SUBIECTE PRACTICE IMUNOLOGIE 2017-2018

A. WIDAL
 PRINCIPIUL TEHNICII: Aceasta reactie este utilizata in examenul serologic al pacientilor care
prezinta febra tifoida si/sau paratifoida, produsa de Salmonella Typhi si/sau Paratyphi.
a) Aglutinare de tip H (hauch=val): produsa de o suspensie de celule bacteriene flagelate in cursul careia
se formeaza flocoane bacteriene mari si laxe; *Atg flagelare aglutineaza (flagelii lor bacterieni) interactioneaza
cu Atc specifici.
b) Aglutinarea de tip O sau somatica (ohne hauch=fara val): produsa de bacteriile imobile; se formeaza
conglomerate celulare dense, compacte, in care celulele bacteriene reactioneaza prin intermediul Atg somatice
reprezentate de LPS (lipopolizaharide= componente majore ale suprafetei celulelor Gram-). *Atg somatice
interactioneaza cu Atc specifici serici.

 ELEMENTELE REACTIEI:
– Atg standardizate O, H;
– Suspensie celulara alcoolata O (500 mil cel/ml) si
– Suspensie celulara formolata pentru H (500 mil/ml);
– Dilutii seriate ale serurilor de la bolnavi.

 TEHNICA DE LUCRU:
– Se fac dilutii binare succesive din serul bolnavilor;
– Se incubeaza la 37˚C, timp de 24h;
– In paralel se fac 2 martori: Antigen O + ser fiziologic; Antigen H + ser fiziologic.

 INTERPRETAREA REZULTATELOR
 TITRUL aglutinant al serului = inversul celei mai mari dilutii care produce o aglutinare acceptabila.
Ex: daca dilutia de 1/512 a serului produce o aglutinare evidenta:
 la dilutia imediat urmatoare (1/1024) aglutinarea = absenta
 titrul aglutinant este de 512U,
= serul imun contine 512 unitati aglutinante.
– Titrul aglutinant – exprima in numar de unitati aglutinante de Atc/unitatea de volum.
– Se apreciaza ca numai o crestere progresiva a titrului acestor Atc pledeaza pentru febra tifoida; o
determinare unica chiar cu titru ridicat, nu ofera nici o siguranta pentru diagnostic, din cauza prezentei unor Atc
la persoanele vaccinate sau la cele care au avut anterior o infectie oculta.
– Valoare diagnostica prezinta aglutininele O, in timp ce aglutininele H persista dupa vaccinare si au
semnificatie redusa.

 APLICATIILE TEHNICILOR:
– Investigarea sugarilor, copiilor de varsta mica;
– Investigarea persoanelor sigur nevaccinate.

B. Weil-Felix
 PRINCIPIUL TEHNICII: Aceasta reactie este utilizata in examenul serologic al pacientilor care
prezinta tifos exantematic, produs de Rickettsia prowazekii.

1
  ELEMENTELE REACTIEI:
– Dilutii seriate ale serurilor de la bolnavi;
– Atg standardizate: Proteus OX-19, OX-2, OX-K.

 TEHNICA DE LUCRU:
– Se fac dilutii binare succesive din serul bolnavilor;
– Se incubeaza la 37˚C, timp de 24h;
– In paralel se fac martori: Antigen + ser fiziologic.

 APLICATIILE TEHNICILOR:
– Investigarea persoanele cu Tifos exantematic.

C. Wright
 PRINCIPIUL TEHNICII: Aceasta reactie este utilizata in examenul serologic al pacientilor care
prezinta bruceloza, produsa de Brucella.

 ELEMENTELE REACTIEI:
– Atg standardizate: Atg B;
– Dilutii seriate ale serurilor de la bolnavi.

 TEHNICA DE LUCRU:
– Se fac dilutii binare succesive din serul bolnavilor;
– Se incubeaza la 37˚C, timp de 24h;
– In paralel se fac martori: Antigen + ser fiziologic.

 APLICATIILE TEHNICILOR:
– Investigarea persoanelor cu Bruceloza.

IDENTIFICAREA FACTORULUI REUMATOID (FR) PRIN REACTIA LATEX-

AGLUTINARE

 PRINCIPIUL TEHNICII: Particulele de polistiren-latex, învelite cu IgG denaturate sunt aglutinate de

serurile de bolnav care conţin factor reumatoid. Reacţia poate fi efectuată pe lamă sau în tuburi.

 ELEMENTELE REACTIEI:
– ser de cercetat - se folosesc uzual seruri proaspete; plasma; serul lipemic sau contaminarea microbiană
pot cauza rezultate eronate.
• Dacă nu este posibilă efectuarea imediată a testului se va stoca serul maximum pentru 72 ore la + 2
până la + 8° C. Pentru o depozitare prelungită, se stochează prin congelare.
– reactiv latex-lgG - este constituit dintr-o suspensie apoasă de particule de latex-polistiren sensibilizate
(încărcate) cu imunoglobuline IgG umane denaturate;
– control pozitiv - ser uman care prezintă FR;
– control negativ - ser uman fără FR.

 TEHNICA DE LUCRU:

2
 – se pipetează pe rând în câmpurile aflate pe plăcuţa de reacţie câte o picătură (50 microlitri) din următorii
reactanţi: control pozitiv, control negativ, proba de ser de bolnav;
– se adaugă în fiecare câmp câte o picătură din reactivul latex;
– se amestecă reactanţii, uşor, în fiecare câmp cu ajutorul unei baghete;
– se roteşte plăcuţa 2 minute şi se citeşte imediat reacţia.

 INTERPRETAREA REZULTATELOR:
– Reacţia - = aspect lăptos al omogenatului, fără aglutinare; acelaşi aspect la controlul negativ.
– Reacţia + = apariţia grunjilor (aglutinare prezentă) la periferia şi în mijlocul omogenatului, care
devine clar; aspect identic la controlul pozitiv.

 APLICATIILE TEHNICILOR

HAP
Hemaglutinarea pasiva este o metoda imunoserologica deosebit de sensibila, prin care se pot evidentia
cantitati minime de anticorpi de diferite tipuri.

 PRINCIPIUL TEHNICII: In cazul reactiei HAP antigenele sunt fixate pe eritrocite cu ajutorul unor
agenti de legare; aglutinarea acestor particule (eritrocite) invelite cu Atg de catre Atc specifici este considerata
ca un proces indirect, de aceea reactia este numita hemaglutinare indirecta sau pasiva.

 ELEMENTELE REACTIEI:
1. Serul de cercetat din care se efectueaza dilutii binare succesive:
– serul I recoltat la debut;
– serul II recoltat in convalescenta;
– serurile se inactiveaza la 56°C, 30 min – pentru denaturarea complementului si a evita hemoliza.
2. Atg standard cunoscut;
3. Eritrocite de oaie.

 TEHNICA REACTIEI:
– Se efectueaza dilutii binare din serurile de testat;
– Se adauga la fiecare dilutie Atg de lucru;
– (înainte de realizarea reactiei propriu-zise se obtine antigenul de lucru: la 4 ml de Atg standard se
adauga 0,1 ml eritrocite de oaie → incubare de o ora la 37°C → centrifugare → se retine sedimentul din care se
pregateste suspensia necesara);
– INCUBARE 24 ore la 37°C.
– MARTORII REACTIEI HAP:
o Martor de Atg : Atg + diluent → hemaglutinare absenta
o Martor de E : E + diluent → hemaglutinare absenta
o Martor de ser sigur + : ser cu Atc hemaglutinanti pasivi + Atg de lucru → hemaglutinare prezenta
o Martor de ser sigur - : ser fara Atc hemaglutinanti pasivi + Atg de lucru → hemaglutinare absenta

 INTERPRETAREA REZULTATELOR: VEZI DESENELE DIN PP!

 APLICATIILE TEHNICILOR:

3
 – Diagnosticul serologic al rujeolei;
– În vederea titrarii anticorpilor anti-virus vaccinia la populatia vaccinata antivariolic (testarea eficacitatii
vaccinarii antivariolice);
– Bolile autoimune (pentru depistarea auto-anticorpilor anti-tiroglobulina, anti-histone);
– Diagnosticul serologic al tifosului exantematic si al malariei;
– In endocrinologie (detectarea, an-ticorpilor anti-tiroglobulina).

HAI
Reacţia de inhibare a hemaglutinării face parte din reacţiile care testează pierderea capacităţii de manifestare
a unor efecte virus-specifice în prezenţa unui ser imun specific. Reacţia HAI este utilizată frecvent pentru a
detecta prezenţa Atc faţă de un virus hemaglutinant, în serul unui pacient suspectat de o infectie cu virus
specific.

 PRINCIPIUL TEHNICII: Reacţia HAI folosită în viroze se bazează pe capacitatea anumitor virusuri,
cum sunt myxovirusurile sau virusul rujeolos (paramyxovirus) de a determina aglutinarea eritrocitelor
(hemaglutinare) prin intermediul unor componente din structura virusului.

 ELEMENTELE REACTIEI:
1. Serurile de testat:
– serul I de debut;
– serul II de convalescenta (in care cautam Atc inhibanti ai hemaglutinarii).
+
2. Antigenul standard (tulpini standard de virus gripal); înainte de folosire în reacţie, Atg viral standard va
fi titrat!
Serul va fi supus unui tratament pentru îndepărtarea inhibitorilor naturali ai hemaglutinării, cu RDE (enzima
distrugatoare de receptori).
– la 1 volum de ser (0,1ml) se adauga 4 volume (0,4ml) RDE
– urmeaza inactivarea 30 min la 56º C.
+
3. Suspensia de eritrocite (eritrocite de cocoş în tampon Alsever).

 TEHNICA DE LUCRU:
– se efectuează diluţii binare din serul de cercetat în soluţie tamponată izotonă; în fiecare godeu se pune
câte 0,2 ml;
– se adaugă la fiecare diluţie Atg reprezentat de virusul standard titrat (4 UH) (Atg viral standard se
titreaza pentru a determina cantitatea minima si suficienta de Atg care trebuie introdusa in reactie, capabila sa
determine aglutinarea hematiilor) în cantitate de 0,2 ml/godeu;
– INCUBARE 30 min la t camerei;
– se adaugă în fiecare tub (godeu) 0,4 ml din suspensia de eritrocite 0,5%
– REINCUBARE la t camerei timp de 60 min.
– MARTORII REACTIEI HAI:
In afara seriei de diluţii din ser, în reacţie vor fi introduşi următorii martori:
o Martor virus standard : virus + eritrocite => hemaglutinare prezentă;
o Martor ser normal : ser normal (fără Atc hemaglutinino-inhibanţi) + virus standard + eritrocite =>
hemaglutinare prezentă;
o Martor ser sigur pozitiv : ser sigur pozitiv + virus standard + eritrocite => hemaglutinare absentă;

4
 o Martor ser de testat : (ser de testat, fără virus standard, dar cu eritrocite) => hemaglutinare absentă;
o Martor de eritrocite : eritrocite în tampon PBS => hemaglutinare absentă.

 INTERPRETAREA REZULTATELOR:
Titrul Atc hemaglutinino-inhibanti ai serului este reprezentat de diluţia cea mai mare din serul de cercetat la
care se mai noteaza absenta / inhibarea hemaglutinării. VEZI DESENELE DIN PP!

 APLICATIILE TEHNICILOR:
– Diagnosticul serologic al unor viroze (gripa, rujeola, oreionul);
– Identificarea serologica (infectii cu virusuri hemaglutinante - gripale, paragripale).

IMUNOELECTROFOREZA

 TEHNICA DE LUCRU:
– Lama de microscop este acoperită de agaroză, după care se practică 2 godeuri;
– Se separă proteinele electroforetic graţie curentului electric (ex: electroforeza serului uman);
– Se decupează apoi un şanţ central, în mijlocul lamei, în care se va pipeta ser policlonal de animal anti-
proteine umane (Atc anti-Ig umane) care va recunoaşte toate fracţiunile proteice din serul uman.
– După difuzie, se obţin diferite arcuri de precipitare, care pot fi colorate şi comparate.
* Imunoelectroforeza serului unui bolnav este realizată în comparaţie cu cea a unui ser uman normal. În
acest mod se poate repera zona unde este situată fiecare fracţiune afectată.
* Prezenţa unei Ig monoclonale dă un arc foarte incurbat, gros, aproape de jgheabul imunoserului.
* Există situaţii patologice în care lipsesc în totalitate lanţurile grele iar lanţurile uşoare sunt sintetizate în
exces în raport cu lanţurile grele → imunoelectroforeza pe urini conc. ale bolnavului. Lanţurile uşoare,
mono sau dimerice = proteinele Bence-Jones eliminate prin rinichi.

 APLICAŢIILE TEHNICII:
– Imunoelectroforeza este o tehnică calitativă care stabileşte în cazul proteinelor umane patologice
monoclonale, clasa de Ig implicată, prin aceea că arcul de precipitare respectiv apare îngroşat sau cu importante
modificări morfologice (dedublări, deformări etc).
– Prin imunoelectroforeză se poate izola din gel Atg urmărit, pentru a realiza o analiză mai amplă sau
pentru a obţine seruri monoclonale. Imunoelectroforeza este limitată ca sensibilitate de calităţile antiserului
folosit.

IMUNODIFUZIE SIMPLA = TEHNICA MANCINI – CARBONARA

 PRINCIPIUL TEHNICII: In cadrul acestei tehnici gelul de agaroză inclus în plăcuţe de polistiren va
conţine Atc specifici Atg cercetat; Difuzia radiala a Atg dintr-un godeu intr-un gel ce contine o cantitate
constanta de anticorpi, determina formarea unui inel de precipitare, al carui diametru la patrat este direct
proportional cu concentratia de Atg.

 TEHNICA DE LUCRU:
– în godeurile practicate în gel se depun probele de testat, în care se caută Atg;
– Atg difuzează în gel, deplasând zona de echilibru, şi va reacţiona cu Atc din gel, în cazul existenţei unei
corespondenţe imune;

5
 – După 24-48 ore apar inelele de precipitare a căror diametre(mm) sunt proporţionale cu cantitatea de Atg.
– Concentraţiile (mg) parametrului investigat se apreciază conform unei curbe de etalonare obţinute,
folosind Atg standard cu concentraţii determinate.

 INTERPRETAREA REZULTATELOR:
– Cu rigla gradata special se masoara diametrul inelelor de precipitare si se realizeaza corespondentul
dintre diametru si cantitatea de CRP(mg/dl);
– Erori:
– Daca nu se toarna gelul pe o suprafata orizontala, pentru a avea aceeasi grosime;
– Daca inainte de utilizare imunoplaca se tine <30 min la temperatura camerei.

 APLICAŢIILE TEHNICII:
– Dozarea proteinei C reactive;
– Dozarea imunoglobulinelor (mai ales IgG, IgA, IgM şi IgD);
– Determinarea cantitativă a fracţiunilor complementului;
– Determinarea cantitativă a siderofilinei;
– Dozarea alfa1 - anti-tripsinei umane etc.

DOZAREA COMPLEXELOR IMUNE CIRCULANTE

 Cercetarea CIC în practica clinică este de interes în următoarele situaţii:
– Pacienţii cu afecţiuni în care disordinile autoimune se asociază cu leziuni determinate de reacţii de
hipersensibilitate imediată tip III (LES, vasculite, crioglobulinemii, poliartrita reumatoidă etc) pot fi urmăriţi
privind activitatea bolii prin măsurarea CIC;
– Boli infecţioase cum sunt endocarditele, lepra, hepatitele virale sau infecţiile parazitare.

TEHNICA DE PRECIPITAREA COMPLEXELOR IMUNE CU PEG:

 PRINCIPIUL METODEI: Polietilenglicolul cu masa moleculară 6000 modifică solubilitatea

complexelor imune, permiţând evidenţierea lor prin precipitare.

 TEHNICA DE LUCRU:
– Reactivi:
o Reactiv 1: PEG 6000 soluţie in tampon borat;
o Reactiv 2: tampon borat, ph = 8,4 .
– Probele de sânge dupa recoltare se ţin la termostat timp de 3 ore la 37°C, dupa care se desprinde cheagul
şi se decantează serul.
– Serul astfel obţinut poate fi păstrat la frigider (+4°C) până la prelucrare.
– Se pregătesc proba şi martorul conform tabelului: VEZI TABEL IN PP!
– Proba şi martorul se păstrează peste noapte (24 ore) la frigider (+4°C), după care se măsoară extincţia
probei (EP) şi a martorului (EM) faţă de apă distilată la lungimea de unde λ = 450 nm, în cuva de 1 cm.
– Calculul: E = (EP - EM) x 1000 (unităţi fotomctrice), unde: EP = extincţia probei , EM = extincţia
martorului.
– Valori normale: 0-50 unităţi fotometrice.

IDENTIFICAREA CRIOGLOBULINELOR

6
  TEHNICA DE LUCRU:
– Sângele este prelevat "a jeun" cu o seringă preîncălzită la 37°C şi colectat în tuburi uscate care sunt
menţinute la temperatura de 37°C, 3-4 ore pentru a separa cheagul. Nerespectarea acestei precauţii poate să
ducă la precipitarea momentană a crioglobulinelor şi implicit la rezultate eronate.
– După separare, serul bolnavului este centrifugat şi repartizat în 2 tuburi:
o un tub se conservă la termostat iar
o celălalt este refrigerat la + 4° C (cel puţin 48-72 ore).
– După acest interval de timp se compară macroscopic tuburile; prezenţa crioglobulinelor este indicată de
un precipitat care apare în tubul menţinut la rece, precipitat care va dispare după încălzirea lui la 37°C.
– Tubul menţinut la termostat de la începutul testării, folosit ca martor, nu va prezenta precipitat.
– După izolarea şi spălarea precipitatului are loc analiza crioprecipitatului (tipajul crioglobulinei) pentru
identificarea componentelor (izotipurile Ig, fracţiuni de complement, complexe imune circulante) crioglobulinei
care se face prin diferite metode sensibile: imunoelectroforeză, imunofixare (immunoblotting), electroforeză în
gel de poliacrilamidă.

DIAGNOSTICUL SEROLOGIC AL INFECŢIILOR STREPTOCOCICE

(determinarea titrului antistreptolizinelor 0) - reacţia ASLO

Reacţia ASLO decurge în două etape:

– Punerea în contact a diluţiilor din serul de testat (în care căutăm Atc anti-SLO) cu o cantitate standard de
streptolizină O (Atg);
 INCUBARE
– Repartizarea unei suspensii de hematii de iepure ca mijloc revelator.

 PRINCIPIUL TEHNICII:
– În tuburile în care diluţiile de ser conţin o cantitate suficientă de antistreptolizine O (Atc) efectul litic al
Atg (streptolizină O) va fi inhibat  ceea ce se traduce prin lipsa de hemoliză;
– În diluţiile de ser în care Atc sunt insuficienţi (sau absenţi) pentru a neutraliza streptolizină O, efectul
litic al acesteia se observă prin prezenţa hemolizei.

 TEHNICA DE LUCRU:
– Serul de cercetat se tratează cu rivanol pt îndepărtarea inhibitorilor nespecifici;
– Urmează o inactivare a serului timp de 30 min la 56°C;
– Se efectuează diluţii succesive din serul de testat (1/100, 1/250, 1/500, 1/625, 1/833, 1/1250) în soluţie
cloruro-sodică izotonă;
– Se adaugă Atg (streptolizină O) în cantitate de 0,5 ml;
– Incubare;
– Se repartizează în fiecare eprubetă câte 0,5 ml dintr-o suspensie de hematii de iepure 5%;
– Incubare.

 INTERPRETAREA REZULTATELOR:
– Se face în doi timpi:
– Primă citire după scoaterea tuburilor de la termostat;
– A doua, definitivă, după o noapte de păstrare la +4° C.
– Reacţia negativă este indicată de prezenţa hemolizei.

7
 – Titrul Atc anti-streptolizina O (ASLO) este dat de ultimul tub în care lipseşte complet hemoliza.
– Titrurile normale de ASLO = 160 - 200 unităţi/ml ser.
– Titrurile crescute, peste aceste limite:
o infecţie recentă streptococică;
o instalarea unor complicaţii post-streptococice: reumatismale, renale, endocardice.
– Titrurile înalte de Atc ASLO după o infecţie streptococică se menţin crescute timp de câteva luni.

RFC = REACTIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI

 PRINCIPIUL TEHNICII: RFC foloseşte două sisteme Atg-Atc care pot activa /consuma o
concentraţie standard de complement:
– Primul sistem este reprezentat de Atc din serul de bolnav şi de un Atg corespunzător;
– Al doilea sistem este un sistem cu rol indicator (sistemul hemolitic):
o face vizibil rezultatul reacţiei din primul sistem;
o constituit din hematii de oaie (Atg) în asociere cu un ser hemolitic (Atc) (ser obţinut prin imunizarea
iepurilor cu hematii de oaie).
– Dacă serul de bolnav conţine Atc faţă de Atg standard, C se leagă de acest complex Atg-Atc  nu mai
există C liber în reacţie, care să poată fi fixat de sistemul hemolitic  hematiile de oaie vor sedimenta,
constatându-se absenţa hemolizei.
– Dacă serul de cercetat nu conţine Atc specifici Atg folosit în reacţie  nu se formează complexe Atg-
Atc, C rămâne liber şi se fixează pe sistemul indicator, producând liza hematiilor de oaie.

 ELEMENTELE REACTIEI:
1. Serul de testat – 2 seruri (serul I -la debut, serul II -în convalescenţă) inactivate prin încălzire 30 min la
56°C, pentru distrugerea C;
– În mod normal avem în serul nostru niveluri diferite ale fracţiunilor C.
– Pentru a înlătura efectele produse de prezenţa fracţiunilor proteice ale C, C din serul pacientului trebuie
distrus şi introdusă în reacţie o cantitate cunoscută din complementul standard;
– Serul este inactivat prin încălzire - prin încălzire distrugem C, dar nu şi Atc, deoarece fracţiunilor
proteice ale C sunt mult mai susceptibile pentru a fi distruse prin încălzire.
2. Atg standard - diferă în funcţie de natura Atc bănuiţi în serul de cercetat; Atg sunt titrate pentru
stabilirea puterii lor anticomplementare;
3. Complementul (alexina) – ser proaspăt de cobai sau liofilizat; în momentul utilizării este titrat faţă de
sistemul hemolitic –pentru a stabili cantitatea minimă de alexină care să fie introdusă în reacţie în vederea
fixării de către unul din cele două sisteme Atg-Atc.
4. Sistemul hemolitic –compus din eritrocite de oaie (berbec) (obţinute după spălarea de 3 ori a E în
tampon veronal) şi din Atc anti-eritrocite berbec, obţinuţi prin imunizarea iepurilor cu eritrocite de berbec şi
apoi inactivaţi la cald.
Reacţia de fixare a complementului poate fi:
o Calitativă: de exemplu reacţia Wasserman, utilizată pentru diagnosticul sifilisului;
o Cantitativă: reacţia Ida Bengston, folosită pentru aprecierea dinamicii Atc într-o serie de afecţiuni
bacteriene sau virale.
o MARTORII: În paralel cu seriile test, în reacţie se vor introduce următorii martori:
o Martor de ser de cercetat: conţine ser de testat + Alexină (A) + SH = hemoliză prezentă;
o Martor de Atg: conţine Atg + A + SH = hemoliză prezentă;
o Martor ptr controlul alexinei: conţine A + SH = hemoliză prezentă;

8
 o Martor ptr controlul hematiilor din sistemul hemolitic: include SH şi soluţie cloruro-sodică izotonă =
hemoliză absentă;
o Martor de ser sigur pozitiv: include ser sigur pozitiv şi toţi ceilalţi reactanţi (Atg + A + SH)= hemoliză
absentă;
o Martor de ser sigur negativ: conţine ser sigur negativ şi toţi ceilalţi reactanţi (Atg + A + SH) = hemoliză
prezentă.

 INTERPRETAREA REZULTATELOR
 Metoda calitativa:
– Hemoliza totala  rezultat negativ;
– Hemoliza incompleta  rezultat dubios;
– Lipsa hemoliza  rezultat de la slab pozitiv (+) la intens pozitiv (++++);
– Hemoliza partiala (50% hemoliza) sediment globular cu lichid supernatant rosu = RFC pozitiva (++);
– Hemoliza absenta in totalitate, sediment compact de hematii, lichid supernatant incolor = RFC intens
pozitiva (++++).
 Metoda cantitativa:
– Titrul fixator al serului de cercetat este indicat de ultima dilutie care determina o RFC pozitiva ++
(hemoliza 50%).
** Rezultatul este semnificativ daca intre serul I si II exista o crestere in dinamica a titrului de Atc fixatori de
complement cu cel putin 4 trepte binare ale dilutiei.

REACŢIA DE IMUNOFLUORESCENŢĂ
 PRINCIPIUL REACTIEI: Tehnica imunofluorescenţei se bazează pe proprietatea fluorocromilor de a
se fixa pe Ig (Atc) fară a le modifica proprietăţile biologice. Aceşti Atc conjugaţi (marcaţi fluorescent), vor
deveni trasori sensibili pentru Atg tisulare şi în urma legării lor de un Atg corespunzător conferă fluorescenţă
complexului Atg-Atc format.
Fluorocromii (izocianatul, izotiocianatul de fluoresceină, aminorhodamina B) sunt substanţe care iradiate de
un fascicul de lumină cu lungime de undă mică şi frecvenţă mare (cum sunt radiaţiile UV), emit radiaţii cu
lungime de undă superioară (5300-6000A), situate în zona vizibilă a spectrului, permiţând astfel formarea unei
imagini fluorescente a complexului Atg-Atc. Astfel, fluoresceina excitată prin anumite lungimi de undă în UV
emite o lumină verde iar rhodamina dă o lumină roşie.
Atg legate specific la Atc fluorescenţi pot fi detectate prin culoarea lor strălucitoare. De obicei se folosesc
Atc care sunt marcaţi la nivelul fragm Fc.
Relevarea fluorocromilor fixaţi în cadrul reacţiei Atg-Atc necesită folosirea unui microscop echipat pentru
fluorescenţă cu o sursă de UV şi cu filtre de excitaţie.

VARIANTA DIRECTĂ
Varianta directă a tehnicii de imunofluorescenţă se aplică mai frecvent pentru identificarea Atg.

 PRINCIPIU: Se foloseşte un ser standard imun marcat cu o substanţă fluorescentă; Atc din acest ser,
fluorescenţi şi specifici Atg, vor reacţiona cu Atg de identificat (Atg din culturi, frotiuri, ţesuturi animale sau
umane) formând complexe fluorescente ce pot fi observate în lumina ultravioletă.

Avantajele acestei metode constau în:

– Rapiditatea tehnicii;

9
 – Permite evidenţierea prezenţei Atg microbiene după inactivarea lor prin tratamentul cu antibiotice.
Dezavantajele variantei se referă la necesitatea preparării unui număr mare de seruri imune specifice
fluorocromate, diferite pentru fiecare antigen.

VARIANTA INDIRECTĂ
Utila pentru identificarea Atg cât şi pentru evidenţierea Atc.
 PRINCIPIU: Varianta indirectă se desfăşoară în două etape:
Prima etapă: preparatul fixat, conţinând Atg cunoscut/necunoscut, se tratează cu ser nefluorescent
incubare  complex Atg-Atc nefluorescent.
Etapa a doua: pentru a face vizibil complexul Atg-Atc în lumina UV, preparatul se tratează cu ser
antiglobulinic fluorescent, activ faţă de specia care a furnizat serul specific din primul timp al reacţiei.
În varianta indirectă Atg este acoperit cu un strat dublu de Atc: Atc nefluorescenţi specifici faţă de Atg şi
Atc fluorescenţi anti-γ globuline.
 APLICAŢIILE IMUNOFLUORESCENŢEI:
Tehnica de imunofluorescenţă directă permite recunoaşterea Atg şi este aplicată în:
– bacteriologie pentru identificarea bacteriilor (streptococi, meningococi, salmonele);
– virusologie, parazitologie;
– imunologie şi hematologie pentru a identifica celule normale (limfocite, monocite) sau celule patologice
(celule leucemice), localizarea hormonilor şi enzimelor;
– anatomia patologică, pentru recunoaşterea markerilor tumorali.

Tehnica de imunofluorescenţă indirectă este aplicată mai ales în cercetarea Atc în cadrul serologiei bacteriene şi
virale sau pentru evidenţierea autoanticorpilor, ca markeri în bolile autoimune.

TEHNICA UTILIZATĂ PENTRU PUNEREA ÎN EVIDENŢĂ A AUTOANTICORPILOR

ANTI-NUCLEARI (AAN)

Pentru cercetarea Atc anti-nucleari dintr-un ser uman sunt utilizate ca substrat cupe de ţesuturi (amprente de
ficat de şobolan) care sunt incubate cu serul pacientului suspectat de o boală autoimună.
Toate proteinele umane care nu se vor fixa pe parcursul încubării prin reacţia Atg-Atc vor fi îndepărtate prin
spălare iar autoanticorpii anti-nucleari fixaţi pe nuclei vor fi relevaţi prin xenoanticorpi anti-Ig umane (cal,
iepure, capră etc) cuplaţi cu substanţe fluorescente.

 TEHNICA DE LUCRU:
Se parcurg următorii timpi:
 obţinerea lamelor cu amprente de ficat de şobolan:
– se secţionează fragmente dintr-un ficat de şobolan si suprafaţa proaspăt tăiată se aplică pe lame de
microscop bine degresate;
– se usucă lamele la aer;
 pe fiecare din amprentele obţinute se pipetează câte o picătură din:
– serul de testat (din care se fac dilutii succesive);
– serul martor negativ (ser testat anterior şi declarat negativ pentru Atc antinucleari);
– serul martor pozitiv;

10
 – se indică pentru fiecare ser să se folosească două amprente.
 lamele se aşează pe un suport de sticlă, într-o cutie Petri şi se lasă la t camerei, 20 de minute;
 se spală preparatele cu o soluţie cloruro-sodică izotonă;
 se acoperă fiecare amprentă cu câte o picătură din serul fluorescent anti-gamaglobuline umane 
incubare la t camerei, 20 de minute.
 urmează o nouă spălare cu soluţie cloruro-sodică izotonă.

 CITIREA REZULTATELOR
Citirea rezultatelor se face cu ajutorul unui microscop prevăzut cu lampă HBO 200 şi cu filtrele necesare
(caloric, de excitaţie, de baraj).
– Rezultatul “+”: indicat de următoarea imagine: pe un fond uşor verzui apar nucleii fluorescenţi ai
celulelor hepatice;
– Rezultatul “-”: se remarcă zone mici, întunecoase care corespund nucleilor necoloraţi.
– Se exprimă titrul autoanticorpilor prin diluţia cea mai înaltă a serului de bolnav care a mai produs
fluorescenţă.

Fluorescenţa poate fi de mai multe tipuri: omogenă, inelară, pătată, nucleolară etc.
Tipul de imunofluorescenţă omogen, difuz este dat de prezenţa Atc anti-dezoxiribonucleoproteine (DNP).
Nucleul este uniform omogen colorat. Aceşti Atc sunt responsabili de formarea celulelor Harves (care au
constituit prima anomalie imună semnalată în LES) şi sunt corelaţi cu forma activă de boală.
Tipul de imunofluorescenţă inelar sau periferic este expresia prezenţei Atc anti-ADN nativ şi Atc anti-DNP
solubile. Imaginea este caracteristică formei acute de boală lupică.
Tipul de imunofluorescenţă nucleolar este determinat de colorarea omogenă a nucleolului; el este indus de
prezenta Atc anti-ribonucleoproteină (RNP). Prezenţa acestei coloraţii este semnalată mai frecvent în
sclerodermie, dermatomiozită.

ELISA
Tehnicile ELISA reprezintă metode imunoenzimatice sensibile de titrare a Atg sau Atc, cu aplicabilitate în
identificarea serologică şi în serodiagnostic, etape importante pentru stabilirea diagnosticului unor afecţiuni
umane.

 PRINCIPIUL TEHNICII: La baza tehnicilor ELISA stă o înlănţuire de reacţii:

– primul element (Atg sau Atc) este imobilizat pe un suport solid (polistiren);
– al doilea element al reacţiei (Atc sau respectiv Atg de testat) este legat de primul printr-o reacţie
specifică Atg – Atc
– Alt element al reacţiei este un reactiv marcat enzimatic (cu peroxidaza sau fosfataza alcalină) în cadrul
unui conjugat, care se va lega de complexul format între primii doi reactanţi, tot printr-o reacţie imună specifică.
Enzima reţinută în godeu acţionează degradativ pe un substrat cromogen, incolor. Degradarea substratului
de către enzimă antrenează oxidarea cromogenului care devine un compus colorat ce urmează a fi detectat
spectrofotometric la o lungime de undă corespunzătoare (culoare albastra – diverse nuante de albastru).

 ELEMENTELE REACTIEI:
– Antigenul poate fi o proteina sau un carbohidrat  producerea de Atc specifici.
– Anticorpii = substante de natura proteica produşi de către celule ale sistemului imunitar ca răspuns la
patrunderea in organism a unui Atg.

11
 – Conjugatul enzimatic = enzima ataşata ireversibil la o proteina, de obicei la un Atc. Reacţia enzimei
conjugata determina schimbarea de culoare ce constituie semnalul.
– Enzime = catalizatori biochimici, compuşi care măresc viteza reacţiilor chimice ce se desfasoara in
sistemele biologice, fara sa se consume in cursul lor. Intensitatea reacţiei este proporţională cu cantitatea de
enzimă folosită.
Enzime utilizate: peroxidaza, fosfataza alcalina, glucozoxidaza etc.
Enzima + substrat cu cromofor — citire la spectrofotometru.
– Cromoforul = substanta ce determina schimbări de culoare in urma reacţiei catalizate de către enzima
conjugata.
– Substraturi: conţin substraturi caracteristice enzimei folosite si substanţe cromogene care formează
produşi de reacţie coloraţi (cromofore).
o Solutie stop: pentru stoparea reactiei in toate godeurile (culoarea albastra vireaza in galben – diverse
nuante de galben, portocaliu).
o Faza solidă reprezintă suportul fix la nivelul căruia are loc adsorbţia primului reactant. Adsorbţia
presupune adăugarea Atg sau Atc diluat intr-o soluţie tampon in godeu.
Produse biologice analizate: ser, plasma, urina, scaun, lichid sinovial, LCR, lichid de lavaj bronşic.

RIE directă (metoda sandwich)

 PRINCIPIUL TEHNICII: Utilizată doar în sero-identificarea Atg.

 TEHNICA DE LUCRU:
– În godeurile din placa de polistiren în care sunt fixaţi Atc cunoscuţi se toarnă soluţia de Atg necunoscut.
– Incubare 1h.
– După o spălare minuţioasă a godeurilor se adaugă Ac marcaţi cu enzime - conjugatul care se fixează pe
epitopii liberi ai Atg polivalent.
– Incubare de 30 min-1h
– Spălare
– Prezenţa complexului Atc-Atg-Atc-marcat se depistează cu ajutorul substratului cromogen (substanţă
iniţial incoloră, dar care se colorează sub acţiunea enzimei, ex. apa oxigenata si orthofenilendiamina).
– Se citeşte DO la spectrofotometru

RIE indirectă
 PRINCIPIUL TEHNICII: Utilizată în serodiagnostic (dozarea Atc).

 TEHNICA DE LUCRU:
– Atg cunoscut este fixat la fundul godeurilor;
– Atc (serul testat) se întroduce în godeu;
– Incubare 1h;
– Spălare;
– Se adaugă ligandul marcat cu enzimă – conjugatul (anti-Ig sau proteina A cuplate cu enzimă). Acest
ligand se fixează pe Atc testati;
– Incubare 1h;
– Spălare;
– Se adaugă apoi substratul cromogen.
– Cantitatea de Atc se măsoară după densitatea optică a lichidului din godeuri 
– Se citeşte DO la spectrofotometru.

12
  INTERPRETAREA REZULTATELOR:
Reacţia pozitivă se traduce prin apariţia de benzi orizontale colorate cu intensitate diferită, în zonele unde a
avut loc reacţia Atg-Atc.

 APLICATIILE TEHNICILOR:
– Determinarea cantitativă a unor proteine cu importanţă diagnostică: α- fetoproteina, Atg
carcinoembrionar;
– Determinarea cantitativă a unor Atg de natură infecţioasă bacteriene, virale (HIV), fungice, parazitare
sau/şi a Atc corespunzători din serul bolnavilor, în scop diagnostic;
– Evidenţierea şi titrarea auto-Atc ca markeri pentru bolile autoimune, virale (anti-HIV).
– Dozări de: hormoni, markeri tumorali, droguri, medicamente, citokine.
– UTILIZARE: depistarea Atc anti-HIV, caracterizarea Atc monoclonali.

TEHNICA IMUNOBLOT (WESTERN BLOT) permite identificarea Atg sau a Atc dintr-un amestec.

 PRINCIPIUL TEHNICII: Proteinele din amestecul studiat sunt separate prin electroforeză în gel de
agaroză în funcţie de G moleculară.

 TEHNICA DE LUCRU:
– I etapă – electroforeza în gel a probei de Atg  migrarea fracţiunilor;
– II etapă – transferul electric al Atg pe membrana de nitroceluloză;
– III etapă – pe membrană sunt aplicaţi succesiv Atc dirijaţi contra Atg, apoi conjugatul marcat cu enzimă,
care permite depistarea Atc fixaţi;
– Spălare;
– Se adaugă substratul cromogen;
– Fiecare complex Atg-Atc formează zone colorate distincte.

 INTERPRETAREA REZULTATELOR: Reacţia pozitivă se traduce prin apariţia de benzi orizontale

colorate cu intensitate diferită, în zonele unde a avut loc reacţia Atg-Atc.

 UTILIZARE:
– Depistarea Atc anti-HIV;
– Caracterizarea Atc monoclonali.

DETERMINAREA ATC SPECIFICI DIFERITELOR PROTEINE VIRALE HIV

 PRINCIPIUL TEHNICII: Prin această tehnică pot fi evidenţiate fractiunile Atg ale virusului HIV1 sau
HIV2 (fracţiuni separate în prealabil prin electroforeză efectuată în gel de poliacrilamidă şi electrotransferate pe
o bandă de nylon) sub forma unor benzi colorate în albastru-violet în prezenţa Atc anti-HIV1 sau anti-HIV2 si
cu ajutorul Atc antiglobuline umane marcaţi enzimatic.

 ETAPELE TEHNICII:
– Separarea fracţiunilor Atg ale virusului HIV1 sau HIV2 sub formă de benzi (Proteinele sunt separate
electroforetic în gel de poliacrilamidă;

13
 – Sub acţiunea câmpului electric are loc difuzia proteinelor conform GM, aranjându-se în zone liniare
subţiri diferite: mai aproape de start se aranjează proteinele cu masă moleculară mare (120-150 kDa), la final se
aranjează proteinele cu masă moleculară mică (5-10kDa);
– Apoi lamela de gel este transferată pe o foaie de nitroceluloză amplasată între electrozii unei surse de
curent continuu;
– (Sub acţiunea câmpului electric are loc trecerea proteinelor din gel pe nitroceluloză, unde se fixează
foarte bine pe hârtie);
– Proteinele fixate sunt marcate cu o enzimă (e.g. alkaline phosphatase sau peroxidase) incoloră;
– Procedura ulterioară de montare a reacţiei este similară tehnicii ELISA;
– INCUBAREA benzilor cu serul de cercetat şi cu serurile martor (pozitiv, negativ) timp de 2 ore la t
camerei;
– Spalare;
– INCUBAREA benzilor cu conjugatul (Atc anti-globuline umane cuplaţi cu enzima) 2 ore la t camerei;
– Spalare;
– INCUBAREA benzilor cu soluţie revelatoare 20 minute la t camerei;
– Apariţia benzilor colorate identifică Atc specifici subfracţiunilor Atg virale.

SUBIECTE TEORETICE IMUNOLOGIE 2017-2018

IDENTIFICAREA SEROLOGICA (ex. Identificarea unei specii sau serotip bacterian):

 CULTURA germen Atg ??? + Ser standard (Atc) (cu specificitate cunoscuta de gen, grup, tip, subtip).
 Exemplu de identificare serologica (antigenica):
– Incadrarea serologica a enterobacteriilor (Escherichia coli, Salmonella, Shigella), a brucelelor,
vibrionilor holerici, gonococilor, etc.

DIAGNOSTICUL SEROLOGIC (metoda indirecta) – investigam reactivitatea organismului

infectat:
 SER bolnav Atc ??? + Atg standard cunoscut.
 Exemple de diagnostic serologic:
– Dg serologic al febrei tifoide si paratifoide A, B – reactia WIDAL;
– Serodiagnosticul brucelozei – reactia WRIGHT;
– Dg serologic al tifosului exantematic – reactia WEIL-FELIX.
 Diagnosticul serologic are sens numai in infectiile cu evolutie prelungita sau cronica – Atc depistati in
serul bolnavului au semnificatie clinica daca traduc experienta imuna dintr-o infectie actuala; ei sunt fara
importanta pentru diagnostic sau prognostic daca au aparut dupa vaccinare.
 In diagnosticul serologic se vor preleva doua seruri:
– Serul I de debut;
– Serul II de convalescenta (recoltat dupa 10-14 zile de la prima recoltare). Ambele prelevate se vor testa
concomitent.
– ???
– Trebuie sa observam/urmarim dinamica Atc in timp  sa vedem daca avem diferente intre titrul serului
I si cel al serului II  titrul serului II sa creasca cu cel putin 4 dilutii/trepte binare  putem afirma ca avem un
raspuns imun.

14
 DILUTII
Ce sunt? Se utilizeaza pentru diluarea unui produs patologic (ser, urina).
Cum? Prin dilutii binare sau dilutii logaritmice. VEZI TABEL DILUTII PP!
De ce? Pentru a afla titrul T Atc.
Cand? Atunci cand vrem sa determinam T Atc, cand avem grunji pe lama.

TESTUL COOMBS
Hemaglutinarea sta si la baza testului Coombs care identifică Atc liberi sau fixati pe hematii, Atc care pot
apare în anumite stări patologice, cum sunt anemiile hemolitice.
In cazul R+ hematiile acoperite cu anticorpi sunt aglutinate în vitro cu un ser antiglobulinic (produs pe
iepure prin injectarea de globuline umane).

REACTII DE AGLUTINARE TIP COOMBS

Atc „neaglutinanti” (incompleti) desi se fixeaza pe Atg omologi nu reusesc sa apropie eritrocitele pentru a
forma aglutinate eritrocitare in mediul salin. (ex de Atc neaglutinanti - Ig G).
Se folosesc diverse artificii tehnice: utilizarea Atc anti-globuline umane, tratarea enzimatica a eritrocitelor.
 PRINCIPIUL REACTIEI: Hematiile umane pe care se fixeaza Atc specifici incompleti devin
aglutinabile in prezenta serului anti-imunoglobuline umane, ale carui Ig se ataşează specific pe complexele
hematii-Atc incompleţi formate  R + = macroscopic se observa aparitia unui depozit cu margini crenelate
(godeuri), sau grunji (lama).

TESTUL COOMBS DIRECT TCD

 PRINCIPIUL REACTIEI: Se evidentiaza prezenta Ig ca Atc (sau fractiuni de complement) fixati in
vivo pe suprafata eritrocitelor.

 MATERIALE NECESARE:
– Sange de cercetat recoltat pe anticoagulant (1ml sange de cercetat se spala prin centrifugare de 5-6 ori cu
cate 10 ml sol. cloruro-sodica 9% pentru indepartarea proteinelor plasmatice, dupa care se retine sedimentul
eritrocitar);
– Sange normal grup 0 (martor) recoltat pe anticoagulant;
– Ser anti-proteina umana (ser imun de cal) = ser anti-Ig umane.

 TEHNICA DE LUCRU (pe lama):

– Ser anti-proteina umana + sediment eritrocitar provenit din sangele de cercetat;
– Martor: ser anti-proteina umana + sediment eritrocitar provenit din sangele normal (grup 0).

– INTERPRETAREA REZULTATELOR:
– Proba de cercetat  aglutinare  prezenti Atc incompleti fixati pe eritrocite.
– Martor  NU este prezenta aglutinarea.

TESTUL COOMBS INDIRECT TCID

15
 Testul Coombs indirect se realizeaza in 2 timpi:
1. SENSIBILIZAREA ERITROCITELOR - serul de bolnav in care cautam Atc se incubeaza cu o baterie
de eritrocite test de grup cunoscut (eritrocite ale caror Atg de membrana sunt determinate)  Atc se fixeaza
selectiv pe Atg eritrocitelor test (reactie invizibila cu ochiul liber).
2. FAZA DE REVELATIE - se adauga ser antiproteina umana (reactiv antiglobulinic) care serveste ca
legatura intre globulinele fixate la suprafata eritrocitelor  AGLUTINAREA.
 APLICATIILE TESTULUI:
– Un exemplu de aplicare a testului Coombs indirect se referă la cercetarea Atc in sistemul Rh.

CERCETAREA ATC IN SISTEMUL RH

Pentru cercetarea Atc anti-RhoD, eritrocitele "O" Rho D pozitive (+) şi D negative (-) vor fi, intr-o primă
etapă, sensibilizate cu serul de cercetat.
 MATERIALE NECESARE:
– Sânge de cercetat, recoltat fără anticoagulant, pentru obţinerea serului care este apoi inactivat 30 min la
56°C.
– Sânge de grup O RhoD + şi RHoD - , recoltele fiind efectuate pe citrat de sodiu 3,8% (1 ml sânge din
fiecare grup se spală prin centrifugare de 5-6 ori cu câte 10 ml soluţie cloruro-sodica 9% pentru îndepărtarea
proteinelor).
– Ser anti-proteina umana = ser anti-Ig umane.

 TEHNICA DE LUCRU:
 2 tuburi de hemoliză:
– Tubul I 0,5 ml ser de cercetat + 0,5 ml suspensie 2% eritrocite de grup O RhoD+
– Tubul II 0,5 ml ser de cercetat + 0,5 ml suspensie 2% eritrocite de grup O RhoD –
– Incubare de 1 oră la 37°C.
 Pe lamă
– 1 pic de ser antiproteină umană + 1 pic de sediment eritrocitar din tubul 1
– 1 pic de ser antiproteină umană + 1 pic de sediment eritrocitar din tubul 2

 INTERPRETAREA REZULTATELOR:
– Apariţia aglutinării eritrocitelor din tubul 1 şi absenţa aglutinării eritrocitelor din tubul 2, in timp de 5-7
min, indică prezenţa Atc incompleţi, anti-antigen D din serul de cercetat.

 APLICATIILE TESTULUI COOMBS:

 TCD poate fi pozitiv in:
– Anemia hemolitică autoimună idiopatică (eritocite sensibilizate prin Atc de clasă IgG);
– Transfuzie de sânge incompatibil (eritrocite sensibilizate cu IgG sau C3d);
– Sensibilizarea eritrocitelor cu medicamente in vivo, prin atc clasa IgG;
– Boala hemolitică a noului-născut (eritrocite sensibilizate cu IgG);
– Hepatita infecţioasă, pneumonia virală, pneumonia cu Mycoplasma, mononucleoza infecţioasă,
meningita, TBC, anemia megaloblastică, diabetul zaharat, LES, periarterita nodoasă, diferite tumori.
 TCID este indicat în investigarea:

16
 – Anemiei hemolitice autoimune idiopatice;
– Reacţiilor post-transfuzionale;
– Boala hemolitică a nou-născutului;
– Identificarea unor Atg eritrocitare;
– In decelarea Atc incompleţi evidenţiaţi în unele bacterioze (bruceloză, febra Q, febră tifoidă).

TEHNICA DE IMUNODIFUZIE DUBLA OUCHTERLONY

 PRINCIPIUL TEHNICII - TEHNICA DE LUCRU:
– Agaroza este turnată într-un strat de câţiva mm grosime pe o placă/lamă de sticlă/cutie Petri.
– Se decupează 2 godeuri pentru fiecare probă de testat, într-un godeu se plasează Atc, în celălalt Atg.
– În zona de echilibru va apare un precipitat - traseul de precipitare se deplasează în funcţie de conc.
Astfel, se va situa aproape de un godeu dacă concentraţia elementului inclus la acest nivel este mai joasă.
– Când reacţia este terminată (24-48 h), se poate spăla agaroza cu ser fiziologic fără a altera complexele
imune reţinute de reţeaua agarozei, apoi colora proteinele complexului imun pentru a releva banda de precipitat.

 INTERPRETAREA REZULTATELOR:
– Fuziunea arcurilor  indică un acelaşi complex imun;
– Arcuri secante  indicând două complexe imune diferite (godeurile periferice neconţinând aceleaşi
Atg);
– Arcuri duble  în cazul mai multor Atg în godeurile periferice şi mai mulţi Atc în godeul central.

 APLICAŢIILE TEHNICILOR:
– Decelarea unor proteine umane în condiţii patologice cum sunt: α - fetoproteina umană, proteinele
Bence-Jones, proteina C reactivă, antigenul HBs.

TESTUL ELEK (identificarea tulpinilor toxigene de bacil difteric)

 PRINCIPIUL TEHNICII: difuzia Atg şi Atc în unghi drept.

 TEHNICA DE LUCRU:
– În acest caz, tulpina de bacil difteric (Atg de testat este reprezentat de toxina difterică) se însămânţează
perpendicular pe direcţia unui şant practicat în gel in care s-a introdus anterior antiserul ce conţine Atc anti-
toxină diftcrică.

 INTERPRETAREA REZULTATELOR:
– Pozitivarea reacţiei este indicată de apariţia unor trasee de precipitare sub forma unor „mustăţi" la locul
întâlnirii celor doi reactanţi, Atg şi Atc migraţi în gel.

INTRADERMOREACŢIA SCHICK:
– Apreciază gradul de imunizare a populaţiei în urma vaccinării antidifterice;
– Pentru evidenţierea Atc anti-toxină difterică la subiectul testat se injectează intradermic o cantitate
redusă (0,1 ml) de toxină difterică purificată;
– Dacă la locul inoculării nu se constată efectul dermonecrotic, subiectul este imunizat = reacţie negativă;

17
 – In lipsa Atc specifici neutralizanţi, efectul acţiunii toxinei este prezent (eritem şi edem de cel puţin 10
mm diametru) = reacţia pozitivă.
– MARTORUL - Pentru a elimina pseudoreacţiile, se injectează intradermic pe celălalt braţ o cantitate de
toxină echivalentă, dar inactivată - în acest caz nu trebuie să apară reacţia cutanată.

INTRADERMOREACŢIA DICK:
– Testează susceptibilitatea la scarlatină şi se efectuează şi interpretează similar cu testul Schick;
– Prin această reacţie se urmăreşte prezenţa Atc antitoxici induşi în organism de toxina eritrogenă.
– Se injectează intradermic cantitatea minimă de toxină eritrogenă care produce un eritem cu diametrul de
10 mm  persoane receptive la scarlatină reacţie pozitivă, iar la cele imune la scarlatină reacţie negativă - lipsa
eritemului în zona inoculată (imunitate antitoxică prezentă).

INTRADERMOREACŢIA SCHICK + INTRADERMOREACŢIA DICK:

– Teste utilizate în investigarea răspunsului imun umoral;
– Utilizate pentru testarea hipersensibilităţii de tip imediat;
– Efectul dermonecrotic se manifestă imediat în câteva minute.

INTRADERMOREACŢIA DE TIP TUBERCULINIC (IDR LA PPD):

– Test utilizat în investigarea răspunsului imun mediat celular;
– Utilizată pentru testarea hipersensibilităţii de tip întârziat;
– Efectul dermonecrotic se manifestă şi atinge amplitudinea maximă dupa 24-72 ore.

RIA
Analiza radioimună (RIA) este folosită în cadrul unor tehnici sensibile, pentru măsurarea titrului unui Atg
sau al unor Atc, folosind reactanţi marcaţi radioactiv.

 PRINCIPIUL REACTIEI: Radioimunotestarea se bazează pe afinitatea unui Atg necunoscut pentru

Atc său specific şi pe posibilitatea formei radioactive a Atg de a intra in competiţie cu Atg de dozat, nemarcat şi
de acelaşi tip.
– Cantitatea de complexe Atg marcat-Atc care se stabileşte prin măsurarea radioactivităţii prezente la
nivelul unui filtru ce nu lasă să treacă decât elementele izolate ale reacţiei, este o funcţie inversă a concentraţiei
de Atg nemarcat care se determină.
– Reacţia se citeşte la un SCINTILATOR pentru radiaţii gama.

 TEHNICA DE LUCRU: Principiul este asemănător cu cel al RIE/ELISA:

– Atg se fixează la fundul godeurilor din placa de plastic;
– Se adaugă Atc testaţi care se vor combina cu Atg omolog;
– După spălarea godeurilor, se adaugă un ligand radiomarcat (anti-Ig);
– După eliminarea excesului de izotopi prin spălare, se măsoară radio-activitatea: ea este proporţională cu
concentraţia Atc dozaţi.

 APLICAŢIILE TEHNICILOR:
– Evaluarea unor factori prezenţi in ser in concentratii foarte reduse: Atg carcionembrionar, alfa-
fetoproteina, hormoni, enzime, medicamente;
– Dozarea unor Atc anti-bacterieni: Atc anti-toxine bacteriene, detectarea anumitor Atg si Atc in serul
bolnavilor cu infectii virale.

18
 TESTUL DE TRANSFORMARE BLASTICA LIMFOCITARA T
Testul de transformare blastica limfocitara este utilizat pentru aprecierea raspunsului imun celular si se bazeaza
pe acelasi principiu care sta la baza evaluarii reactivitatii imune umorale.

PRINCIPIUL TEHNICII: Cultivarea in vitro a unei suspensii de limfocite, recoltate de la bolnavul testat, in
prezenta Atg presupus a fi sensibilizant este urmata de cresterea numarului de blasti. Limfocitele T sensibilizate
au capacitatea de a elibera in vitro factori mitogeni care induc activarea altor limfocite cu declansarea
proliferarii lor celulare cu aparitia de limfoblasti. Testul de transformare blastica limfocitara se realizeaza prin:
– stimularea policlonala a Ly, pe de o parte cu mitogeni nespecifici;
– si pe de alta parte prin rapel cu antigenul incriminat in declansarea raspunsului imun constatat la
pacientul investigat.

TEHNICA DE LUCRU:
– Se obtine mai intai un concentrat leucocitar din sange prelevat de la pacient, cu ajutorul unui mediu de
separare (sepcel, ficoll);
– Concentratul leucocitar este cultivat in prezenta antigenului sensibilizant timp de 2-3 zile la 37ºC
– In paralel se face un MARTOR din Ly bolnavului stimulate cu mitogeni (fitohemaglutinina, concavalina
A), in vederea controlarii capacitatii de raspuns a celulelor;
– Probele vor fi controlate zilnic privind starea viabila a culturii de Ly.

INTERPRETAREA REZULTATELOR:
– Se face prin 2 metode:
o Metoda citologica: pe preparate microscopice colorate Giemsa se apreciaza procentual limfoblastii;
– Raspuns imun umoral normal = 10-20% la 3-4 zile dupa stimularea cu Atg sensibilizant testat;
– Martorul = 90-95% dupa 2 zile de stimulare cu un mitogen nespecific.
o Metoda radiometrica.

TESTUL DE INHIBITIE A MIGRARII MACROFAGELOR

PRINCIPIUL TEHNICII:
Macrofagele mentinute in conditii corespunzatoare in vitro parasesc locul in care se afla si migreaza in
diferite directii. Anumite limfokine eliberate de limfocitele care au reactionat specific cu un anumit Atg, inhiba
migrarea acestor celule. Evidentierea limfokinei, denumita factorul de inhibitie a migrarii macrofagelor = MIF
se realizeaza in vitro prin testul inhibitiei migrarii macrofagelor care se bazeaza pe:
o Memoria imunologica a celulelor T de a recunoaste in cultura Atg cu care a venit in contact inaintea
investigarii;
o Capacitatea lor de a elibera factorul solubil cu rol in impiedicarea migrarii macrofagelor.
– Acest test releva prezenta limfocitelor T sensibilizate fata de un anumit Atg sau poate identifica Atg
sensibilizant, care a determinat instalarea raspunsului imun celular.

TEHNICA DE LUCRU:
– Se obtine mai intai un concentrat leucocitar din sange prelevat de la pacient, cu ajutorul unui mediu de
separare (sepcel, ficoll);
– Celulele separate sunt spalate, suspensionate in mediu dc cultura si introduse in tuburi capilare de 1 mm
diametru, care sunt inchise la o extremitate cu plastilina;

19
 – Urmeaza centrifugarea tuburilor si sectionarea lor la nivelul interfetei sediment celular-supenatant
(mediu de cultura in care au fost suspensionate celulele) ;
– Tuburile cu sedimentul celular vor fi introduse in camere de migrare si fixate orizontal de marginea
cutiei cu portiunile inchise, iar cu partile libere orientate spre centrul ei;
– Se pipeteaza in camera mediu de cultura suplimentat cu ser fetal de vitel (5-10%);
– Dupa o incubare de 16-24 ore la 37° C macrofagele vor migra prin extremitatea libera a tubusorului
formand o coroana in jurul orificiului - acest tubusor care prezinta migrarea normala a macrofagelor in absenta
Atg este considerat tubul martor.

INTERPRETAREA REZULTATELOR:
– Pentru interpretarea rezultatelor acestui test se calculeaza un indice de inhibitie a migrarii macrofagelor
dupa formula: VEZI PP!
– Reactia este considerata pozitiva cand valoarea I.1.M.M. < 70.

APLICATIILE TEHNICILOR:
– In bolile infectioase virale si bacteriene;
– In parazitoze;
– In anumite candidoze cutaneo-mucoase generalizate;
– In cadrul unui transplant de organe;
– In patologia autoimuna;
– La bolnavii suferinzi de infectii de focar la care titrul ASLO este valoric normal sau crescut
nesemnificativ.

TESTUL CITOTOXICITATII IMUNE (DETERMINAREA FUNCTIEI EFECTORII A

CELULELOR T CITOTOXICE- TCD8+)
PRINCIPIUL TEHNICII: Limfocitele subiectului investigat, puse in contact in vitro cu acelasi Atg care Ie-a
sensibilizat in vivo, elaboreaza factorul solubil numit limfotoxina (TNF β), care determina pe culturi celulare
efecte de citotoxicitate.
TEHNICA DE LUCRU:
Consta in punerea in contact a limfocitelor sensibilizate, recoltate de la pacient, cu Atg corespunzator
(reprezentat de celule-tinta cum sunt celulele tumorale, celulele unei alte specii sau allotip decat cele ale
donatorului).
In situatia in care exista un raspuns imun celular indreptat fata de celulele-tinta, in monostratul ce-lular apar
modificari citotoxice sau chiar plaje, cauzate de actiunea limfotoxinei eliberate de limfocitele sensibilizate,
dovedind reactia imuna mediata cellular.
Aprecierea citotoxicitatii se face prin teste de viabilitate celulara sau prin masurarea eliberarii de izotop
radioactive.
In varianta cea mai utilizata, celulele din culturi (celulele-tinta) sunt in prealabil marcate cu crom radioactiv
(51Cr).
Cand limfocitele subiectului testat au un efect citotoxic, prin factorul limfotoxic eliberat, are loc liza
celulara cu eliberarea in mediul culturii celulare a cromului radioactive;
Intensitatea radioactivitatii va masura gradul de citotoxicitate.

20
21