? Sputa se recolteaz dup igiena cavitii orale (cltirea gurii cu ap; NU past
de dini, ap de gur ce conin antiseptice), pentru reducerea contaminrii cu saliv.
Cum recoltm? Sputa se recolteaz n recipiente sterile, de aproximativ 100 mL, cu gura larg i
capac ermetic. n infeciile acute 1 prob de sput mucopurulent de 1-2 mL este suficient.
Transport: Proba de sput trebuie expediat imediat la laborator pentru a fi prelucrat n maxim 1
or de la prelevare.
Decontaminarea sputei: reprezint prima etap a prelucrrii i urmrete reducerea contaminrii
cu microorganisme orale. Aceasta se realizeaz prin splarea fragmentelor mucopurulente n 3 bi
succesive de ser fiziologic.
Examenul microscopic: efectum un frotiu colorat Gram i examinm mai multe cmpuri (sputa
este un produs neomogen); realizm triajul de calitate al probelor i bacterioscopia cantitativ.
Triajul de calitate (efectuat cu obiectiv uscat, la o putere de mrire de 100x, examinm 5-10
cmpuri i calculm scorul de calitate Q fundamentat de prezena fibrinei, numrul de
celule inflamatorii i numrul de celule epiteliale scuamoase vezi tabel). Probele cu un scor
Q de minim +1 au calitate corespunztoare pentru a efectua bacterioscopia cantitativ i a
continua diagnosticul.
Prezena fibrinei = +1
Numrul de celule/cmp
microscopic (mrire de 100x)
0
1-9
10-24
25

Celule inflamatorii
(CI)
0
0
+1
+2

Celule epiteliale
scuamoase (CES)
0
0
-1
-2

Bacterioscopia cantitativ (prin examen microscopic cu obiectiv cu imersie, la o putere de

mrire de 1000x) pe frotiurile cu scorul Q +1. Asocierea dintre CI i 10 bacterii din
aceeai categorie microscopic/cmp (ce corespunde la un numar de bacterii de 10 5 - 106
UFC/ml n sputa) o numim asociere semnificativ clinic.
De exemplu: CI i 10 coci gram pozitivi ovali, lanceolai (aspect de flacr de lumnare)
aezai n diplo, cu axul longitudinal n prelungire, privindu-se prin extremitile bombate,
capsulai, este semnificativ pentru o pneumonie pneumococic.
Cultivarea
Mediul de cultivare: agar-snge repartizat n plci Petri.
nsmnare: Se utilizeaz tehnica de nsmnare n 4 cadrane: se depune un fragment de sput n
primul cadran i apoi se epuizeaz cu ansa n celelalte 3 cadrane. Dup aceea, pe aceste 3 cadrane
se va depune o strie de Staphylococcus aureus (pentru a observa eventual fenomenul de satelitism la
stria de stafilococ, realizat de H. influenzae).
Incubare: 37C, aerob, pentru 24 ore.
Citirea culturilor: se urmrete prezena coloniilor cu cretere predominant i n numr mare.
(dac observm c domin coloniile mici, cenuiu-transparente, nconjurate de o zon larg de hemoliz pot fi pneumococi i trebuie identificai)
Identificarea izolatului cu semnificaie (vezi i schema de mai jos):
Caractere microscopice observate pe frotiul din coloniile suspecte coci gram pozitivi ovali,
aezai n perechi sau scurte lanuri
2

Caractere de cultur colonii mici, cenuiu-transparente, nconjurate de o zon larg de hemoliz, catalaz negative
IDENTIFICAREA STREPTOCOCILOR (vezi LP 7)
IDENTIFICAREA STREPTOCOCILOR ALFA-HEMOLITICI
Identificare prezumtiv: testul de sensibilitate la OPTOCHIN
Testarea sensibilitii la
OPTOCHIN

Streptococcus pneumoniae
Sensibil

streptococi viridans
Rezistent

Identificare definitiv: pe baza caracterelor antigenice cu seruri specifice (latex

aglutinare/reacie de umflare a capsulei cu seruri specifice anticapsulare). Pe baza antigenelor
capsulare se pot diferenia mai mult de 80 de serotipuri de Streptococcus pneumoniae.
Antibiograma: Streptococcus pneumoniae nu i-a pstrat sensibilitatea natural la penicilin.
Antibiograma este obligatorie. Se realizeaz antibiograma difuzimetric sau E-test.
Tratamentul antibiotic n pneumonia acut lobar este o urgen. Pn la venirea rezultatelor
se administreaz CEFTRIAXON de prim intenie.
ALGORITM DE IDENTIFICARE A STREPTOCOCILOR ALFA-HEMOLITICI
Cultivare cultura pur colonii mici, -hemolitice
Frotiu
Coci gram pozitivi
Testul catalazei
Negativ(-)
Pozitiv (+)
Streptococcus spp.
-hemolitici

-hemolitici

Staphylococcus spp.
-hemolitici

Identificare prezumtiv (vezi mai sus tabelul cu sensibilitatea la optochin)

Identificare definitiv (antigenic prin reacii Ag-Ac cu seruri de referin)
VII. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR N PNEUMONIA INTERSTIIAL (pneumonia
atipic primar = pneumonie care evolueaz cu leziuni inflamatorii n interstiiul
pulmonar), fiind determinat de virusuri sau de bacterii particulare (invizibile la
microscop i greu cultivabile, pe culturi de celule) se realizeaz n laboratoarele obinuite
prin metode indirecte = diagnostic serologic (detectarea anticorpilor vezi LP 6, criterii de
semnificaie clinic a anticorpilor).
Metoda rapid de diagnostic n gripa este detecia virusului gripal prin PCR direct n exsudatul
nazal sau nazofaringian.
Diagnosticul serologic n penumonia interstiiala se poate face prin RFC (reacia de fixare a
complementului) n care serul pacientului este pus n contact cu o barerie de antigene de
referin corespunztoare microorganismelor care dau pneumonie interstiial.
Diagnosticul serologic n grip - putem detecta anticorpii serici anti-virus gripal prin reacia
de inhibare a hemaglutinrii (RIH).
3

Principiu RIH: unele virusuri (ex. virusurile gripale) aglutineaz prin hemaglutininele de pe
peplosul lor hematiile umane sau animale (RH). Reacia este blocat de prezena anticorpilor
specifici n serul de testat (post-infecie sau post-vaccinare), n prezena antigenului omolog.
Exemplu:
Citire reacie (serurile pacientului, acut i convalescent), in diluii duble succesive, este
pus in contact cu hematiile test n prezena antigenelor de referin, in aceeai camtitate
in toate godeurile reaciei).
- Reacie negativ aglutinare a hematiilor test de catre hamaglutinina viral
(antigenul de referin)
- Reacie pozitiv hemaglutinare inhibat prin neutralizarea hemaglutininei
(antigenul introdus n reacie) de ctre anticorpii serici
Antigen de virus gripal tip A/Beijing/262/95 (A/H1N1)2000
Diluii ser
Ser I (ser acut)
Ser II (ser convalescent)

1/7
+
+

1/14
+
+

1/28
+

1/56
+

1/112
+

1/224
+

1/448
-

Antigen de virus gripal tip A/Sydney/15/97/ (A/H3N2)1999

Diluii ser
Ser I (ser acut)
Ser II (ser convalescent)

1/7
-

1/14
-

1/28
-

1/56
-

1/112
-

1/224
-

1/448
-

1/28
-

1/56
-

1/112
-

1/224
-

1/448
-

Antigen de virus gripal tip B/Shandong

Diluii ser
Ser I (ser acut)
Ser II (ser convalescent)

1/7
+
+

1/14
-

Diagnostic: infecie cu virusul gripal A/H1N1 (dinamic semnificativ a anticorpilor serici n

serul II fa de serul I)
VIII. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR N TUBERCULOZA PULMONAR
(pneumopatie cronic) se realizeaz prin metode directe presupune examenul
microbiologic al sputei
Prelevat: sputa
Recoltare sput: se recolteaz prin tuse spontan i profund, de la pacient cooperant.
Vezi LP 6, reguli de prelevare ale produselor destinate examenului microbiologic.
Cnd recoltm? Sputa se recolteaz dup igiena cavitii orale (mai puin important decat
pentru penumonia lobar).
Cum recoltm? Sputa se recolteaz n recipiente sterile, de aproximativ 100 mL, cu gura larg i
capac ermetic. Se recolteaz toat sputa pe care pacientul o poate expectora. Se recolteaz 3 probe
matinale, 3 zile consecutiv.
Transport: Proba de sput trebuie expediat imediat la laborator. Proba se poate conserva la
frigider pn la prelucrare. Prelucrarea se face n hote de siguran microbiologic (pentru
impiedicarea contaminrii celui care lucreaz proba).
Prelucrarea sputei pentru diagnosticul tuberculozei are unele particulariti, legate de structura
agentului etiologic urmrit. Bacilii tuberculozei sunt patogeni primari (nu se gsesc n mod normal
n sput), care sunt rari si neuniform repartizai n sput. De aceea se recolteaz o cantitate mai mare
i mai multe probe de sput. Rezistena lor la agenii de decontaminare face posibil
decontaminarea chimic a sputei, care omoar toate bacteriile cu cretere rapid, n vederea
cultivrii acestor specii cu cretere lent.

Decontaminarea: se realizeaz chimic, prin tratare cu soluie NaOH 4%, timp de 30 minute. Dup
centrifugarea i neutralizarea probei, sedimentul este folosit pentru examenul microscopic i pentru
cultivare.
Examenul microscopic: efectum din sput sau din sediment frotiuri colorate Ziehl-Neelsen i
examinm 100 300 de cmpuri.
Bacterioscopia pozitiv - prezena bacililor acido-alcoolo-rezisteni (BAAR) bacili lungi, subiri,
filamentoi, care se aeaz n litere unghiulare, roii stralucitori pe fondul albastru al preparatului,
nesporulai, necapsulai = stabilete diagnosticul de tuberculoz pulmonar
Bacterioscopie negativ nu exclude diagnosticul.
Metode rapide de diagnostic direct - PCR cu detcia genelor specifice M. tuberculosis direct n
sput sau in LCR (n suspiciunea de tuberculoz meningiana) i cu detecia simultan a genelor de
rezisten la HIN i RIF, este metoda modern care perminte diagnosticul rapid al tuberculozei i
orientarea terapiei specifice, dar este accesibil numai laboratoarelor dotate din centrele de referin.
Cultivarea
Mediul de cultivare: Lwenstein-Jensen repartizat n tuburi nchise ermetic (patogen respirator cu
cretere lent)
Incubare: 37C, aerob, pentru 3-8 sptmni, dac este necesar pn la 90 de zile.
Citirea culturilor: dup 2-3 sptmni se urmrete prezena coloniilor R, rugoase, conopidiforme,
uscate, de culoare crem-bej.
Bacilii tuberculozei (bacterii inalt patogene ce aparin genului Mycobacterium):
Mycobacterium tuberculosis (bacilul lui Koch)
Mycobacterium bovis
Mycobacterium africanum
Identificare Mycobacterium tuberculosis:
PREZUMTIV
Caractere microscopice BAAR (bacili roii pe fond albastru), nesporulai, necapsulai,
filamentoi, subiri, lungi, care se aeaz n litere unghiulare n produsul patologic sau paralel n
corzi flexuoase pe frotiul din cultur (tulpini virulente);
Caractere de cultur colonii R, rugoase, conopidiforme, uscate, de culoare crem-bej.
DEFINITIV
Caractere biochimice
Caractere genetice (PCR, hibridizare)
Antibiograma: fiind o bacterie cu cretere lent se realizeaz printr-o variant a metodei diluiilor
numit metoda concentraiilor absolute.
Antituberculostatice de prim linie:
- IZONIAZIDA (HIDRAZIDA ACIDULUI IZONICOTINIC)
- PIRAZINAMID
- ETAMBUTOL
- RIFAMPICIN
- STREPTOMICIN