DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN INFECŢIILE VIRALE - GENERALITĂŢI

 
În scopul stabilirii etiologiei virale a unei infecţii activitatea laboratorului de virusologie se desfăşoară în două direcţii
principale:
- identificarea particulelor virale, a antigenelor virale sau fragmentelor genomice în probele recoltate de la bolnav (sânge,
LCR, urină, materii fecale, ţesuturi etc.);
- determinarea răspunsului imun umoral şi celular al organismului faţă de agresiunea virală.
Datorită progreselor ştiinţifice şi tehnice din ultimele decenii s-a ameliorat considerabil activitatea de investigare în
virusologie utilizându-se: microscopia electronică, reacţii de imunofluorescenţă, reacţiile imunoenzimatice (ELISA), cu izotopi
radioactivi (RIA), cu anticorpi monoclonali sau tehnologiile de inginerie genetică.
Principalele etape ale diagnosticului de laborator în infecţiile virale au în vedere: recoltarea şi prelucrarea rapidă şi
obligatorie a produselor patologice; probele de lucru (produsele prelucrate) se inoculează în sisteme biologice sensibile (ou
embrionat, animal de laborator, culturi celulare), iar după replicarea virală şi acumularea de produse proprii virusului şi după etapa
de titrare virală, se trece la identificarea serologică (antigenică) a virusului. Diagnosticul virusologic este completat de
diagnosticul imunobiologic care se bazează pe evidenţierea reactivităţii imune a organismului după impactul cu agresorul viral
(diagnostic serologic şi în unele cazuri se pot evidenţia modificările calitative şi cantitative celulare virus induse - citometrie în
flux).
1. RECOLTAREA ŞI PRELUCRAREA PRODUSELOR PATOLOGICE
Eficienţa examenului de laborator depinde în primul rînd de recoltarea corectă a produselor patologice de la bolnav:
momentul prelevării (se ţine cont de perioada în care virusul este prezent în anumite produse biologice ale organismului în funcţie
de etapele infecţiei virale), locul de unde se recoltează şi tipul produsului (în funcţie de patogenia infecţiei virale; exemplu: în
afecţiunile respiratorii virusul este prezent în secreţiile nazo-faringiene, în cele oculare în secreţia conjunctivală şi lacrimi etc.),
modul de recoltare (în funcţie de produs).

Produsele patologice ce pot fi recoltate de la bolnav pentru izolarea virusurilor:

· afecţiuni ale căilor respiratorii superioare: secreţii nazale, aspirat sau tampon faringian, spălătură nazofaringiană; materii
fecale (virusuri gripale, paragripale, respirator sinciţiale, adenovirusuri, enterovirusuri);
· afecţiuni ale căilor respiratorii inferioare: spută, tampon faringian, aspirat bronşic (virusuri gripale, paragripale, respirator
sinciţiale, adenovirusuri);
· afecţiuni eruptive:
- lichid vezicular (virusul vaccinia, variolic, virusurile grupului Herpes, virusul varicella-zoster, enterovirusuri);
- tampon faringian (enterovirusuri, virusurile rujeolic, rubeolic, variolic);
- fecale (enterovirusuri);
- sânge (virusurile rujeolic, rubeolic, variolic).
· afecţiuni diareice: fecale (rotavirusuri, adeno şi coronavirusuri);
· afecţiuni ale sistemului nervos central:
- LCR (enterovirusuri, virusurile grupul Herpes, virusul urlian, unelearbovirusuri);
- sânge (arbovirusurile);
- fecale (enterovirusuri);
- tampon faringian (enterovirusuri, virusul urlian, grupul Herpes);
- salivă (virusul rabic);
- creier prin biopsie postmortem (toate virusurile mai sus menţionate);
· paratidita: tampon faringian (virusul urlian, virusul paragripal 3);
· conjunctivită (keratoconjunctivită): tampon conjunctival, lacrimi (adenovirusuri, enterovirusuri, grupul Herpes, virusul
vaccinal);
· afecţiuni severe, hemoragice: sânge, LCR (arbovirusuri, arenavirusuri, Ebola, Lassa, Marburg);
· SIDA: sânge, LCR (HIV);
· hepatita: sânge, materii fecale (virusurile hepatitice: B, C, D, A, E).
Materiile fecale şi secreţia nazofaringiană se recoltează în prima şi a doua săptămână de la debut, LCR în prezenţa semnelor
clinice de meningită, sângele (cheagul) în perioadele de viremie (în prima săptămână de boală clinic aparentă), produs de leziune
cutanată (când leziunile sunt în stadiul de veziculă), ţesut nervos în cazurile letale.
 Transportul produselor la laborator se face la temperatură joasă (recipient cu gheaţă, termos cu zăpadă carbonică), păstrarea
se face în mediu conservant pentru o perioadă scurtă (o săptămână pentru enterovirusuri, 2-3 zile pentru virusurile respiratorii),
stocarea se face la temperaturi foarte joase (-20°C - 70°C).
Produsele se amestecă cu mediu de conservare (medii pentru culturi celulare IC-65 sau Eagle, fără ser de viţel care conţine
inhibitori virali) suplimentat cu antibiotice pentru inhibarea dezvoltării florei bacteriene (Penicilină 1600 UI/ml, Streptomicină
800 micrograme/ml). Mediile de conservare conţin ioni minerali, vitamine, aminoacizi, indicator de pH (roşu neutru).
Dacă produsele au o densitate mare (materii fecale, cheag etc.) mediulde conservare depăşeşte de 5-10 produsul patologic;
produsele patologice fluide (LCR, conţinutul veziculelor) se diluează 1/1 cu mediu de conservare.
Urmează o centrifugare puternică (30 minute la 5000 rotaţii/minut) şi se reţine supernatantul („produs prelucrat” sau „proba
de lucru” în care se evidenţiază eventualele particule virale).

2. IZOLAREA VIRUSURILOR
Se face pe sisteme celulare vii (ou embrionat de găină, culturi celulare, animale de laborator) în funcţie de agentul viral
presupus, cu urmărirea efectelor virus-specifice.
 
2.1. Culturi celulare
Definiţie: reprezintă substrate de celule eucariote (umane sau animale) întreţinute in vitro în condiţii adecvate de nutriţie,
temperatură, pH.
Obţinere: ţesutul proaspăt recoltat şi fragmentat este supus acţiunii de dispersie enzimatică (tripsină) şi mecanică (agitator) cu
obţinerea unei suspensii de celule izolate, care sunt reluate într-un mediu de creştere pentru culturi celulare (mediul IC65 sau
Eagle) îmbogăţit cu ser de viţel pentru stimularea creşterii (2-10%). Suspensia de celule este ajustată la o concentraţie standard
(105-106 celule/ml) şi se repartizează în vase speciale pentru culturi (Kolle), cu incubaţie la 37°C. Celulele se ataşează pe suportul
de sticlă, se multiplică, apărând o pânză celulară completă (monostrat).
 Culturile celulare se pot clasifica după ţesutul sursă ca şi după anumite caracteristici în 3 categorii:
- culturi primare din ţesuturi de animale adulte normale: rinichi de maimuţă, iepure, câine (linia MDCK pentru izolarea
virusurilor gripale). Celulele monostratului au caracter epitelial, sunt poligonale, monomorfe, păstrând morfologia ţesutului de
origine şi numărul de cromozomi al speciei ţesutului de origine. Numărul de pasaje este limitat: 2-3.
- linii celulare continue sau tumorale: ţesutul de origine este o tumoră (HEP 2 sau HELA). Celulele sunt mari, poligonale,
neregulate, polimorfe cu tendinţa de creştere pluristratificată. Au capacitatea de multiplicare in vitro intensă, fără păstrarea
numărului de cromozomi al speciei ţesutului de origine, cu posibilitatea păstrării indefinite in vitro prin transferare-pasare.
- culturi diploide: ţesutul de origine este embrionul sau fãtul uman. Monostratul este alcătuit din ţesut conjunctiv tânãr alcãtuit
din celule fibroblastice asemănătoare firelor de păianjen, lungi, subţiri. Numărul de cromozomi este caracteristic speciei
ţesutului de origine. In vitro suportă aproximativ 40 de pasaje.

Cultură celulară - ţesut conjunctiv tânãr

Inocularea culturilor în vederea izolării virusului
Alegerea tipului de cultură celularăse face în funcţie de categoria de virus a cărei izolare se urmăreşte.
Pentru inoculare se scoate mediul de creştere, se spală cultura cu soluţie tamponată (PBS) şi se inoculează produsul prelucrat
cu 0,2 ml/tub (se practică inocularea a 2 tuburi cu culturi celulare de acelaşi fel pentru acelaşi produs prelucrat). După 1-2 la 37C,
se adaugă mediu de întreţinere în volum de 1,8 ml de mediu IC 65 sau Eagle, fără ser de viţel, şi se incubează diferenţiat la
temperatura de 33 - 35 - 37C, în funcţie de virusul bănuit (exemplu virusurile gripale se incubează la 33C).
Efecte virus specifice pe culturi celulare
Prezenţa şi multiplicarea virusului în cultura celulară se poate evidenţia prin efectele virus specifice.
Efectul citopatic (ECP) reprezentat de modificările morfologice celulare consecutive multiplicării unor virusuri
citopatogene. Acest efect se observă prin examinarea microscopică directă sau după colorare cu meroda Giemsa sau cu
hematoxilină. ECP poate fi distructiv (celule mari, globuloase, refringente, cu desprinderea monostratului celular de
suportul de sticlă în 2-3-4 zile) la enterovirusuri (în special polio), sinciţial (mase mari - sinciţii, multinucleate) la virusurile
respiratorii (paragripale, respirator sinciţial, rujeolos) şi virusuri ale grupului Herpes, şi în focar (grămezi de celule
alterate într-o zonă a culturii, aspect de „mură”) la adenovirusuri.
În cazul apariţiei efectului citopatic, se incubează în continuare până la desprinderea totală a monostratului celular, apoi
proba se stochează la - 20C fiind ulterior folosită la titrarea virusului izolat, în vederea identificării.
În cazul lipsei efectului citopatic se face manopera de distrugere mecanică a culturii, prin îngheţ-dezgheţ (cufundări
succesive, de 10-15 ori, alternativ, în baie de alcool cu zăpadă carbonică, şi respectiv, în apă încălzită la 40-45C). În final, tubul
se stochează la -20C, până în momentul efectuării unui nou pasaj pe acelaşi tip de cultură celulară
Efect citopatic în mură - Adenovirusuri
- Efectul hemaglutinant (HA): eliberarea în mediul culturii celulare a particulelor de virus care în prezenţa eritrocitelor de
diverse specii se absorb la suprafaţa acestora, determinând aglutinarea lor - apariţia unui depozit cu marginile franjurate
(gripal, rujeolos, adenovirusuri).
- Efectul hemadsorbant (HAD). Virusurile care nu-şi manifestă efectul citopatogen în culturi celulare pot avea efect
hemadsorbant. După 5-12 zile de la inoculare mediul este îndepărtat şi se introduce o suspensie de eritrocite de cobai. Ataşarea
hematiilor de monostratul celular are loc în 30 de minute la 4C (paragripale, respirator sinciţial, rujeolos).
- Incluzii virale. Sunt evidenţiate în cazul virusurilor necitopatogene fie prin coloraţii speciale (Giemsa, Mann, Sellers), fie prin
metode moderne (imunofluorescenţă). Exemple: incluziile Babeş-Negri în rabie, corpusculiinlui Guarnieri în infecţiile cu
poxvirusuri.
- Efectul transformant. Este evidenţiat în cazul adenovirusurilor şi herpesvirusurilor, prin apariţia fenomenelor de cancerizare
in vitro (tendinţa de creştere pluristratificată, modificări metabolice, aberaţii cromozomiale). Aceste celule transformate sunt
capabile să inducă tumori la animalele imunosupresate.
- Efectul de interferenţă se utilizează pentru unele virusuri care nu determină efect citopatic. Exemplu: virusul rubeolic. În
acest caz se apelează la un virus citopatogen indicator (exemplu ECHO11).
În cazul unui rezultat negativ (lipsa efectelor virus-specifice) la primă izolare, se face o nouă trecere, un nou pasaj, pe aceeaşi
gazdă sensibilă. Un rezultat negativ şi la al doilea pasaj se poate specifica rezultatul negativ (lipsa particulelor virale).
2.2. Ouă embrionate
Oul embrionat de găină de 7-11 zile este gazda de elecţie pentru
mixovirusuri, herpesvirusuri, poxvirusuri. Inocularea, în funcţie de
virusul bănuit, se face: intraamniotic (Lam) şi intraalantoidian (Lal),
pe membrana corioalantoidiană (figura 3). Ouălele se inoculează (câte
0,2 ml produs prelucrat) şi se incubează la temperaturi diferite, în
funcţie de virusul a cărui izolare se urmăreşte (33°C pentru virusurile
gripale şi paragripale, 37°C pentru celelalte virusuri), timp de 4-7 zile,
după care se recoltează lichidele sau învelişurile embrionare.
Se urmăresc efectele virus-specifice:
- efectul hemaglutinant: virusurile gripale şi paragripale determină
aglutinarea eritrocitelor de cocoş sau om grup 0 (depozit cu margini
crenelate, franjurate) prin punerea în contact a lichidului amniotic
sau alantoidian cu suspensia de eritrocite;
- vezicule, pustule pe membrana corioalantoidiană: herpesvirusurile
şi poxvirusurile (v. vaccinia: vezicule mari, cu apariţie precoce, la
37°C; v. variolic: vezicule mici, cu apariţie tardivă, la 35°C);
incluzii virale: reprezintã aglomerãri de particule virale cu reacţie
subcelularã în jur care apar ca formaţiuni sferice sau ovalare
înconjurate de un halou clar.
Inocularea pe oul embrionat
2.3. Animale de laborator
Căile de inoculare: subcutanată la şoarecii nou-născuţi (enterovirusuri - Coxsackie), intracerebrală la şoareci adulţi (virusul
rabic) sau şoareci sugari (arbovirusuri), intranazală la dihori sau şoareci (gripale, paragripale), intraperitoneală. Animalele
inoculate sunt urmărite timp variabil, până la 2 săptămâni în funcţie de virusul suspectat.
Efecte virus-specifice: paralizii (v. Coxsackie grup A - paralizie flască, v. Coxsackie grup B - paralizie spastică), incluzii
virale în ţesuturi, în citoplasmă sau nucleu (Babeş Negri în cazul virusului rabic), inducerea de tumori la animalele
imunosupresate (virusurile oncogene).
Spre exemplu, în cazul apariţiei paraliziei, după sacrificarea animalului, scheletul musculo-cartilaginos (coloana
vertebrală, membrele anterioare şi posterioare) este mojarat steril, omogenizat cu mediu de întreţinere, centrifugat şi stocat. Proba
va fi fi utilizată ulterior pentru titrarea şi identificarea virusului izolat.
În cazul lipsei paraliziei, după 10 zile, se efectuează recoltarea materialului animal ca la probele pozitive, apoi se face
un nou pasaj pe un alt lot de şoareci nou-născuţi. Abia după ce la 10 zile de la al doilea pasaj nu apar paralizii se formulează un
diagnostic negativ cert.
3. TITRAREA VIRUSURILOR
Titrarea virusurilor izolate (determinarea concentraţiei particulelor virale infectante) parcurge mai multe etape: efectuarea de
diluţii din virusul izolat (binare sau logaritmice); inocularea pe acelaşi tip de gazdă sensibilă pe care s-a izolat virusul; urmărirea
apariţiei efectelor virus-specifice; stabilirea titrului viral (cea mai mare diluţie de virus capabilă să determine efectul virus-
specific); exprimarea titrului.
Titrul se exprimă în doze infectante care pot fi: doze sau unităţi hemaglutinante (în cazul virusurilor care aglutinează
hematiile), doze citopatogene 50 (pentru virusurile citopatogene), doze letale 50 (pentru virusurile ce determină moartea
animalelor de laborator inoculate).
Unităţi hemaglutinante
Din virusul izolat (aflat în lichidul amniotic sau lichidul alantoidian sau în mediul de cultură care scaldă cultura celulară) se fac
diluţii binare care se pun în contact cu o suspensie de eritrocite (de specii diferite în funcţie de virusul izolat).

Diluent (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Virus izolat 1

Diluţii 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256

obţinute

1 unitate hemaglutinantă (1UH) este diluţia cea mai mare de virus cu efect
hemaglutinant prezent.

Martor
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 hematii

1UH  diluţia 1/64 hematii diluent

4UH  diluţia 1/16

Titrarea unui virus hemaglutinant

Se face diluţia respectivă: 1 ml virus izolat (lichid amniotic, lichid alantoidian, mediul culturii celulare) cu 15 ml diluent (PBS).
Doze citopatogene 50 (DC 50)
Se fac diluţii logaritmice de virus izolat (1/10, 1/100, 1/1000 etc) care se inoculează la gazda sensibilă (pe acelaşi tip de
cultură celulară pe care s-a făcut izolarea).
Se utilizează patru reactanţi (culturi celulare) pentru fiecare diluţie, urmărindu-se apariţia efectului citopatic.

Diluent (ml) 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8

0,2
Virus izolat 0,2

Diluţii obţinute 1/10 1/100 1/1000 1/10000 1/100000 1/000000 1/0000000

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

Efectuarea diluţiilor logaritmice

Exprimarea titrului: doze citopatogene 50 (DC 50). 1 DC50 este cuprinsă în diluţia cea mai mare de virus, la care, în volumul de
titrare (0,2 ml), 50% din reactanţi au prezentat efect virus specific şi 50% au fost indemni.

Diluţie virus 1 2 3 4
10-1 + + + +
10-2 + + + +
10-3 + + + +
10-4 + + + +
10-5 + + + +
10-6 + + - -
10-7 - - - -

1 DC 50 se găsește în diluţia 10-6. În identificarea serologică sunt necesare 100 DC 50, care sunt în diluţia 10-4.
Doze letale 50 (DL 50)
Se efectuează diluţii logaritmice de virus izolat care sunt inoculate pe familii de şoricei (6 reactanţi pentru fiecare diluţie),
urmărindu-se efectele virus specifice.
Titrul se exprimă în doze letale 50 (DL 50): concentraţia de virus capabilă să producă paralizia sau moartea la ½ din
animalele inoculate cu aceeaşi diluţie.

Diluţie virus 1 2 3 4 5 6
10-1 + + + + + +
10-2 + + + + + +
10-3 + + + + + +
10-4 + + + + + +
10-5 + + + + + -
10-6 + + - - + -
10-7 - - - - - +
4. IDENTIFICAREA VIRALĂ
Identificarea orientativă
Identificarea virusului izolat este la început orientativă (aspectul clinic al virozei, datele epidemiologice, produse patologice)
şi contribuie la restrângerea investigaţiilor în funcţie de tropismul virusului pentru anumite gazde şi efectele virus specifice.
Astfel, dacă după inocularea produsului patologic prelucrat în culturi de celule se va produce un efect citopatic de tip
distructiv, se suspectează un enterovirus citopatogen (polio, ECHO, Coxackie grup B). Dacă efectul citopatic este de tip sinciţial
se presupune că s-a izolat un virus respirator sinciţial, un virus paragripal tip 2 sau virus rujeolos.
În cazul izolării unui virus în lichidul amniotic sau alantoidian al oului embrionat de găină care produce aglutinarea
eritrocitelor de cocoş, se va suspecta izolarea virusurilor gripale sau paragripale.
Apariţia paraliziilor la şoareci nou-născuţi indică probabil izolarea din produs a unui virus Coxackie.

Identificarea serologică
Identificarea de certitudine este însă cea serologică care se bazează pe reacţii antigen-anticorp, în care pentru a identifica
elementul necunoscut - virusul izolat (antigen viral necunoscut) din produsele recoltate de la bolnavi se utilizează seruri imune
standard - specifice de tip ca element cunoscut (anticorpi cunoscuţi). Livrate de Institutul Cantacuzino, serurile imune standard
sau serurile de referinţă vor fi utilizate conform instrucţiunilor de folosire, iar antigenele virale izolate vor fi tritate anterior, pentru
folosirea unor concentraţii optime.
Amestecurile de antigen viral necunoscut titrat şi serul imun standard se vor inocula la aceeaşi gazdă pe care s-a izolat şi
titrat virusul.
În reacţiile antigen-anticorp trebuie respectate anumite reguli: folosirea unor concentraţii optime ale celor doi reactanţi
(ser standard şi virus izolat, titrat şi diluat corespunzător celor 4 UH, 100 DC 50, 100 DL 50); testarea rezultatelor făcându-se pe
aceeaşi gazdă sensibilă pe care s-a făcut izolarea şi titrarea virusului.
 Se folosesc următoarele reacţii:
4.1. Reacţia de imunofluorescenţă
Tehnica se bazează pe proprietatea fluorocromilor de a se lega de imunoglobuline, fără a le modifica proprietăţile
imunologice, iar legarea lor de un antigen corespunzător dă complexului antigen-anticorp fluorescenţă.
Principiu: anticorpii marcaţi cu o substanţă fluorescentă (izotiocianat de fluoresceină) vor reacţiona cu antigenul (direct sau
prin intermediul serului hiperimun) dând fluorescenţă acestuia, vizibilă la microscopul cu lumină ultravioletă.
Metoda directă este utilizată în identificarea unui antigen necunoscut, folosind un ser imun standard fluorescent; în
cazul corespondenţei imune anticorpii fluorescenţi reacţionează cu antigenele specifice (din frotiuri sau din ţesuturi animale sau
umane) formând complexe antigen-anticorp fluorescente (figura 6).

Imunofluorescenţă directă
 Metoda indirectă are loc în două etape:
- în prima etapă, preparatul fixat conţinând antigenul se tratează cu ser specific standard nefluorescent, obţinându-se în cazul
corespondenţei imune un complex antigen-anticorp nefluorescent;
- în a doua etapă preparatul se tratează cu ser antiglobulinic antispecia serului din prima etapă marcat cu substanţă fluorescentă
(exemplu: I etapă ser specific preparat pe iepure, în a II-a etapă ser antiglobulină de iepure preparat pe capră) (figura 7).
Această reacţie în afară de identificarea antigenelor virale la nivelul ţesuturilor (virusul rabic, virusuri din grupul Herpes,
virusuri gripale şi paragripale etc.), mai poate fi folosită pentru identificarea microorganismelor (chiar şi a factorilor antigenici
microbieni rămaşi în urma omorârii germenilor prin tratament cu antibiotice) din produse patologice, ţesuturi, culturi);
identificarea autoanticorpilor din ser; identificarea antigenelor specifice tumorale în ţesuturile neoplazice.
În cazul identificărilor virale, peste cultura celulară se aplică fie direct un ser imun standard fluorocromat (tehnica directă),
fie indirect, prin intermediul unui ser de referinţă, un ser antiglobulinele speciei pe care s-a preparat serul de referinţă
fluorocromat.
Reacţie pozitivă (corespondenţă imună) - se produce fixarea anticorpilor specifici pe cultura celulară, notându-se o
fluorescenţă intensă a celulelor în lumină ultravioletă.
Reacţie negativă (nu există corespondenţă imună între antigen şi anticorp) - absenţa fluorescenţei.
Imunofluorescenţă indirectă
4.2. Reacţia de seroneutralizare
Se bazează pe proprietatea neutralizării efectelor antigenului de către anticorpii specifici. Testarea acestor efecte
neutralizante se realizează prin punerea în contact a amestecului antigen-anticorp cu anumite sisteme biologice sensibile. Această
reacţie este evidenţiabilă atât in vivo cât şi in vitro.
Ca avantaje ale utilizării acestei reacţii se numără persistenţa anticorpilor seroneutralizanţi pe perioade lungi (ani), înaltul
grad de specificitate pe care îl prezintă, oferind şi informaţii preţioase în activitatea antiepidemică.
 
Elementele reacţiei:
- antigene implicate în reacţia de seroneutralizare (virusuri);
- seruri imune neutralizante (anticorpi specifici neutralizanţi);
- substrate indicatoare (animale sensibile, culturi celulare, ou embrionat, organismul uman, medii nutritive cu adaus de diferite
substraturi enzimatice cu rol indicator, suspensie de hematii).
 
Principiu:
În cazul corepondenţei imune antigen-anticorp, anticorpii specifici neutralizanţi se combină cu antigenul blocând capacitatea
acestuia de a se insera pe substratul indicator (neutralizează antigenul împiedicându-l să-şi manifeste efectele specifice pe
substratul celular).
Reacţia se desfăşoară în doi timpi: într-o primă etapă se formează complexele imune specifice, apoi urmează (a doua etapă)
adăugarea în reacţie a unui substrat indicator, sau inocularea amestecului celor doi reactanţi la gazda sensibilă, urmărindu-se
prezenţa sau absenţa efectului biologic specific.
În cazul reacţiei pozitive (corespondenţă imună antigen-anticorp) se remarcă lipsa efectelor specifice pe gazda sensibilă.
Din contră, în reacţia negativă (absenţa corespondenţei imune între antigen şi anticorp), antigenul biologic activ îşi
manifestă efectul pe substratul indicator.
Aplicaţii
- identificări serologice virale (enterovirusuri, virusuri gripale, paragripale, virusul rujeolos, arbovirusurilor, virusurile grupului
Herpes).
- diagnosticul serologic al unor viroze (enteroviroze, infecţii herpetice).
 
Concret, în cazul identificărilor virale (enterovirusuri, virusul rabic, arbovirusurilor, virusul respirator sinciţial şi rujeolos,
virusurile din grupul Herpes), punerea în contact a virusului izolat cu ser imun standard, determină, în cazul corespondenţei
imune, neutralizarea virusului, demonstrată prin împiedicarea apariţiei efectelor virus-specifice la gazda sensibilă. Deci:
- reacţie pozitivă (anticorpii specifici din serul imun standard neutralizează virusul) - lipsa efectului virus specific pe gazda
sensibilă;
- reacţie negativă (nu există corespondenţă imună între anticorpii din serul imun standard şi virus) - prezenţa efectelor virus
specifice pe gazda sensibilă.
4.3. Reacţia de inhibare a hemaglutinării (HAI)
Principiu: în prezenţa serului imun specific de tip, efectul hemaglutinant al virusului nu se mai produce.
Reacţie pozitivă (corespondenţă imună între antigen şi anticorpi): anticorpii neutralizează antigenul care nu-şi mai
manifestă efectul hemaglutinant asupra hematiilor, rezultând inhibarea hemaglutinării (hemaglutinare absentă).
Reacţie negativă (virusul izolat nu corespunde serului imun standard): antigenul viral îşi manifestă efectul
hemaglutinant asupra eritrocitelor, rezultând un depozit cu marginile crenelate, franjurate (hemaglutinare prezentă).
Reacţia se foloseşte la identificarea virusurilor hemaglutinante (virusuri gripale, paragripale, virusul rujeolos).

Identificarea virusurilor gripale prin reacţia de inhibare a hemaglutinării

4.4. Reacţia de inhibare a hemadsorbţiei
Principiu: în urma unirii între virusurile hemadsorbante şi serul imun standard, virusurile nu-şi pot exercita efectul
hemadsorbant al eritrocitelor la suprafaţa celulelor virus infectate.
Reacţia se foloseşte pentru identificarea serologică a virusurilor paragripale.
 
4.5. Reacţia de fixare a complementului (adenovirusuri)
Principiu: în prezenţa serului imun standard şi virusului-antigen (mediu de cultură celulară cu particule virale), se formează
complexe imune antigen-anticorp care fixează alexina, deci lipsa hemolizei în sistemul hemolitic indicator.
Reacţie pozitivă (corespondenţă imună între antigenele virale şi anticorpii standard din serul de referinţă) este urmată de
lipsa hemolizei

Reacţie negativă (absenţa antigenelor corespunzătoare anticorpilor standard): prezenţa hemolizei.

Se foloseşte pentru identificarea serologică a adenovirusurilor.

4.6. Reacţia de dublă imunodifuzie în gel
Principiu: în urma migrării în gel, atât a antigenului (virus izolat), cât şi anticorpilor din serul imun standard (corespunzători
virusului din punct de vedere imun), apare un traseu de precipitare, demonstrând o reacţie antigen-anticorp specifică.
Aplicaţii: identificarea serologică a virusurilor gripale, pox, antigenului HBs în serul bolnavilor de hepatită virală B.

Identificarea virusurilor gripale prin imunodifuzie dublă

4.7. ELISA (Enzime Linked Immunosorbent Assay)
Se bazează pre reacţia imună antigen-anticorp în care elementul cunoscut (anticorpi specifici faţă de antigenul necunoscut din
proba de analizat) este fixat pe un suport solid de polistiren numit imunosorbent, iar unul din elementele reacţiei numit conjugat
este cuplat cu o enzimă (fosfataza alcalină sau peroxidaza).
În cazul reacţiei pozitive (corespondenţă imună între anticorpii fixaţi pe godeul de polistiren şi antigenele bacteriene de
testat) se formează complexele imune antigen-anticorp pe care se vor fixa anticorpii specifici din conjugat. În acest moment
enzima cu care sunt cuplaţi anticorpii specifici devine activă şi în momentul adăugării substratului, indicatorul, prin modificarea
Ph-ului, îşi va schimba culoarea iar densitatea optică creşte.

Acţionează pe
substrat

ELISA în identificare serologică

  
 
 
 
 
 
 
 
4.8. Radioimunanaliza (RIA)  
Metodă specifică, sensibilă, precisă, rapidă, care
permite,
  pe de o parte evaluarea unor substanţe din serul sanguin aflate în
 
concentraţii foarte mici de ordinul picogramelor sau nanogramelor (antigen carcinoembrionar, alfa-fetoproteina, hormoni,
enzime, medicamente), iar pe de altă parte cuantificarea unor categorii de anticorpi (antidifterici, antitetanici antiholerici,
antidizenterici) ca şi detectarea antigenelor şi anticorpilor din hepatitele virale.

Principiu: reacţie de competiţie între două antigene (antigen standard marcat cu I 125 şi antigenul necunoscut de testat de
concentraţie necunoscută) pentru acelaşi anticorp. În timpul acestei competiţii de legare cu anticorpul specific, antigenul
radioactiv este diluat de cantitatea necunoscută de antigen care trebuie determinat. Cantitatea de complexe antigen marcat-
anticorpi care se stabileşte prin măsurarea radioactivităţii este o funcţie inversă a concentraţiei de antigen nemarcat.
Radioactivitatea se măsoară la nivelul unui filtru (care nu permite trecerea complexelor antigen-anticorp) cu ajutorul unui
contor de scintilaţie.
Elementele care participă la reacţie sunt: antigenul standard marcat cu I 125; antigenul de testat; serul imun standard.
Radioimunanaliza (RIA) - reacţie pozitivă

+ 
 
+

+ 
Radioimunanaliza (RIA) - reacţie negativă

Radioactivitate crescută la
nivelul filtrului
5. DIAGNOSTICUL IMUNOBIOLOGIC
Presupune testarea reactivităţii imune atât pe linie umorală cât şi pe linie celulară a individului infectat viral. Testele imunobiologice, fiind
în prezent mai simplu de efectuat în comparaţie cu izolările de virus, constituie proba de laborator curent utilizată în acest scop. Testările imune
prin specificitatea lor sunt deosebit de importante în diagnosticul bolilor infecţioase. Avantajele aplicării lor sunt mari dacă se respectă o serie de
reguli de tehnică absolut necesare, dacă rezultatele obţinute sunt permanent coroborate cu datele clinice şi interpretate just pe baza cunoştiinţelor în
imunologie.
Tehnicile de diagnostic serologic folosite sunt: investigaţii de triaj (imunoenzimatice), investigaţii de confirmare (imunoblot,
radioimunoprecipitare, imunofluorescenţă).
 
5.1. Testarea reactivităţii imune umorale (diagnosticul serologic)
În cursul infecţiilor virale, în sângele bolnavilor apar anticorpi specifici faţă de diferitete structuri antigenice ale virusului în cauză.
Detectarea, identificarea şi cuantificarea lor constituie obiectul diagnosticului serologic. În cadrul diagnosticului serologic se pun în evidenţă
anticorpii din serul de testat (elementul necunoscut) în prezenţa antigenului viral standard - de referinţă (elementul cunoscut).
Investigarea serologică nu oferă indicaţii concludente dacă se efectuează pe o singură probă de sânge recoltată de la bolnav. În schimb ea
devin eficientă atunci când se examinează două probe de sînge recoltate de la bolnav, la un interval care să pernită decelarea unor modificări
semnificative la nivelul anticorpilor, respectiv o creştere a titrului de cel puţin 4 ori. În consecinţă, se recomandă ca prima probă de sânge să fie
obţinută de la bolnav în primele zile de boală (recoltat în prima săptămână de boală), iar a doua să se recolteze la interval de 10-15 zile, respectiv în
a doua sau a treia săptămână de boală. Diferenţa de titru de cel puţin patru trepte binare, între cele două seruri, pune diagnosticul cert al unei
anumite infecţii virale.
Reacţiile antigen-anticorp utilizate sunt:
 
5.1.1. Reacţia de seroneutralizare (SN)
Amestecurile între diluţii binare din serul de testat şi antigenul viral standard (titrat anterior) se incubează o anumită perioadă de timp
(pentru a favoriza interacţia între anticorpii serici şi antigenul viral), după care se inoculează la gazda sensibilă. Reacţia pozitivă constă în absenţa
efectului virus specific asupra gazdei.
Titrul seroneutralizant al serului este dat de diluţia cea mai mare de ser de bolnav care, în amestec cu virusul standard, împiedică apariţia
efectului virus specific.
Reacţia de seroneutralizare se foloseşte în diagnosticul seroloogic al enterovirozelor, al rujeolei, al infecţiilor cu virus citomegalic
5.1.2. Reacţia de inhibare a hemaglutinării (HAI)
Elementele reacţiei:
- Ser de cercetat recoltat în cele două perioade: debut şi convalescenţă. Serurile sunt tratate cu RDE (enzimă distrugătoare de
receptori) şi citrat trisodic pentru îndepărtarea inhibitorilor nespecifici ai hemaglutinării din serurile de cercetat. După
inactivarea lor la 56°C timp de 30 de minute, se fac diluţii binare.
- Antigen viral standard titrat şi diluat corespunzător celor 4 UH.
- Suspensia de hematii (specie diferită în funcţie de virusul standard): eritrocite de cocoş sau om grup 0 pentru virusurile
gripale, eritrocite de maimuţă pentru virusul rujeolos.
Principiu: Prezenţa anticorpilor (specifici antigenului) în serul de cercetat neutralizează antigenul standard care nu-şi mai
manifestă efectul (hemaglutinant) asupra hematiilor.
- Reacţie pozitivă (prezenţa anticorpilor): inhibarea hemaglutinării

- Reacţie negativă (absenţa anticorpilor): hemaglutinare prezentă (antigenul viral îşi manifestă efectul hemaglutinant)
Titrul: cea mai mare diluţie de ser cu inhibarea hemaglutinării. Serul I are titrul 1/8, iar serul II, recoltat în perioada de
convalescenţă, are titrul 1/256. Se poate pune un diagnostic cert, diferenţa de titru între cele două seruri fiind mai mare de patru
trepte binare.
Aplicaţii: diagnosticul serologic al gripei, rujeolei, arbovirozelor, virozelor pox.

Reacţia de inhibare a hemaglutinării în diagnosticul serologic

5.1.3. Reacţia de fixare a complementului (RFC)
RFC poate fi calitativă (Bordet-Wasserman), indicând prezenţa sau absenţa anticorpilor fixatori de complement, şi,
cantitativă (Ida-Bengston), care stabileşte titrul anticorpilor în serul de cercetat, dar şi creşterea lor în dinamică.
RFC se utilizează în majoritatea infecţiilor virale (gripă, adenoviroze, arboviroze, parotidită epidemică etc.).
 
 
Elementele reacţiei:
- Ser de cercetat recoltat în două perioade: debut şi convalescenţă. Din ambele seruri, după inactivarea lor la 56°C timp de 30 de
minute, se fac diluţii binare;
- Antigen standard (bacterian, viral, parazitar);
- Complement (C´) sau alexină. Este necesară titrarea acestuia (în prezenţa sistemului hemolitic), introducându-se în reacţie o
cantitate bine stabilită (2 unităţi alexice în infecţiile bacteriene, 3 unităţi alexice în infecţiile virale);
- Sistemul hemolitic-SH (hematii sensibilizate cu anticorpi corespunzători) obţinut prin punerea în contact a suspensiei de
hematii de oaie (rol de antigen) şi a serului hemolitic (anticorpi anti-hematii de oaie);
- Ser sigur pozitiv (ser anterior testat cu anticorpi fixatori de complement)
- Ser sigur negativ (ser anterior testat în care nu s-au evidenţiat anticorpi fixatori de complement).
Reacţia are loc în două etape: într-o primă etapă se pun în contact primele trei elemente (serul de cercetat, antigenul standard,
complementul). După această perioadă se adaugă în reacţie sistemul hemolitic.
Principiu: Prezenţa anticorpilor (specifici antigenului) în serul de cercetat este urmată de formarea cu antigenul standard a
complexelor antigen-anticorp. Complexele formate fixează (consumă) complementul, sistemul hemolitic, adăugat în partea doua a
reacţiei, rămâne nemodificat.
 Reacţie pozitivă (prezenţa anticorpilor specifici antigenului) este evidenţiată prin lipsa hemolizei.

Reacţie negativă (absenţa anticorpilor) este urmată de prezenţa hemolizei (complementul se va fixa pe hematiile sensibilizate,
declanşând liza acestora).

Reacţia de fixare a complementului - diagnostic serologic

Titrul: cea mai mare diluţie de ser cu hemoliză absentă. Serul I are titrul 1/4, iar serul recoltat în perioada de convalescenţă are
titrul 1/256. Se poate pune un diagnostic cert, diferenţa de titru între cele două seruri fiind mai mare de patru trepte binare.
 Martorii reacţiei de fixare a complementului
Pentru controlul reactivilor şi interpretarea corectă a reacţiei de fixare a complementului, obligatoriu se efectuează martori
pentru fiecare element al reacţiei (ser de cercetat, antigen standard, complement, sistemul hemolitic, ser sigur pozitiv, ser sigur
negativ).

Martor ser de cercetat Martor antigen Martor C´

- ser de cercetat - antigen - C´
- C´ - C´ - SH
- SH - SH

sistem hemolitic Martor ser sigur pozitiv Martor ser sigur negativ
- SH - ser sigur pozitiv - ser sigur negativ
- Ser fiziologic - antigen - antigen
- C´ - C´
- SH - SH

Martorii reacţiei de fixare a complementului

5.1. 4. Reacţia de hemaglutinare pasivă (HAP)
Elementele reacţiei:
- Ser de cercetat recoltat în două perioade: debut şi convalescenţă. Din ambele seruri, după inactivarea lor la 56°C timp de 30 de
minute, se fac diluţii binare.

- Antigen standard

- Suspensia de hematii

Înainte de efectuarea reacţiei propriu-zise, se sensibilizează hematiile cu antigen atandard (antigenul este adsorbit pe hematii cu
ajutorul acidului tanic care dezveleşte anumiţi receptori de pe suprafaţa hematiei).

Principiu: Prezenţa anticorpilor (specifici antigenului) în serul de cercetat este urmată de formarea unor reţele, cu prinderea
hematiilor şi apariţia aspectului de hemaglutinare.
Titrul: cea mai mare diluţie de ser cu hemaglutinare prezentă. Serul I are titrul 1/2, iar serul II, recoltat în perioada de
convalescenţă, are titrul 1/32. Se poate pune un diagnostic cert, diferenţa de titru între cele două seruri fiind mai mare de patru
trepte binare.
Aplicaţii: diagnosticul serologic al rujeolei, stabilirea eficienţei vaccinării antivariolice efectuată cu ajutorul virusului vaccinia.

Martor ser
sigur negativ
Martor antigen + hematii

Reacţia de hemaglutinare pasivă

5.1.5. Reacţia de imunofluorescenţă (IF)
În diagnosticul serologic se foloseşte metoda indirectă. Reacţia se desfăşoară în doi timpi:
- în primul rând, preparatul care conţine antigenul standard viral se tratează cu ser de cercetat în care se caută anticorpi specifici.
În cazul reacţiei pozitive se va forma complexul antigen-anticorp nefluorescent;
- în al doilea, pentru a face vizibil în lumină ultravioletă complexul antigen-anticorp format, preparatul se tratează cu un ser
antiglobulinic fluorescent.
Reacţia pozitivă constă în apariţia complexelor imune antigen-anticorp fluorescente în lumină ultravioletă.
5.1.6. ELISA
Este o metodă rapidă, specifică, sensibilă, de înaltă tehnicitate, utilizată pentru determinarea antigenelor (identificare
antigenică sau serologică) sau anticorpilor (diagnostic serologic) prin intermediul enzimelor (fosfataza alcalină sau
peroxidaza), folosind reacţia clasică antigen-anticorp (metodă imunoenzimatică). Enzima acţionează pe un substrat şi va da o
reacţie de culoare a cărei absorbanţă (densitate optică-DO) se va citi la spekol.
Reacţia se desfăşoară în plăci de polistiren care conţin antigenul sau anticorpul standard, de care se vor fixa anticorpii
antivirali sau antigenele virale din serul de cercetat (în cazul reacţiei pozitive).
Principiu
Reacţia constă dintr-o înlănţuire de reacţii în care primul reactant (antigenul sau anticorpul) este imobilizat pe un suport
solid; al doilea reactant, din proba de testat, este legat de primul printr-o reacţie specifică antigen-anticorp, iar ultimul reactant, cel
marcat cu enzimă (conjugatul), este legat de asemenea printr-o reacţie imună specifică de complexul format între primul şi cel de
al doilea reactant.
Există, în general, două tipuri de tehnică ELISA: indirectă şi competitivă.
Metoda indirectă: reacţia pozitivă (prezenţa antigenelor sau anticorpilor) este însoţită de culoare prezentă  densitate optică
mare  valoare mare a extincţiei (figurile 17 şi 18).
Varianta I

Reacţie pozitivă: în cazul prezenţei

anticorpilor (specifici antigenului fixat pe godeu),
aceştia se fixează pe antigenul standard (fixat pe
godeu) dar în acelaşi timp fixează la rândul lor
anticorpii antiimunoglobulină umană păstrându-se
astfel enzima în godeu, enzimă ce va acţiona pe
substrat (pH schimbat cu modificarea culorii
indicatorului) cu apariţia culorii.
Acţionează pe
substrat

Reacţie negativă: în cazul absenţei anticorpilor

(specifici antigenului fixat pe godeu) din serul uman
testat, anticorpii antiiimunoglobulină umană nu au
pe ce să se fixeze, fiind îndepărtaţi prin spălare şi
odată cu ei şi enzima care neacţionând pe substrat
nu modifică indicatorul, deci culoare absentă.

ELISA - tehnica indirectă - varianta 1

Varianta II

Reacţie pozitivă: prezenţa anticorpilor

în ser este urmată de fixarea lor pe antigenul
standard de pe godeu, după care fixează şi
antigenul standard cuplat cu enzimă
(conjugatul). Enzima rămasă în godeu
acţionează pe substrat cu apariţia culorii.
Acţionează pe substrat

Reacţia negativă: în absenţa

anticorpilor din serul de cercetat, conjugatul,
nefiind fixat, este îndepărtat prin etapa de
spălare, odată cu el şi enzima, care astfel nu
acţionează pe substrat, culoarea
nemodificându-se.

ELISA - tehnica indirectă - varianta 2

Metoda competitivă: reacţie de competiţie între doi anticorpi pentru ocuparea aceluiaşi antigen.
Reacţia pozitivă (prezenţa anticorpilor) este însoţită de culoare absentă  densitate optică mică  valoare mică a extincţiei.
Reacţie pozitivă: prezenţa anticorpilor (specifici antigenului
fixat pe godeu) în serul de cercetat este urmată de fixarea
acestora pe antigenul standard (au viteză de reacţie mai mare).
Anticorpii standard marcaţi cu enzimă (conjugatul) nu mai au
pe ce să se fixeze, sunt îndepărtaţi prin spălare, odată cu ei şi
enzima, fără apariţia culorii.
Reacţia negativă: în absenţa anticorpilor (specifici antigenului)
din serul de cercetat, anticorpii standard marcaţi cu enzimă
(conjugatul) se fixează pe antigen, enzima rămasă în godeu
acţionează pe substrat, cu apariţia culorii.
Acţionează pe substrat
Aplicaţii:
- determinarea cantitativă a unor antigene virale, bacteriene,
fungice, parazitare;
- determinarea anticorpilor în scop diagnostic;
- determinarea cantitativă a unor fracţiuni proteice (antigenul
carcinoembruonar, alfa-fetoproteina);
- determinarea şi identificarea anticorpilor antinucleari, anti-
ADN, complexe imune circulante (CIC), factor reumatoid
(FR) în boli autoimune;
- diagnostic serologic în SIDA;
identificarea anticorpilor IgE şi IgG în scopul stabilirii
ELISA - tehnica competitivă
diagnosticului bolii alergice.
5.2. Testarea reactivităţii imune celulare
Imunitatea mediată celular joacă un rol important în apărarea organismului faţă de infecţiile virale.
Răspunsul imun celular antiviral, în care veriga efectorie este reprezentată de limfocitele T efectorii, poate fi testat prin metode de analiză in
vitro şi in vivo, acestea fiind teste funcţionale sau numerice.
 
5.2.1. Intradermoreacţia de tip tuberculinic
Se utilizează pentru depistarea unor stări de hipersensibilitate de tip întârziat induse de anumite virusuri (exemplu: virusul varicelic etc.), fiind
un test funcţional.
Principiu. Limfocitele T, sensibilizate faţă de un anumit antigen viral, reacţionează la al doilea contact cu acelaşi antigen viral prin eliberarea unor
mediatori imuni celulari (limfokine). Astfel, după administrarea intradermică a antigenului viral de testat, la un interval de timp cuprins între 24-72
de ore (reacţie de tip întârziat), în cazul reacţiei pozitive, se produc modificări macroscopice la locul de inoculare (eritem, papulă, induraţie cu
diametrul cuprins între 5-10mm), dar şi microscopice (infiltrat masiv cu limfocite T şi macrofage).
 
5.2.2. Testul de transformare blastică limfocitară
Transformarea limfoblastică limfocitară este unul din testele funcţionale care indică iniţierea unui răspuns imun celular. Astfel, limfocitele
sensibilizate puse în contact cu antigenul viral sensibilizant in vitro proliferează şi se transformă în celule cu aspect limfoblastic. Transformarea
blastică se practică în două scopuri principale: evidenţierea reactivităţii unei populaţii limfocitare date la un antigen cunoscut şi estimarea
reactivităţii globale a limfocitelor la mitogene policlonale care stimulează celulele T sau B.
Eliberarea factorului mitogen de către limfocitele sensibilizate în prezenţa antigenului se testează folosind următorii indicatori:
- evaluarea proporţiei de celule blastice (imunoblaşti) în suspensia limfocitară incubată, prin efectuarea unui frotiu din sedimentul celular,
colorat fie cu coloraţia Giemsa, fie cu verde-metil-pironină;
determinarea ratei de sinteză crescută de ADN limfocitar, premergătoare proliferării celulare, se face prin marcarea limfocitelor cu timidină tritiată
şi urmărirea la intervale diferite de timp a ratei de încorporare a izotopului (măsurare radiometrică). Rezultatul se exprimă în indice de stimulare.
Nivelul înalt de încorporare a izotopului în celulă indică procesul de transformare blastică.
5.2.3. Testul de citotoxicitate imună
Testul pune în evidenţă eliberarea unei limfotoxine de către celulele T efectorii, în contact cu “celula ţintă” (infectată viral) ca
antigen. Celulele ţintă sunt în prealabil marcate cu Crom-51, apoi sunt puse în contact cu limfocitele T de testat. După câteva ore,
se apreciază nivelul izotopului în mediu, care creşte progresiv în cazul reacţiei pozitive.
 
5.2.4. Testul de inhibiţie a migrării macrofagelor
Testarea inhibiţiei migrării macrofagelor, în prezenţa antigenelor virale, apreciază fidel intervenţia răspunsului imun celular
antiviral, determinând eliberarea unei limfokine, factorul de inhibare a migrării macrofagelor (FIM). Acest factor face parte dintre
mediatorii eliberaţi de către limfocitele imune (de memorie) in vivo şi in vitro în prezenţa antigenului sensibilizant viral, în cursul
realizării imunităţii mediate celular.
Suspensia de celule (limfocite şi macrofage) din sângele periferic al subiectului, este introdusă în tuburi capilare de sticlă
calibrate şi heparinate. După centrifugare, fragmentele de tub cu celule (obţinute prin secţionarea la limita dintre sedimentul
celular şi supernatant), se introduc în camere de polistiren cu mediu de creştere (IC-65 sau Eagle) suplimentat cu ser de viţel 10%.
Unele probe vor fi suplimentate cu antigene virale faţă de care se testează imunitatea celulară, altele nu (martor).
După incubare timp de 48-72 de ore, la 37C în atmosferă de CO2 5% se apreciază rezultatul microscopic:
- la probele considerate martor, în mod abligatoriu, se va observa la capătul tubului capilar o “coroană” de macrofage;
- dacă testul este pozitiv (corespondenţă imună între antigen şi limfocitele sensibilizate ale subiectului supus testării), la proba
cu antigen, “coroana” macrofagică de la capătul capilarului este redusă ca dimensiuni sau lipseşte (limfokina FIM eliberată de
limfocite în prezenţa antigenului specific a inhibat migrarea macrofagelor).
 Se măsoară aria celor două “coroane” de migrare şi se poate aprecia testul după
următoarea formulă:
Mx
IMM = x 100
Mo

în care:
- IMM: indicele de inhibare a migrării macrofagelor;
- Mx: media ariilor de migrare la proba cu antigen;
- Mo: media ariilor de migrare la proba fără antigen.
Semnificativ IMM trebuie să fie mai mic de 70%.
5.2.5. Teste de rozetare
Aceste teste permit stabilirea procentuală a populaţiilor şi subpopulaţiilor limfocitare în funcţie de diferiţi determinanţi
antigenici (markeri) de pe suprafaţa celulară. Populaţia mixtă de limfocite T şi B se obţine din sângele periferic recoltat pe
anticoagulant prin puncţie venoasă. Metoda uzuală constă în centrifugarea sângelui în gradient cu Ficoll-Odiston, Ficoll-Hypaque
sau Sepcel.
Inelul de celule de la interfaţa celor două faze ale amestecului de separare conţine limfocite B şi T. Acestea sunt trecute
printr-o coloană de vată de nylon. Celulele neaderente la vata de nylon sunt reprezentate de limfocitele T, iar cele care rămân
aderente sunt limfocitele B. Determinarea proporţiei de limfocite T totale periferice se face prin testul de rozetare E de mică
afinitate (incubarea limfocitelor T cu eritrocite de oaie la temperatura de +4C timp de 18 ore). Celulele rozetate sunt limfocite
care au ataşate pe suprafaţă cel puţin trei eritrocite.
Testul de rozetare E de mare afinitate stabileşte proporţia le limfocite T helper şi constă în incubarea limfocitelor T cu
eritrocite de oaie la +29C timp de 60 de minute. Limfocitele T supresoare-citotoxice sunt puse în evidenţă prin testul de rozetare
E cu eritrocite de oaie prin incubarea limfocitelor T la 45C timp de 60 de minute.
Valorile normale ale proporţiei de limfocite T sunt: limfocite T totale = 60,00  10%, limfocitele T helper = 40,00  5% şi
limfocite T supresoare = 11  5%.
Infecţiile virale, obişnuit induc imunodeficienţe secundare soldate cu modificări numerice şi funcţionale limfocitare.
5.2.6. Citometria în flux
Reprezintă o abordare tehnică nouă, de mare complexitate, ce permite determinarea simultană a mai multor parametri fizici şi
chimici caracteristici unei singure celule aflate în mişcare într-un curent lichid. Rata de analizare a celulelor este cuprinsă între
500-4000 celule/secundă. Caracteristicile fiecărei celule se determină folosind un sistem opto-electronic care înregistrează felul în
care celulele interacţionează cu o rază laser. Astfel, celula poate:
- să împrăştie din faţă sau lateral lumina incidentă prin fenomenele de difracţie şi refracţie, dându-se informaţii despre
dimensiunile şi complexitatea structurală a celulei;
- să emită fluorescenţă, în cazul în care se folosesc substanţe fluorescente sau anticorpi conjugaţi cu fluorocrom (phycoerytrin-
PE şi fluorescein-isothiocyanate-FITC).
Citometrul în flux are posibilitatea de a selecta anumite populaţii celulare, bazându-se pe parametrii specifici populaţiei
respective (imunofenotiparea limfocitară). Celulele mononucleare pot fi analizate după incubare cu anticorpi monoclonali
conjugaţi cu FITC sau PE.
Imunofenotiparea urmăreşte stabilirea proporţiilor de seturi şi subseturi limfocitare din sângele periferic. Limfocitele pot fi
împărţite în trei populaţii principale, diferite din punct de vedere al funcţiilor îndeplinite şi al markerilor de suprafaţă: limfocite T
(CD3+), B(CD19+) şi natural-ucigaşe-NK (CD16/56+). În cadrul populaţiei T pot fi individualizate prin citometrie în flux două
subpopulaţii, limfocitele T helper-ajutătoare (CD4+) şi limfocitele T citolitice şi supresoare (CD8+). De asemenea, pot fi puse în
evidenţă limfocitele activate prin prezenţa pe membrana acestora, a antigenului HLA-DR aparţinând complexului major de
histocompatibilitate (CMH) clasa II.