21.09.

2010

MICROBIOLOGIA SI DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR MENINGOSI GONOCOCICE

Clasificarea (Bergey's 2001) :

Familia Neisseriaceae Genurile - Neisseria, Kingella, Chromobacterium, Aquaspirillum Genul Neisseria include dou specii patogene umane importante N. gonorrhoeae i N.meningitidis (neisserii pretenioase). Specii comensale, gzduite pe mucoasele tractului respirator i digestiv, conjunctiv, vagin, uretra distal (neisserii nepretenioase): Neisseria flava; Neisseria flavescens; Neisseria subflava; Neisseria perflava; Neisseria lactamica; Neisseria mucosa; Neisseria pharyngis; Neisseria polysaccharea; Neisseria sicca; Neisseria sp. In unele condiii se pot comporta ca patogeni oportuniti.

Caractere generale ale genului Neisseria - Coci gramnegativi, asociai n diplococi, uneori tetrade, imobili - Bacterii carboxifile, cu metabolism respirator - Catalazo- i oxidazo-pozitive - Sunt gzduite pe mucoasele omului i animalelor - Speciile patogene sunt exigente la cultivare

Neisseria meningitidis

1884 - Marchiafava si Celli observ diplococi gramnegativi n LCR al unui pacient cu meningit 1887 - Weichselbaum izoleaz bacteria din LCR i demonstreaz rolul ei etiologic Bacterie strict uman care colonizeaz rinofaringele la un numar mare de purttori sntoi (5-30%). Portajul poate avea o durat de la cteva zile la cteva luni. In unele cazuri i cu frecven redus este capabil s provoace septicemie i/sau o meningit cerebrospinal.

Caractere morfobiologice
N.meningitidis se prezint sub form de coci imobili, gram-, in frotiu se aranjeaz in diplococi cu suprafeele adiacente aplatizate sau puin concave (aspect riniform, de boabe de cafea). Posed capsul i fimbrii.

21.09.2010

Structura antigenic a N.meningitidis 1. Ag polizaharidice capsulare permit caracterizarea a 13 serogrupe: A, B, C, D, X, Y, Z, 29E, W135, H, I, K et L. Mai frecvent intlnite sunt serogrupele A, B, C, Y i W135. 2. Ag proteice din membrana extern (cinci proteine majore) permit distincia tipurilor serologice 3. Ag lipo-oligozaharidice (serotipuri) Aceste antigene servesc n calitate de markeri epidemiologici.

Caractere de cultur N.meningitidis este un mi/o carboxifil, foarte exigent la cultivare. Se cultiv doar pe medii mbogite cu snge sau ser - geloz-ser, geloz-snge, geloz-ciocolat, mediul Mueller-Hinton - i prenclzite n termostat. Coloniile S, mici (1-2 mm), cu marginile netede, bombate, translucide apar peste 24-48 ore de incubare la 37 C n atmosfer umed mbogit cu 5-10% CO2.

Activitate biochimic N.meningitidis posed catalaz i oxidaz, scindeaza glucoza i maltoza fr a produce gaz. Rezistena n mediul extern: N.meningitidis este o bacterie deosebit de fragil, sensibil n special la desicare, radiaii solare, variaii de pH i refrigerare; temperaturi sub 37 C determin autoliza bacteriilor.

1. 2. 3.

4.

5.

Factorii de patogenitate Adezine (fimbriile i proteine ale ME) Capsula rol antifagocitar sIg A-proteaza descompune sIg A de pe mucoase Endotoxina declaneaza secreia diferitor citokine Receptori i captatori de Fe (receptori membranari pentru transferin i lactoferin, care permit captarea directa a Fe din aceste substane, precum i extragerea lui direct din hemoglobin)

Epidemiologia infectiilor meningococice Sursa de infecie bolnavii cu meningit sau rinofaringit meningococic sau purttorii de germeni Transmiterea aerogen, prin picturi Pflugge, prin obiecte contaminate (jucrii) exceptional Patogeneza infectiilor meningococice Meningococul ader la epiteliul rinofaringelui, provocnd sau o infecie local (rinofaringita), sau o infectie inaparent. In caz de diminuare a rezistenei organismului, bacteria trece n submucoas i apoi n circulaia sanguin general (meningococcemia). Aceast translocaie este favorizat de inflamaii rinofaringiene, n special virale.

21.09.2010

In circulaia general, graie capsulei, bacteria este protejat de mijloacele de rezisten a organismului. Prin tropism pentru celulele plexului choroid, meningococul ader la acest nivel i, prin translocaie, trece n spaiul meningean, inducnd meningita cerebrospinal. Odat cu dispariia anticorpilor materni, N. meningitidis devine principala bacterie responsabil de meningite la nou-nscui. Ulterior, imunitatea antimeningococic se instaleaz progresiv i frecvena meningitelor meningococice diminueaz.

Formele clinice de infectii meningococice 1. Rinofaringita (forma clinic cea mai frecvent, deseori asimptomatic) 2. Septicemia (meningococcemia). Reprezint etapa a doua a maladiei. Complicaii: meningococcemie fulminant (sindromul WaterhouseFriderichsen) n 10 - 20 % de cazuri (oc endotoxinic, purpur extensiv indus de coagulopatie de consumare (coagulare intra-vascular diseminat).

21.09.2010

3. Meningita cerebrospinal epidemic. Este precedat de o faringit i nsoit de bacteriemie. Este caracterizat prin febr nalt, cefalee, vom, fotofobie, hiperestezie cutanat. Poate fi prezent poziia caracteristic n "coco de puc" dat de sindromul de contractur. Frecvent se ntlnete herpesul labial, peteii cutanate sau artralgii. Afectarea sistemului nervos se face n grade variabile, cu delir, agitaie psihomotorie, somnolen, uneori com, pareze i paralizii, convulsii. Evoluia n absena tratamentului se face spre deces n 80-90% din cazuri, restul prezentnd sechele grave.

4. Alte forme: infecii bronhopulmonare,

endocardite, pericardite, osteomielite, artrite (determinate de formarea de complexe imune), conjunctivite, angine.

Diagnosticul de laborator al infectiilor meningococice

Prelevate: in funcie de forma clinic se prelev exsudatul nasofaringean, snge pentru hemocultur, LCR, lichidul articular, etc. Probele se prelev nainte de a se administra antibiotice i se transport rapid la laborator, ferite de variaii de temperatur i lumin. La necesitate se utilizeaz mediul de transport Stuart.

Diagnosticul direct

Examenul LCR este primordial pentru diagnosticul meningitei. Prelevat n condiii aseptice prin puncie lombar, n volum de 4-6 ml n 2 eprubete de centrifug. LCR este tulbure, conine mii sau zeci de mii de elemente celulare, cu predominana de 95-100% a neutrofilelor. Aceast reacie celular este insoit de hipoglicorahie, de hiperalbuminorahie i pH acid prin acumularea de acid piruvic i lactic. I. Examenul microscopic al sedimentului LCR a) Frotiuri colorate cu albastru de metilen sau Gram: diplococi Gram-negativi riniformi n pozitie intra i extracelular, dar densitatea bacterian este sczut, i examenul este negativ n 1/3 cazuri. Prezena leucocitelor n numr mare pledeaz pentru un prognostic favorabil. b) RIF

21.09.2010

II. Examenul bacteriologic Sedimentul din LCR se nsemneaz pe medii de cultur mbogite, cum sunt geloza-snge, geloza-ciocolat, mediul Mueller-Hinton prenclzite la 37 C. Exsudatul nazofaringean se nsemneaz imediat dup recoltare pe medii cu adaos de antibiotice (lincomicin, vancomicin, ristomicin) pentru inhibarea altor specii microbiene existente n exsudat. Sngele pentru hemocultur se nsemneaz direct pe medii de cultur lichide (bulion glucozat 2% respectnd proporia de 5 % snge). Examinrile se fac zilnic timp de 57 zile prin subculturi. Identificarea i diferenierea de neisseriile comensale se bazeaz pe aspectul morfologic pe frotiuri colorate Gram, prin testul oxidazei care este pozitiv, scindarea numai a glucozei i maltozei, identificarea serologic prin RA cu seruri imune specifice de grup.

III. Decelarea direct n snge i LCR a antigenelor polizaharidice capsulare, utiliznd reaciile de contraimunoelectroforez, ELISA, latex i coaglutinare cu antiseruri specifice de grup. IV. Detectarea acizilor nucleici Diagnosticul indirect Diagnosticul serologic. Pot fi titrai Ac antimeningococici utiliznd RA sau RHAI. Are valoare diagnostic redus Tratamentul trebuie instituit extrem de urgent, imediat dup internare i efectuarea punciei lombare. Tratamentul etiotrop const n administrarea de antibiotice timp de 7-10 zile: penicilin G, ampicilin, cloramfenicol, cefalosporine.

Profilaxia specific: imunizare activ cu vaccin polizaharidic antimeningococic monovalent sau polivalent (A, C, Y, W), care se poate administra intradermic sau subcutanat, dup vrsta de 3 luni (pentru grupul A), oferind protecie de 95 -100% pentru o durat de 2-3 ani; polizaharidul capsular de grup B este un homopolimer al acidului sialic i nu este imunogen pentru oameni. Contacii vor fi supravegheai clinic timp de 10 zile. Chimioprofilaxia (rifampicin, ciprofloxacin, ceftriaxon) se aplic n familii sau n colectiviti de precolari Purttorii, depistai n focar, vor fi tratai.

Cazurile de meningit sau meningococcemie vor fi declarate n 24 de ore de la depistare

MICROBIOLOGIA I DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL GONOREEI Gonoreea este o uretrit specific, cu eliminare masiv de puroi, mai aparent la barbati dect la femei. Termenul "gonoreea", a fost utilizat prima data de Galen n secolul II i nseamn scurgerea seminei". Multe secole gonoreea i sifilisul erau confundate. Paracelsus (1530) credea ca gonoreea este un simptom precoce al sifilisului. Aceasta confuzie a fost ntrit de medicul englez John Hunter, n 1767. Hunter intenionat i-a inoculat puroi de la un bolnav cu simptome de gonoree, mbolnavindu-se de sifilis! Agentul cauzal al gonoreei, Neisseria gonorrhoeae, a fost descris pentru prima oar de A. Neisser n 1879 n puroi de la un bolnav de gonoree. Mi/o a fost izolat n cultur pur n 1882 de ctre Loeffler pe ser coagulat i rolul su etiologic a fost stabilit ulterior pe voluntari umani (conform postulatelor lui Koch).

Neisseria gonorrhoeae Caractere morfobiologice Neisseria gonorrhoeae este un coc gramnegativ, cu diametrul de 0.6 - 1.0 m, uzual observat n perechi cu suprafeele concave alturate. In prelevate patologice (puroi, exsudate) se localizeaz frecvent intracelular n leucocite polimorfonucleare (neutrofile). Imobil, posed capsul i fimbrii cu lungimea de civa micrometri. n funcie de prezena fimbriilor se cunosc patru tipuri de N. gonorrhoeae : T1, T2, T3, T4

21.09.2010

Caractere de cultura Gonococul este exigent la cultivare. Pentru izolarea lui se utilizeaz medii mbogite cu ser sangvin, extract de drojdii, lichid ascitic, etc (mediul HYL, Thayer-Martin, geloz-ciocolat). Culturile cresc la 35-36 C n atmosfer umed cu 5-10 % CO2. Peste 24-48 ore apar colonii mici (0,5-1mm), netede, translucide. Dup aspectul coloniilor pot fi descrise 4 tipuri: - Colonii de tipul I i II apar la izolare, corespund tulpinilor virulente, purttoare de pili (fimbrii), - Colonii de tipul III i IV, apar la repicare, mai mari, corespund tulpinilor fr pili

Structura antigenic - 3 proteine majore din ME (PI/ Por, PII/ Opa, PIII) definesc multiple serotipuri (variante). PII prezint o mare variabilitate antigenic, chiar n interiorul unei tulpini. - Lipopolizaharidul din ME - Proteina fimbriilor, cu o mare diversitate antigenic Caractere biochimice: gonococii sunt oxidazo-pozitivi, scindeaza doar glucoza pna la acid, nu atac maltoza

Factorii de patogenitate 1. Adezinele (fimbriile PilE, unele proteine din membrana extern PII/Opa). Opa de asemenea induce transcitoza gonococilor n celulele epiteliale. 2. IgA-proteaze, cu rol in colonizarea mucoaselor 3. Proteine ale ME (PI/Por), care inhib formarea fagolizosomei (supravieuirea i multiplicarea gonococilor n fagocite) 4. Endotoxina (rezisten la complement, secreia citokinelor) 5. Sisteme de captare a Fe (receptori membranari pentru transferin i lactoferin) 6. Variaia antigenic rapid a fimbriilor de adeziune i a proteinei Opa (conversie, hipermutaie, transformare) 7. Capsula din acid sialic

21.09.2010

Designation Location PilE P.II (Opa) P.I (Por) LOS major fimbrial protein outer membrane protein outer membrane porin

Contribution initial binding to epithelial cells contributes to invasion may prevent phagolysosome formation in neutrophils and/or reduce oxidative burst

outer membrane elicits inflammatory response, triggers lipooligosaccharide release of TNF outer membrane protein outer membrane receptors for transferrin outer membrane receptor for lactoferrin elicits formation of ineffective antibodies that block bactercidal antibodies against P.I and LOS iron acquisition for growth

P.III (Rmp) Tbp1 and Tbp2 Lbp

iron acquisition for growth

Epidemiologia infeciei gonococice

Rezistena n mediul extern N. gonorrhoeae este un mi/o fragil, sensibil la variaii de temperatur, desicare, raze UV i alte condiii ale mediului extern. Gonococul este inhibat de bumbacul din tampoane (hipoclorit...). Pentru prelevri sunt indicate tampoane cu alginat de Ca sau din dacron.

Sursa de infecie unica surs este bolnavul cu gonoree, n special cu infecie inaparent Transmiterea la maturi exclusiv prin contact sexual; - la nou-nscut la trecerea prin canalul de natere al mamei bolnave

Patogeneza infeciilor cauzate de N.gonorrhoeae Infecia gonococic este n general limitat la mucoasele cu epiteliu columnar. Mai frecvent implicat este uretra, cervixul, rectul, faringele i conjunctiva. Epiteliul scuamos al vaginului nu este sensibil la infecia cu N. gonorrhoeae. Totui, la fetie gonococul poate provoca vulvovaginite. Infeciile mucoaselor sunt caracterizate uzual prin secreii purulente. Patogeneza gonoreei Prin intermediul fimbriilor i a unor proteine din ME (Opa) gonococii ader la vilozitile celulelor epiteliale columnare neciliate.

21.09.2010

Urmeaz penetrarea lor n celul (prin endocitoz), apoi vacuola este transportat la baza celulei, unde bacteria este eliberat prin exocitoz n esutul subepitelial.

Pe parcursul infeciei, lipopolizaharidul bacterian (LPZ/LOZ) i peptidoglicanul sunt eliberate prin autoliza celulelor. Ambele substane activeaz complementul pe calea alternativ , LPZ de asemenea stimuleaz producia factorului de necroz a tumorilor (TNF), care provoac distugerea celulelor. Neutrofilele sunt imediat atrase n focar i inglobeaza bacteriile. Muli gonococi sunt capabili s supravieuieasca n interiorul fagocitelor pn la moartea lor, cu eliberarea bacteriilor ingerate.

Particularitaile gonoreei la brbai In majoritatea cazurilor decurge acut (8595%), fiind manifestat clinic: 1. Uretrita (secreie uretral alb galbuie, durere i usturime la mictiune, dizurie) 2. Prostatita 3. Orhita 4. Epididimita

21.09.2010

Particularitile gonoreei la femei In majoritatea cazurilor infecia decurge asimptomatic (80% de cazuri), cu evoluie spre cronicizare. Formele clinice: 1. Cervicita (cu sau fr leucoree) forma cea mai frecvent 2. Uretrita 3. Bartolinita 4. Salpingita (pericol de sterilitate, graviditate extrauterin) 5. Ovarita 6. Endometrita 7. Peritonita

Alte forme clinice: Faringita i proctita gonococic Diseminarea infeciei gonococice (1-3%) determin artrite, leziuni cutanate, septicemii, endocardite, meningite. Tulpinile de N. gonorrhoeae care cauzeaza infecii diseminate sunt uzual rezistente la complement i la reacia bactericid a serului. La nou-nscut conjunctivita purulent cu extinderea rapid a infeciei la globul ocular (ophtalmia neonatorum) poate fi urmare a contaminrii la trecerea prin canalul de natere

Diagnosticul de laborator al gonoreei

Prelevate: - La brbai - secreiile uretrale - La femei - secreiile uretrale, vaginale, din endocol sau orificiile glandelor vulvare - Pot fi examinate coninutul leziunilor cutanate, exsudat articular, nasofaringean, snge, puroi din conjunctiv, LCR, tampon rectal. Pentru recoltarea acestor secreii se foloseste un tampon de alginat de Ca (sau ansa bacteriologic), care este apoi trimis imediat n laborator pentru testare (dupa necesitate se foloseste mediul de transport Stuart cu tioglicolat i crbune activat).

Daca eliminrile sunt srace, se procede la stimularea secreiei (reactivare, provocare): Alimentar (cu bauturi alcoolice bere) Chimic (instilaii cu nitrat de Ag sol. 1% in uretr, 10% n colul uterin) Biologic (inocularea gonovaccinului, recoltarea secreiilor imediat dupa menstre la femei) Mecanic (masaj al prostatei) Termic (diatermie sau inductotermie)

21.09.2010

1.

Metodele de diagnostic Examenul microscopic (elocvent doar n cazul uretritelor acute la brbai). In frotiuri din puroiul uretral colorate Gram sau cu albastru de metilen se observ diplococi gram- situai intra- sau extracelular. RIF

Examenul bacteriologic (este obligator n forme asimptomatice sau cronice) Gonococul fiind o bacterie foarte fragil, este obligator de a nsmna imediat prelevatele sau de a utiliza un mediu de transport adaptat. Pentru izolare se folosesc medii mbogatite (ex.: mediul Thayer-Martin, care este bogat n factori de cretere i conine antibiotice (vancomicina, colistina, amfotericina) care inhib alte bacterii din prelevat, geloza-ciocolata). Coloniile apar peste 18 - 24 h de incubare in atmosfer cu CO2. Identificarea N.gonorrhoeae se efectueaz n baza caracterelor morfotinctoriale, aspectul coloniilor crescute pe medii selective, oxidaza +, scindarea doar a glucozei pn la acid. Seroidentificarea cu Ac monoclonali n reacia de co-aglutinare.

Depistarea direct a N. gonorrhoeae n prelevate poate fi realizat prin tehnici ELISA sau RIF Detectarea acizilor nucleici prin hibridare sau amplificare genic

Examenul serologic (serodiagnosticul) - RFC

Tratamentul gonoreei Antibiograma este indispensabil unui tratament eficient! - Peniciline - Cefalosporine de generaia III - Fluorochinolone - Cotrimoxazol Profilaxia gonoreei - Nespecifica (individual sau general) - Prevenirea oftalmiei gonococice se efectueaza prin instilarea intraconjunctival la nou-nscui a soluiei 1% de nitrat de Ag

10