Cultivarea virusurilor

 Structură foarte simplă

 Agenţi acelulari:
 Segmente de acizi nucleici
 Înveliş proteic protector

 sunt adaptate la un parazitism

obligatoriu intracelular (nu există medii
acelulare pe care putem cultiva virusuri)
→ se pot dezvolta doar în celule vii
Schema de diagnostic în bolile
virale

I. Diagnostic virusologic
II. Diagnostic serologic
Diagnostic virusologic
1. Recoltarea produselor 2. Izolarea virusului
patologice
 inocularea pe unul din
 preparate sistemele celulare vii
microscopice (ME)  urmărim dezvoltarea
 se pot detecta Ag virusului
virale – IF, metode  identificarea virusului
imunoenzimatice, alte
procedee
Diagnostic serologic
 se recoltează două probe de ser
 prima probă odată cu produsul patologic
 A doua probă la 7 -14 zile interval
 Se urmăreşte creşterea în dinamicăa titrului
anticorpilor specifici
Sisteme celulare care asigură
dezvoltarea şi cultivarea virusurilor:

 animale de experienţă
 oul de găină embrionat
 culturi de celule
Animale de experienţă
 apariţia semnelor de boală
 leziunile care apar în ţesuturile afectate:
preparate colorate
 incluzii virale = formaţiuni rotunde-ovalare
situate în nucleul celulelor parazitate de virus
sau al citoplasmei
uneori au importanţă diagnostică→
incluziile Babeş-Negri în citoplasma
neuronilor infectaţi cu virusul rabic
 detectarea anticorpilor specifici
Inocularea pe animale a permis
izolarea:
 virusului poliomielitei → maimuţă
 virusurilor gripale → inoculare intranazală la
şoarece nou-născut
 virusul Coxsackie A → şoarece nou-născut
 virusul rabic, arbovirusuri → intracranian la
şoarece nou-născut
Virusul Coxsackie A,B → virus cu ARN (fam.
Picornaviridae)

 inoculare subcutanată în regiunea cefei la şoarece

nou-născut a unei mici cantităţi mici de produs
patologic (LCR)
 v.coxsackie A → şoarecele moare într-o
săptămână → paralizie flască → leziuni în
musculatura striată (degenerarea musculaturii,
fenomene de miozită)
 Pe secţiuni din musculatură, colorate HE → alterarea
structurii normale a musculaturii striate
 v.coxsackie B → leziuni în principal la nivelul SN;
şoarecii mor cu paralizie spastică → leziuni şi în
pancreas, ficat
Oul embrionat
= sistem celular închis, steril; sunt celule tinere
în dezvoltare, nu gpsim dezvoltate
mecanismele de apărare umorală şi celulară
 inoculare din anii 1930

 v. gripale (metodă de elecţie)

 v. urlian
Dezvoltarea virusurilor pe oul embrionat
- urmărim viabilitatea embrionului
- v. variolei → se urmărea apariţia pe
membrana corioalantoidiană a unor mici
leziuni de culoare alburie
- v. gripale:
 nu omoară embrionul
 incubare 48 ore → la frigider 18 ore
 se taie un căpăcel în dreptul camerei de aer
 se absorb lichidul alantoidian şi lichidul amniotic
 în acele lichidese căută prezenţa virusului gripal
prin reacţia de hemaglutinare (HA)
Reacţia de hemaglutinare
 diluţii din lichidele embrionare (1/4, 1/8, 1/16,
1/32, ... )
 suspensii de hematii de cocoş
 1 oră la temperatura camerei (TC)
 dacă există v. gripal → aglutinarea
hematiilor
 identificarea virusului hemaglutinant prin
reacţia de hemaglutinoinhibare (HI)
 Se folosesc anticorpi antigripali cunoscuţi
 dacă agentul hemaglutinant este virusul
gripal, anticorpii s-au fixat pe suprafaţa
virusului, deci virusul nu mai aglutinează
hematiile (se depun ca un buton)
Culturi de celule
= sisteme celulare vii care permit izolarea
virusurilor în laborator
 introduse în practica de laborator în 1949
 Tipuri de celule:
 culturi primare
 culturi de celule diploide

 linii celulare
culturi de celule – dezvoltarea virusurilor
1. ECP (efect citopatic)
 citocid (cu moartea celuleor infectate de virus) →
picornavirusuri
 sinciţial (celulele fuzionează → apar mase gigante
multinucleate) → paramyxovirusuri, virus
respirator sinciţial
 agregare (celulele formează palcarde) →
adenovirusuri
 transformarea tumorală a celulelor → virusurile
oncogene, retrovirusuri
 minim → detecatrea virusului prin IF, HA, HAI
 fără modificări → v. rubeolei
2.Incluzii
 nucleu → v. herpetice, adenovirusurile
 citoplasmă → v. turbării, poxvirusurile
 nucleu şi citoplasmă → v. rujeolei, v.
citomegalic
3. Hemaglutinare
4. Hemadsorbţie: adsorbţia hematiilor pe
suprafaţa celulelor în care se multiplică
virusul
5. Imunofluorescenţa
6. Interferenţa → prin acest fenomen se pune
în evidenţă virusul rubeolei
se adaugă un virus despre care ştim exact
ECP → dacă al 2-lea virus nu mai produce
efect citocid înseamnă că în celulele
respective s-a multiplicat v. rubeolei
Identificarea virusurilor
1. Reacţia de hemaglutinare (HA),
hemaglutinoinhibare (HI)
HI → confirmă şi identifică varianta de virus
izolat
 Reacţia HI →şi în diagnosticul serologic
(pentru depistarea Ac specifici)
 dg. serologic, totdeauna lucrăm probe
perechi de seruri: o probă cât mai aproape de
debutul bolii, serul se congelează până la
recoltarea celei de-a 2-a probe la 7 zile de la
prima probă
 ambele probe se lucrează în aceeaşi zi, cu
aceleşi materiale
2. RFC
 pentru identificarea virusului
 mai ales pentru dg. serologic
 tehnica Bradstreet-Taylor (pe plăci cu godeuri) →
tehnică la rece:
 După ce se pun în contact diluţii de ser de bolnav +
Ag + C' (prin titrarea C' în tablă se şah se titrează
concomitent C' şi hemolizina) → 18 ore / 4 ºC
 + sistem hemolitic (hematii de oaie + hemolizină) =
sistem Ag-Ac cu rol de indicator
3. Seroneutralizarea (SN)
 reacţie laborioasă (rar în laborator)
 pentru unele picornavirusuri (v. poliomielitei)

= neutralizarea infectivităţii virale de către Ac

specifici antivirali astfel încât aceste
complexe Ag-Ac nu mai permit:
 producerea infecţiei la animale

 infectarea oului embrionat

 infectarea culturilor de celule

4. IF pentru detectarea Ag din culturi de celule
sau produs patologic şi pentru detectarea Ac
din ser
5. Metode imunoenzimatice – pentru
depistarea infecţiei HIV → confirmarea
infeţiei HIV prin alte procedee (Western blot)
6. Imunodifuzia în gel (CIEF) – HBV