INVESTIGAŢIA BACTERIOLOGICĂ ÎN TUBERCULOZA (TB) PULMONARĂ

Tuberculoza (TB) este o afecţiune care poate afecta orice organ al corpului uman.
Unele particularităţi în privinţa căilor de transmitere şi condiţiile biologice de multiplicare ale
mycobacteriei tuberculoase fac ca localizarea cea mai frecventă să fie respiratorie. Drept urmare,
pentru diagnosticul bacteriologic al TB vom folosi ca schelet modul de efectuare al
examenului bacteriologic în TB pulmonară.

Pentru localizările extrarespiratorii care se pretează la examen bacteriologic pentru bK, diferă
doar produsele patologice ce trebuiesc recoltate, celelalte manopere fiind comune.
În TB pulmonară, examenul bacteriologic pentru bK se practică din spută.

11. 1. Situaţiile în care se practică examenul bacteriologic din sputa pentru bK

 la toate persoanele suspecte de TB pulmonară, în scop diagnostic, înainte de aplicarea
tratamentului antibacilar. De asemenea, se recomandă ca persoana suspectă de a fi bolnavă de
TB pulmonară, să nu fie tratată anterior cu fluorochinolone;
 la bolnavii cu TB pulmonară diagnosticată, supuşi tratamentului antibacilar pentru
monitorizarea evoluţiei sub tratament;
 la foştii bolnavi de TB pulmonară tratată şi vindecată pentru a se verifica stabilitatea vindecării.
Rezultatele examenului bacteriologic pentru bK vor fi fiabile, dacă vor fi îndeplinite următoarele
etape, în succesiune obligatorie, fiecare etapă fiind de importanţă egală cu celelalte.

11. 2. Etapele examenului bacteriologic al spuitei pentru bK

1. Recoltarea;
2. Transportul;
3. Prelucrarea produsului patologic;
4. Examinarea frotiurilor şi culturilor;
5. Notarea şi interpretarea rezultatelor.

1. Recoltarea sputei
Pentru recoltarea probelor de spută trebuie să existe la nivelul tuturor Cabinetelor de
Pneumoftiziologie teritoriale, în cadrul secţiilor cu paturi, sau după caz, pe lângă laboratoarele de
bacteriologie, o cameră specială (camera sau boxa de recoltare). Camera va fi bine ventilată prin
fereastră, dotată cu lampă de ultraviolete şi aparat cu aerosoli pentru provocarea tusei şi a
expectoraţiei. Camera va fi prevăzută cu un geam care să permită supravegherea recoltării de
către personalul medical.
La nivelul cabinetelor medicilor de familie, recoltarea se va efectua în spaţii ferite de accesul
obişnuit al publicului (în aer liber sau într-o cameră izolată, bine ventilată).
Recoltarea sputei se va face în recipiente, de preferat, din plastic transparent pentru a putea
evalua calitatea sputei. Pentru a evita contaminarea, dimensiunile recomandate pentru recipienţi
(recolta) sunt: 3-4 cm diametru, 5-6 cm înălţime, 30-50 ml capacitate. Recoltoarele trebuie să fie
prevăzute cu capace care se înşurubează.
În conformitate cu prevederile Progranmului Naţional de Control al Tuberculozei (PNCT) de la
fiecare persoană căreia i se practică examenul bacteriologic de spută pentru evidenţierea bK
trebuie să i se recolteze trei prelevate, după cum urmează:
  un prelevat de spută la prima prezentare la medic, recoltat sub supraveghere;
 al II-lea prelevat, a doua zi dimineaţa, la domiciliul persoanei suspecte  spută
matinală autorecoltată;
 al III-lea prelevat de spută recoltat tot sub supraveghere când pacientul se
prezintă cu cel de al II-lea prelevat.
Înainte de recoltare asistentul medical şi medicul trebuie să explice pacientului că trebuie să facă
examen de spută pentru a evidenţia bacilul Koch. Limbajul folosit de cadrele medicale va fi
adaptat nivelului educaţional al pacientului.
Asistentul medical completează pe peretele lateral al recoltarului de spută datele de identificare
(nume, prenume, unitateamedicul care trimite, data recoltării, numărul specimenului de spută).
De asemenea, asistentul completează formularul tip de solicitare a examenului bacteriologic
(vezi Formular pe ex. bacteriologic).
Înaintea recoltării prelevatului de spută, pacientul trebuie corect instruit.
Pacientul este învăţat să clătească gura cu apă pentru a îndepărta resturile alimentare. Pentru
prelevatul de spută recoltat matinal, bolnavul trebuie să se spele pe dinţi înainte de recoltarea
sputei. Pacientul trebuie să înţeleagă că trebuie să recolteze în recoltor un produs patologic
provenit din profunzimea arborelui traheobronşic obţinut în urma unui acces de tuse.
I se arată pacientului cum se deschide capacul recoltorului, cum să realizeze câteva inspiraţii
profunde urmate de câteva secunde de apnee pentru o bună mobilizare a secreţiilor
traheobronşice şi inducerea tusei.
Recoltarea propriu-zisă decurge astfel:
 asistentul medical înmânează pacientului recoltorul pentru spută;
 pacientul merge în camera de recoltare a sputei unde este supravegheat prin geamvizor. Dacă
nu există cameră de recoltare, atunci bolnavul expectorează în recoltor în aer liber. La
întoarcerea pacientului din camera de recoltare se verifică cantitatea şi calitatea sputei. Cantitatea
de spută necesară este de 3-5 ml spută purulentă. Dacă cantitatea şi calitatea sputei nu corespund
se repetă colectarea.
În articolul apărut în American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, vol. 161,
2000, John R. Worren şi colaboratorii de la Departamentul de Patologie şi Medicină
Northwestern, Chicago (Illinois) recomandă o cantitate de spută de minim 5 ml care creşte
sensibilitatea examenului bacteriologic pentru bK de la 75 % la 92 %.
La persoanele care nu tuşesc şi nu expectorează spontan sau care înghit expectoraţia (femei,
copii) se folosesc tehnici de provocare a sputei;
 aerosoli în soluţie NaCl 10 %, încălzită la 360 o perioadă de 10-15 minute care stimulează
expectoraţia;
 tubajul gastric cu sonde Nelaton sau Einhorn folosit în special la copii şi femei;
 lavajul laringotraheal în ser fiziologic steril;
 fibrobronhoscopie cu examen bacteriologic pentru bK al aspirantului bronşic sau al lichidului
de la lavajul bronhoalveolar.
Recoltarea cu prelevatele de spută trebuie păstrate în frigiderul din camera de recoltare până sunt
transportate la laboratorul de bacteriologie.

11. 3. Examenul bacteriologic în TB extrapulmonară

Diagnosticul TB extrapulmonare este dificil şi se face prin extinderea altor condiţii patologice de
către medicii din specialităţile implicate.
Dacă există localizări multiple din care cel puţin una este pulmonară, primează diagnosticul de
TB pulmonară.
În TB extrapulmonară se pretează pentru examen bacteriologic lichidul din seroase, lichidul
cefalorahidian, urina, sângele menstrual, secreţii cervicale, punctat ganglionar sau articular,
fragmente bioptice.
Recoltarea se face în condiţii sterile pentru a evita contaminarea produselor şi a permite
efectuarea culturilor, fără decontaminare prealabilă.
Fragmentele bioptice nu se pun în formol (care omoară bacilii) decât după însămânţarea
culturilor pentru BK.
Pleurezia tuberculoasă
Examenul bacteriologic se practică din lichidul pleural extras prin puncţie pleurală.
Lichidul pleural este în majoritatea cazurilor serocitrin, exudat cu concentraţie a proteinelor peste
3g100 ml, LDH pleuralLDH sânge23, citologie în limfocite peste 80 %. Examenul
bacteriologic pentru bK este rareori pozitiv în culturi (aproximativ 10 %). Biopsia pleurală
confirmă diagnosticul până la 80 %.
Pericardita tuberculoasă
Examenul bacteriologic pentru bK se efectuează din lichid pericardic extras prin puncţie
pericardică. Lichidul pericardic este exudat, serosanguinolent cu 500-50.000 elementemm3,
predominant mononucleare.
Examenul bacteriologic pentru bK este pozitiv în 25-30 % din cazuri pe frotiu şi în cultură.
Alteori este necesară biopsia pericardică sau pericardotomia pentru diagnostic.
Meningita tuberculoasă
Examenul bacteriologic pentru BK se efectuează din lichidul cefalorahidian (LCR) extras prin
puncţie rahidiană. Lichidul cefalorahidian în meningita bacilară este clar sau opalescent, cu
proteinorahie uşor crescută (până la 5 gl), glicorahie scăzută (sub 400 mg %), leucocitoză cu
limfocitoză în jur de 500mm3 cu predominenţa polimorfonuclearelor la începutul bolii, iar mai
târziu a limfocitelor.
Examenul microscopic al LCR este rar pozitiv, culturile pentru BK fiind uneori pozitive.
Limfadenita tuberculoasă
Examenul bacteriologic al BK se efectuează din puroiul extras de la nivelul ganglionilor
inflamaţi.
Sensibilitatea diagnosticului limfadenopatiei tuberculoase atinge 80% prin biopsia ganglionilor.
Tuberculoza osoasă
Examenul bacteriologic pentru BK din prelevat obţinut prin puncţie aspirativă sau, mai frecvent,
examen histopatologic al piesei de biopsie recoltată chirurgical.
Tuberculoza peritoneală
Examenul bacteriologic pentru mycobacteria tuberculoasă (MTB) se efectuează din peritoneal.
Lichidul este exudat (cu peste 5 g% proteine) şi 50-10.000 leucocitemm3, majoritatea limfocite.
Frotiul este rar pozitiv pentru MTB, iar culturile sunt pozitive în 50 % din cazuri.
Tuberculoza genitală
Examenul bacteriologic pentru MTB se efectuează din sânge menstrual, secreţii cervicale,
produs obţinut din chiuretaj uterin, lichid obţinut prin puncţia parametrelor.
Tuberculoza urinară
Examenul bacteriologic pentru MTB se efectuează din urina recoltată matinal (circa 250 ml),
două zile consecutiv după o toaletă riguroasă şi după suspendarea 2-3 zile a antibioticoterapiei,
administrări de vitamina C. Datorită paucibacilarităţii urinii, se practică şi inocularea la cobai.
2. Transportul sputei
Transportul recoltoarelor cu spută la cel mai apropiat laborator de bacteriologie va fi făcută de
cadrul medical desemnat, într-un interval de timp care nu trebuie să depăşească 5 zile. În această
perioadă recoltoarele se păstrează la întuneric şi la 40 C (frigider).
Pe perioada transportului, recoltoarele vor fi aşezate în cutii speciale de plastic prevăzute cu
despărţituri pentru o bună fixare a acestora. Recoltoarele vor fi corect notate în datele de
identitate a persoanelor de la care s-a recoltat sputa.
Prelucrarea produselor
Prelucrarea produselor cuprinde totalitatea manoperelor la care este supusă sputa sau alt produs
patologic pentru evidenţierea MTB pe frotiu (ex. microscopic), pe mediu de cultură (ex. cultură).
De asemenea la nivelul laboratorului de bacteriologie pentru bK se testează sensibilitatea
germenului la medicamentele antibacilare (antibacilare).
Examenul microscopic
Examenul microscopic se practică pe frotiu obţinut din spută. Frotiul se prepară steril (ansă
bacteriologică) întinzând pre lamă o particulă purulentă din spută într-un strat subţire şi omogen.
Frotiul trebuie să măsoare circa 5 cm lungime şi 1 cm înălţime. Frotiul se usucă la aer şi se
fixează prin încălzire la flacără, apoi se colorează şi se examinează la microscop.
Metodele de identificare ale MTB se bazează pe proprietatea de acido-alcoolo rezistenţă a
acesteia.
Pentru colorarea frotiurilor există două metode în funcţie de modalitatea de citire a acestora: în
lumină obişnuită sau în fluorescenţă.
Metoda Ziehl Nielsen este standardul de referinţă pentru examenul microscopic. Ea se
realizează prin acoperirea completă a lamei cu frotiul fixat cu 3-4 ml fucsină bazică. Se
încălzeşte lama de 3 ori în 10 minute până la emiterea de vapori. Colorantul se varsă şi lama se
spală bine în apă de robinet.
Decolorarea se face acoperind lama cu o soluţie de alcool clorhidric 3 % timp de 3 minute. Se
spală frotiul cu apă de robinet şi dacă nu este suficient decolorat (nu are culoarea roz) se repetă
decolorarea.
Colorarea complementară (recolorarea) se realizează prin acoperirea lamei în albastru de metilen
1 % timp de 1 minut.
Microscopia directă este o metodă simplă, rapidă (durează 12 ore), ieftină şi uşor repetabilă.
Sensibilitatea metodei este relativ redusă, deoarece permite identificarea agentului patogen doar
în sputa intens baciliferă (5.00010.000 germeni/ml produs biologic). De asemenea, ea nu oferă
nici o informaţie asupra viabilităţii germenilor (bacilii vii sau morţi ) şi nici asupra identităţii
lor.
Metoda are o mare importanţă epidemiologică, deoarece ne oferă posibilitatea de a diagnostica
rapid cazurile de TB pulmonară intens eliminatoare de bacili, urgenţe epidemiologice, care
trebuie supuse imediat tratamentului antibacilar.
Pentru TB extrapulmonară unde probele biologice sunt frecvent paucibacilare, examenul
microscopic are un aport diagnostic mic, el fiind de obicei negativ. În aceste situaţii, prelevarea
de mai multe produse biologice şi concentrarea acestora prin centrifugare pot creşte sensibilitatea
examenului microscopic de 2-4 ori.
Coloraţia cu fluorocromi
Microscopia cu fluorescenţă presupune examinarea în raze ultraviolete a frotiurilor colorate cu
fluorocromi (auraminărhodamină).
Colorantul auraminărhodamină se prepară dizolvând 100 ml apă distilată, prin agitare, a 0,010 g
rhodamină. Testarea calităţii colorantului este obligatorie ca şi în cazul tucsinei bazice. Ea se
face pentru orice colorant nou şi pentru soluţiile mai vechi de o lună. Testarea se efectuează prin
colorarea unor frotiuri din produse cunoscute a fi bK pozitive.
Colorarea frotiurilor se realizează acoperind lamele cu colorant timp de 5 minute, la rece. Lamele
se spală apoi cu apă de robinet.
Decolorarea se face 15-25 secunde cu alcool clorhidric 3 ‰. Ulterior se spală folosind apă de
robinet.
Recolorarea se face 1 minut cu albastru de metilen 1 %, după care lamele se spală.
Cultura mycobacteriilor
Cultura mycobacteriilor reprezintă metoda de referinţă pentru diagnosticarea TB având o
sensibilitate net superioară microscopiei, dând o proporţie ridicată de rezultate pozitive, chiar
pentru sputele paubacilare (10-100 germeni inoculaţi). Pentru acest considerent, ea reprezintă
procedeul electiv de confirmare a diagnosticului de tuberculoză. Cultura creşte astfel numărul de
cazuri de TB confirmate bacteriologic.
De asemenea, examenul prin cultură are avantajul de a demonstra viabilitatea germenilor izolaţi,
de a permite (alături de alte metode) stabilirea identităţii mycobacteriilor (bacili umani, bacili
bovini, bacili atipici) şi de a testa sensibilitatea mycobacteriilor tuberculoase (MTB) la
medicamentele antibacilare (antibiograma).
Mediile de cultură cele mai folosite sunt cele solide: mediul Löwenstein-Jensen, mediul
Tebeglut.
Cultura pe mediul Löwenstein-Jensen reprezintă standardul de referinţă pentru izolarea MTB.
Mediul Löwenstein-Jensen este un mediu complex, care are în compoziţie: ou  60 %;
asparagină, glicerol, oligoelemente, feculă de cartof şi colorantul  verde malahit.
Tehnica de însămânţare cu picătura
Din recipientul cu spută, cu ajutorul unei pipete Pasteur se aleg 2-3 particule purulente, care se
pun într-o eprubetă mare (18/180 mm) sterilă. Alegerea corectă a particulelor purulente este
esenţială pentru realizarea unei însămânţări cu rezultate bune. Peste spută se adaugă în eprubetă
10 picături de soluţie 4 % de hidroxid de sodiu şi o picătură de indicator. Se agită bine
eprubetele, timp de 5 minute şi se menţin 30 minute la 370 C.
Produsele tratate se neutralizează cu o soluţie 15 % de fosfat monopotasic sau cu acid clorhidric
8-10 % până la virarea culorii indicatorului în verzui-galben (albastru de bromtimol) sau în roz
ametist (turnesol). Se adaugă în fiecare eprubetă cu produs o picătură din soluţia de 8000 u/ml
Penicilină.
Cu pipeta Pasteur, se însămânţează o cantitate de 0,8-1 ml din produsul prelucrat, pe minimum 3
tuburi cu mediul Löwenstein-Jensen.
Se ard şi se înfundă dopurile de vată ale eprubetelor însămânţate şi înclinând eprubetele se spală
bine întreaga suprafaţă a mediului cu inoculul introdus. Eprubetele înclinate aproape orizontal se
aşază pe tăvi şi se ţin 24-48 ore la 370 C, în funcţie de cantitatea de lichid. După acest interval se
închid bine cu capsule de cauciuc peste dopul de vată sau se parafinează. Se incubează la 370 C
timp de 2 luni.
Această tehnică se poate folosi pentru însămânţarea oricărui produs, cu precizarea că în cazul
lichidului de spălătură bronşică sau gastrică sau al urinii, să se efectueze în prealabil o
centrifugare (10 minute la 2000 turaţii/minut) şi sedimentul obţinut să se supună decontaminării.
Cultura pe medii lichide cu detecţie radioactivă/fluorescentă a creşterii mycobacteriilor permite
detectarea creşterii mycobacteriilor după 1-2 săptămâni. Metoda este scumpă şi mai puţin
disponibilă.

11. 4. Antibiograma (ABG)

Antibiograma oferă informaţii asupra sensibilităţii sau rezistenţei tulpinii izolate de la pacientul
respectiv la medicamentele antituberculoase.
Realizarea antibiogramei pentru mycobacteria tuberculoasă (MTB) este relativ dificilă, poate fi
grevată de erori şi are costuri relativ ridicate. În mod clasic, antibiograma se realizează prin
metoda concentrărilor absolute şi metoda proporţiilor. Aceasta din urmă este rezervată unor
anchete naţionale de testare a sensibilităţii şi în scop de cercetare.
Testarea sensibilităţii este obligatorie la pacienţii aflaţi în retratament la care este posibilă
instalarea unei rezistenţe secundare (dobândite), precum şi la pacienţii contacţi cu cazuri de TB
chimiorezistentă la care este posibilă o rezistenţă iniţială.
Rezistenţa unei tulpini cu MTB la un medicament antibacilar este definită cantitativ, atunci când
există o proporţie semnificativă de mutanţi rezistenţi în populaţia mycobacteriană respectivă. În
conformitate cu Managementul cazurilor de tuberculoză multidrog rezistentă (TB MDR)
antibiograma devine obligatorie în următoarele situaţii:
 pentru toate tipurile de MTB izolate de la bolnavii la retratament;
 pentru cazurile noi, din culturile pozitive din sputa de la T2, dacă microscopia este pozitivă la
T4;
 la toate tulpinile izolate după 3 luni de tratament;
 la cazul nou contact cu MDR, din cultura de la T0;
 pentru pacienţii  culturi pozitive la T0, T6, şi T12;
MDR:
 orice cultură pozitivă apărută după
conversia bacteriologică
 pentru supravegherea dinamicii incidente MDR se vor efectua teste de sensibilitate la HIN şi
RMP la toate culturile pozitive, înainte de începerea tratamentului în laboratoarele de nivel III în
care se asigură controlul intern şi extern de calitate.
Dacă laboratorul de nivel III indică tulpini de M. Tuberculosis cu chimiorezistenţă, aceste tulpini
vor fi trimise la Laboratorul Naţional de Referinţă la care este arondat laboratorul în vederea
confirmării rezistenţei, testări la celelalte medicamente antituberculoase (linia I şi a II-a) şi
identificarea tipului de mycobacterie.
Metode de efectuare a antibiogramei
Antibiograma directă
Foloseşte ca inocul produsul patologic cu conţinut mare de BAAR, după decontaminarea
acestuia. Metoda este folosită în situaţii excepţionale pentru aflarea cât mai rapidă a spectrului de
activitate. Deoarece este imposibilă etalonarea inoculului, metoda este grevată de erori.
Rezultatele sunt pur orientative şi de aceea metoda nu este recomandată pe scară largă.
Antibiograma indirectă
Inoculul se prepară din cultura mycobacteriană. Există mai multe metode standardizate.
Metoda concentraţiilor absolute
Determină cea mai mică concentraţie de medicament antituberculos care inhibă creşterea
mycobacteriilor sau permite creşterea a mai puţin de 20 colonii din inoculul standardizat.
Interpretarea rezultatelor se face la 21 zile după însămânţarea inoculului.
Rezultatele sunt mai puţin confidente decât cele obţinute prin metoda proporţiilor, dar asigurarea
condiţiilor tehnice este mai simplă şi costul mai redus.
Metoda proporţiilor
Măsoară proporţia de mutanţi rezistenţi din totalul populaţiei mycobacteriene pentru diferite
concentraţii critice de medicament antituberculos închis în mediul Löwenstein-Jensen.
Metoda este apreciată ca fiind cea mai confidentă, dar are costuri mai mari ce derivă din
necesitatea condiţii tehnice deosebite.
Interpretarea rezultatelor se face la 28 zile şi dacă nu s-a obţinut creşterea, se reinterpretează la
40 zile.
Metoda raporturilor de rezistenţă
Realizează comparaţia între concentraţia minimă inhibitoare de medicament antituberculos
necesară pentrun tulpina de testat şi concentraţia minimă inhibitoare necesară pentru tulpina de
referinţă H37Rv (sensibilă).
Metode rapide de antibiogramă
Sistemul BACTEC 460
Este un sistem rapid de cultivare a mycobacteriilor, care poate fi util şi pentru antibiogramă.
Rezultatul parvine rapid  mai puţin de 10 zile. Metoda este rapidă, dar scumpă.
Sistemul MGIT 960
Realizează rapid culturi pentru MTB, având posibilitatea de a efectua automat antibiograme
pentru tulpinile mycobacteriene izolate.
Metoda este scumpă, putând fi utilizată doar în ţări cu resurse financiare suficiente.
În România, antibiograma se efectuează prin metoda concentraţiilor absorbite pentru cele două
medicamente antituberculoase majore: HIN şi RMP. Laboratoarele naţionale de referinţă (LNR)
efectuează antibiograme şi pentru celelalte medicamente antituberculoase (antibiogramă lărgită).
Rezultatele testelor de sensibilitate, indiferent cât de corect efectuate, rămân orientative. Din
acest punct de vedere pot exista uneori neconcordante între antibiogramă şi evoluţia sub
tratament.
Pentru HIN şi RMP rezultatele antibiogramei sunt cele mai confidente, mai ales dacă sunt
efectuate în laboratoarele care asigură controlul intern şi extern.
Pentru celelalte medicamente şi în special pentru antibacilarele de rezervă (de linia a II-a),
rezultatele antibiogramei pot fi mai frecvent grevate de erori.
Examinarea frotiurilor şi culturilor
Frotiurile colorate prin metoda Ziehl-Nielsen se examinează cu microscop optic, cu obiectiv
cu imersie ( 100) şi ocular ( 8 sau  10):
 se controlează dacă sursa de lumină este reglată şi focalizată, iar condensatorul ridicat sus, cu
diafragmul închis;
 cu o baghetă de sticlă se pune o picătură de ulei de cedru pe frotiu şi lama se aşează pe platoul
microscopului. Este interzis să se atingă frotiul cu bagheta în uleiul de cedru (uleiul se poate
contamina cu BAAR);
 se coboară obiectivul cu imersie până atinge picătura de ulei de pe lamă;
 privind pe ocular se manevrează viza macrometrică ridicând încet obiectivul până când apare
imaginea colorată a frotiului. În timpul examinării se manevrează mereu viza micrometrică
pentru a avea o imagine clară;
 se parcurge frotiul în întregime (echivalentul a 100 de câmpuri), câmp după câmp, căutând
bacili de la centru spre periferia câmpului;
 pentru a declara un frotiu negativ se examinează minimum 300 de câmpuri (echivalentul
parcurgerii de trei ori a frotiului).
Bacilii acido-alcool rezistenţi (BAAR) au aspect de bastonaşe fine, drepte sau uşor incubate,
deseori granulate, izolate sau grupate în perechi sau grămezi, de culoare roşie pe fond albastru.
Fracţiunile colorate cu auramină-rhodamină se vor examina în cameră întunecată la un
microscop echipat pentru examinarea în fluorescenţă. Microscopul este, fie un tip special, fie un
microscop binocular obişnuit la care se ataşează sursa de raze ultraviolete şi o trusă de filtre care
cuprinde filtrele de excitaţie şi filtrele de secţiune (ocularele).
Filtrele de excitaţie se montează la ieşirea fasciculului de RUV din lampă şi are rolul de a
intensifica fasciculul de raze ultraviolete, absorbind celelalte radiaţii. Filtrele de secţiune se
adaptează la ocularul microscopului având rolul de a reţine razele ultraviolete lăsând să treacă
numai razele din spectrul vizibil emise de fluorocromi. Fluorocromii au proprietatea de a
transforma razele ultraviolete (RUV), aflate în spectrul invizibil, în raze luminoase, din spectrul
vizibil.
Examinarea frotiurilor se face fără ulei de cedru pe lamă cu obiectivul 20 x şi cu ocularul 10 x.
Bacilii acido-alcoolo rezistenţin apar ca bastonaşe subţiri, uşor incubaţi, uneori granulaţi, de
culoare galben strălucitor pe fond negru (cer în stele).
Artefactele (zgârieturi ale lamei, precipitate) pot apare fluorescente, dar sunt de culoare verzuie.
Examinarea frotiului se face cu uşurinţă, permiţând ca într-un interval scurt de timp să se
parcurgă un număr mare de câmpuri (de 10 ori mai mare la acelaşi interval de timp, faţă de
metoda Ziehl-Nielsen).
Metoda are un randament mai mare, folosindu-se în laboratoarele de bacteriologie care
procesează zilnic un număr mare de prelevate de spută.
Sensibilitatea metodei este mai scăzută, mai ales în cazul cadre mai puţin experimentate. Pentru
cazurile problemă se recomandă şi efectuarea de frotiu colorat Ziehl-Nielsen.
Ca şi în cazul coloraţiei Ziehl-Nielsen, coloraţia în auraminărhodamină permite numai
afirmarea prezenţei bacililor acido-alcoolo-rezistenţi, fără a specifica că este vorba de
Mycobacterium tuberculosis (bacilul Koch).
Examinarea culturilor înseamnă controlul creşterii coloniilor pe întreaga perioadă de două luni
cât culturile se ţin la termostat.
Controlul regulat bilunar sau preferabil săptămânal, este esenţial pentru obţinerea unor rezultate
bune în diagnosticul bacteriologic prin cultură al tuberculozei.
Orice întârziere în efectuarea controalelor va întârzia confirmarea diagnosticului de tuberculoză
al unor bolnavi. Un program minim de control al culturilor constă din 5 controale.
În cursul acestor controale se vor tria şi nota în registrul de culturi toate însămânţările infectate
care se vor exclude de la interpretarea rezultatelor.
Important este ca în registrul să fie notate tuburile pe care sau dezvoltat colonii cu caractere
tipice sau atipice de bacili tuberculoşi sau de alte mycobacterii.
Microscopic, coloniile de mycobacterie tuberculoasă de tip uman (B.K.) sunt de culoare crem
(alb-gălbui), rotunde, rugoase, cu suprafaţă aspră, izolate sau confluente, în funcţie de densitatea
bacililor din inoculul iniţial, realizând în ansamblu un aspect conopidiform.
Coloniile de mycobacterie tuberculoasă de tip bovin sunt mai mici, albe, mai plate, mai spălăcite.
Examenul macroscopic (morfologic) al coloniilor permite chimic precizarea caracterului rough
eugoric, de probabilitate a prezenţei bacilului tuberculozei de tip uman şi diferenţierea lui de
bacilul bovin, de bacilul de tip uman cu caractere modificate ca şi de alte mycobacterii.
Pentru diferenţierea strictă a tipului de colonii şi pentru un diagnostic bacteriologic de precizie,
se recomandă examen al frotiului efectuat din colonii şi colorat Ziehl-Nielsen şi teste speciale:
testul niacinei, testul catalazei.

Notarea şi interpretarea rezultatelor

Notarea rezultatelor pentru metoda Ziehl-Nielsen (x 1000)
Nr. Nr. Notarea Notarea
BAAR câmpuri rezultatului rezultatului
de citit cantitativ semicantitativ
0 300 BAAR negativ BAAR negativ
Nr./300  rezultat incert
1  2/300 300 rezultat incert (se repetă)
(se repetă)
1  9/100 300 Nr./1000 1  ()
1  9/10 100 Nr./100 2  ()
1  9/1 50 Nr./10 3  ()
> 9/1 25 Nr./10 4  ()

Rezultatele pozitive se exprimă raportând totalul bacililor număraţi la 100, 10 sau 1 câmp, în
funcţie de densitatea lor pe lamă.
50 BAAR 2 BAAR

25 campuri 1 camp
Ex.:
Datele din tabel sunt valabile pe mărirea  100, considerată mărire standard.
Notarea rezultatelor la examenul microscopic prin fluorescenţă şi echivalarea lor cu
rezultatele metodei ZiehlNielsen
Fluorescenţă Notare Ziehl-Nielsen
(x 200  250) semicantitativă (x 800  1000)
0 BAAR negativ 0
1  2/300  1  2/3000
1  9/100 1  () 1  9/1000
1  9/10 2  () 1  9/100
10  90/10 3  () 1  9/10
> 90/10 4  () > 9/10

Notarea semicantitativă a rezultatelor este obligatorie, indiferent de metoda folosită (Ziehl-

Nielsen sau fluorescenţă), deoarece ea oferă un indicator simplu şi unitar al densităţii BAAR pe
frotiu, permiţând comparaţii inter şi intraindividuale precum şi între laboratoare, atunci când se
utilizează metode diferite.
Notarea rezultatelor pentru examenul de cultură
 sub 20 colonii pe toate tuburile = nr. total colonii / nr. tuburi;
 între 20 şi 100 colonii numărabile / 1 tub = + ;
 peste 100 colonii  nenumărabile şi izolate / 1 tub = ++ ;
 colonii confluente / 1 tub.
Rezultatele de cultură negativă se vor elibera la 2 luni.
O atenţie deosebită trebuie acordată rezultatelor culturilor cu colonii puţine sau 1-2 colonii.
Aceste date trebuie comunicate clinicianului, deoarece acesta decide prin corelarea cu datele
clinice dacă este vorba de o TB activă, sau dacă mai este necesară o confirmare ulterioară sau o
infirmare a rezultatului.
Confirmarea sau infirmarea diagnosticului de TB activă în cazul culturilor BK pozitive cu foarte
rare colonii se poate efectua printr-o urmărire bacteriologică timp de 3 luni prin controale lunare
a câte minimum 3 produse, la care se vor efectua atât examene microscopice cât şi culturi. Dacă
apar şi alte culturi sau examene microscopice pozitive se confirmă diagnosticul de TB activă.
Dacă rezultatele examenelor vor rămâne negative se infirmă diagnosticul de TB activă.
Notarea rezultatelor antibiogramei
Tulpini sensibile tulpini inhibate de concentraţiile critice de medicamente
antituberculoase, similare cu cele realizate in vivo prin administrarea
corectă a dozelor standard.

Tulpini rezistente tulpini care au capacitatea de a creşte în prezenţa unor concentraţii de

medicamente antituberculoase care inhibă în mod normal tulpini
sensibile.

Sensibilitate absenţa creşterii sau mai puţin de 20 colonii pe tuburile cu

medicamente antituberculoase.

Rezistenţa creştere pe tubul cu tuberculostatic asemănătoare cu aceea de pe

tubul martor.

Nu se acceptă noţiunea de rezistenţă parţială.

Semnificaţia rezultatelor la examenul microscopic şi cultură diferă după cum e vorba de un
bolnav netratat sau un bolnav aflat sub tratament antituberculos.
La bolnavul netratat putem avea următoarele situaţii:
M+C+ bolnavul are TB pulmonară  formă intens baciliferă (urgenţă
epidemiologică)
M-C+ bolnavul are TB pulmonară  formă paubacilară
M-C- bolnavul poate avea TB pulmonară care să nu se confirme bacteriologic prin
erori de tehnică de examen bacteriologic

bolnavul poate avea TB pulmonară  o formă în care să nu elimine bacili

(formă de boală incipientă)
bolnavul nu are TB pulmonară

La bolnavul cu TB pulmonară sub tratament specific, putem avea următoarele situaţii:

M-C- examenul microscopic şi examenul de cultură negative, după rezultate iniţial
pozitive. Rezultă un tratament eficace.
M+C- examenul de microscopie pozitivă, cultură negativă; evoluţie bacteriologică
favorabilă, deoarece microscopia pozitivă cu cultură negativă arată că
bolnavul elimină bacili morţi cu viabilitate compromisă cadavre bacilare
M+C+ la bolnavul sub tratament, cultura pozitivă are semnificaţie de evoluţie
nefavorabilă, dacă se menţine pozitivă la 90 de zile de la începutul
 tratamentului antibacilar.

Microscopia pozitivă stabileşte rapid diagnosticul de TB pulmonară, identificând marile surse

contaminatoare (urgenţe epidemiologice).
Cultura stabileşte diagnosticul pentru cazurile de boală, formele paucibacilare şi permite
aprecierea eficacităţii chimioterapiei antibacilare, fiind un indiciu cert al debacilizării atunci când
rezultatul este negativ.
Efectuarea examenului bacteriologic pentru evidenţierea BK în scop diagnostic în TB
pulmonară, presupune o mare responsabilitate. Un rezultat eronat (fals pozitiv) face ca pacientul
să fie supus tratamentului antibacilar, care se dovedeşte în această situaţie intempestiv.
Rezultatul eronat (fals negativ) la momentul de diagnostic privează bolnavul de tratament
antibacilar cu agravarea lezională şi risc vital.
Examenul microscopic al sputei poate fi grevat de erori de tehnică şi interpretare.
Factorii care generează rezultate fals pozitive sunt:
 particule acido-rezistente care nu sunt bacili tuberculoşi, particule alimentare, uleiuri
(recoltarea de spută se face a jeune după clătirea gurii cu apă);
 precipitate de coloranţi (se vor folosi soluţii proaspete de coloranţi);
 germeni saprofiţi din apă;
 fibre de lână, bumbac  apar izolat doar într-un câmp microscopic;
 zgârieturi pe lamă (puncte paralele mai lungi ca bacilii tuberculoşi care apar în porţiunile
inferioare ale lamei);
 transfer de bacili de pe alt frotiu (fiecare lamă se tratează izolat, picătorul de ulei de cedru nu
va atinge lama, obiectivul microscopului va fi curăţat după fiecare examinare);
 notare greşită a rezultatelor printr-o incompletă stăpânire a tehnicii.
Factorii care generează rezultate fals negative sunt:
 recoltarea incorectă a sputei (salivă, secreţii nazofaringiene);
 conservarea incorectă a eşantioanelor de spută (expunere la soare stocare în mediu cald şi
uscat);
 recoltare de spută după instituirea tratamentului antituberculos;
 conservare incorectă a frotiurilor preparate;
 selecţie incorectă de spută la prepararea lamelor (nu se alege o particulă purulentă, cremoasă);
 pregătirea incorectă sau colorarea incorectă a lamei:
  frotiu prea subţire sau prea gros;
  supraîncălzire la fixarea frotiului;
  insuficienta fixare în pierdere de frotiu la
spălare;
  fierbere intensă a colorantului;

  colorarea de contrast intensă ce întunecă

câmpul.
 examinarea incorectă a frotiului:
  lectură nesistematică a frotiului,
prea rapidă;
  discromatopsia examinatorului.
Erori de tehnică şi interpretare a culturilor
Rezultate fals pozitive
 contaminarea de laborator în cursul prelucrării produsului patologic  transfer de bacili de la un
tub la altul în cursul pipetării;
 mycobacterii netuberculoase sau alte microorganisme etichetate drept MTB.
Rezultate fals negative
 medii incorect prelucrate (uscate), medii expirate;
 omogenizare/decontaminare deficitară în contact prelungit al sputei cu soluţia de NaOH (peste
20 minute);
 produs patologic necorespunzător în momentul însămânţării pe mediul de cultură (salivă,
particulă nepurulentă);
 incubare insuficientă ca durată şi cu variaţii de temperatură ale termostatului;
 contaminarea mediilor inoculate.

Factorii de eroare în interpretarea rezultatelor antibiogramei

 inocul incorect etalonat (inoculul standard este de 1 mg/ml): inoculul prea mare dă rezultate de
falsă rezistenţă, iar inoculul prea mic dă rezultate de falsă sensibilitate;
 vârsta culturii: culturile vechi dau falsă sensibilitate. Se recomandă folosirea culturii tinere, în
fază de multiplicare logaritmică de 21-30 zile;
 includerea mediilor antibacilare în mediu: substanţele utilizate trebuie să fie puse în activitate
antibacteriană cunoscută, în ----- corect efectuate şi temperatură de coagulare a mediului strict
standardizată;
 medii depăşite ca termen de valabilitate sau depozite necorespunzătoare.

Completarea formularelor de solicitare/raportare examen bacteriologic pentru tuberculoză

Prima parte din acest formular este completată de medicul pneumolog care solicită examenul
bacteriologic.
În cazul în care această parte este incompletă sau incorectă, ilizibilă, se returnează celui care a
completat-o şi probele nu se lucrează !
Unitatea care solicită: Se scrie spitalul  sanatoriul  dispensarul care face solicitarea. În cazul
spitalelor şi sanatoriilor se va scrie şi secţia  etajul  pavilionul  salonul unde este internat
bolnavul, în funcţie de structura organizatorică a unităţii respective. Medicul solicitant va parafa
formularul.
Nume pacient: Se scrie citeţ numele şi prenumele pacientului cu majuscule de tipar.
Cod numeric personal (CNP): Scris corect, citeţ, din cartea de identitate sau buletinul de
identitate al pacientului. În condiţiile în care pacientul nu are cod numeric personal se va
consemna sexul şi data naşterii în ordinea: 1 (pentru M), 2 (pentru F) şi aa.II.zz, în primele 7
spaţii destinate CNP.
Adresa: Se scrie adresa la care locuieşte pacientul în prezent: judeţ, localitate, stradă, număr, cu
majuscule de tipar.
Sex: Se va bifa sexul pacientului: (M sau F).
Codul pacientului: Se scrie codul pacientului din registrul naţional de tuberculoză, atunci când
este cunoscut.
Fişa de evidenţă nr.: Se notează numărul fişei de declarare dacă este cunoscut.
Foaia de observaţie (FO): Numărul foii de observaţie pentru bolnavii internaţi.
Nr. din registrul de consultaţii: Se completează în condiţiile în care examenul bK este solicitat
pentru un suspect de TB caz nou.
Recoltate de: Se va completa în clar şi cu majuscule de tipar numele şi prenumele persoanei care
a supravegheat recoltarea.
Data: Se scrie data recoltării probelor (zz.II.aa).
Nr. identificare produs: Numărul corespunzător din condica de la camera de recoltare.
Examenul solicitat: Examen Microscopic M; cultura C; antibiograma: ABG: HR; extinsă. În
cazul în care clinicianul solicită ABG, bifează căsuţa corespunzătoare. După primirea
rezultatului culturii copiază de mână acest rezultat pe exemplarul cu rezultatul microscopiei şi
returnează laboratorului local copia pe care este completat atât rezultatul microscopiei, cât şi al
culturii, pentru ca aceasta să o trimită laboratorului de nivel III (sau LNR-ului, dacă este arondat
direct la LNR sau dacă solicită direct ABG serie extinsă). Clinicianul îşi păstrează copia cu
rezultatul la microscopie, pe care şi-a copiat de mână şi rezultatul de la cultură.
Scopul examinării: Se bifează motivul examinării cu  x : Diagnostic sau Monitorizare; dacă se
T T
bifează Monitorizare, se notează automat şi luna de tratament în căsuţa  T : T2 T4 6 8
ş.a.m.d.
Categoria de bolnav: În căsuţa respectivă se trec simbolurile în funcţie de situaţie: N (caz nou),
R (recidivă), E (eşec), A (abandon), T (transfer), C (cronic).
Alt produs decât sputa: Se menţionează tipul produsului şi cantitatea în ml.
Organizaţia; Laboratorul: Se trece denumirea laboratorului care lucrează proba, cu datele de
identificare (adresă, telefon).
Aspectul sputei: În spaţiul corespunzător fiecărui produs (A; B; C) se va descrie aspectul
macroscopic al sputei astfel: M (seromucos); P = muco-purulent; H = hemoptoică; S = salivă.
Nr. registru de laborator: Numărul corespunzător pacientului şi probelor prelucrate.
Data: Data primirii în laborator şi data eliberării rezultatului (zz.II.aa).
Tabel pentru rezultate: În coloana REZULTAT se trec simbolurile NEG sau POZ în dreptul
fiecărei probe. Simbolul POZ se scrie cu roşu. Gradul de pozitivitate se va consemna prin bifarea
căsuţei corespunzătoare.
Nu se prelucrează. Motivul: Dacă produsul nu poate fi prelucrat se scrie pe scurt motivul.
Efectuat: Se scrie în clar numele şi prenumele celui care a făcut examinarea, urmat de semnătura
acestuia.
Verificat şi validat: Semnătura şi parafa persoanei care a verificat şi validat rezultatele (şef
laborator).
Semnătura de primire rezultat: Cel care primeşte rezultatul îşi scrie în clar numele şi semnează.
Nr. cultură: Coincide cu numărul examenului microscopic şi numărul din registrul de laborator
atribuit bolnavului respectiv.
Tabel pentru rezultate: În coloana REZULTAT se trec simbolurile NEG sau POZ în dreptul
fiecărei probe. Simbolul POZ va fi consemnat în roşu. Gradul de pozitivitate se va consemna
prin bifarea căsuţei corespunzătoare.
Identificare: Se bifează căsuţa corespunzătoare.
Data: Primirii probei şi a eliberării rezultatului.
Nu se prelucrează. Motivul: Dacă produsul nu poate fi prelucrat se scrie motivul.
Efectuat: Se scrie în clar numele persoaneilor care aau făcut decontaminarea şi citirea, urmat de
semnătura acesteiaacestora.
Verificat şi validat: Semnătura şi parafa persoanei care a verificat şi validat rezultatele (şef
laborator).
Semnătura de primire rezultat: Cel care primeşte rezultatul îşi scrie în clar numele şi semnează.