Curs 28.

Genul Rickettsia. Genul Chlamydia. Genul Mycoplasma. Genul Candida

Genul Rickettsia
Rickettsiile sunt microorganisme care iniial au fost ncadrate printre virusuri deoarece au
dimensiuni mai mici dect bacteriile (600/300 nm)i n majoritate nu se pot cultiva dect pe
gazde vii. Familia Rickettsiaceae include trei genuri, genul Rickettsia, genul Coxiella i genul
Ehrlichia. Microorganismele sunt transmise de obicei de ctre artropode (pduche, purice,
cpu) multiplicndu-se n corpul acestora. Cel puin patru rickettsii (Rickettsia rickettsii,
Rickettsia conorii, Rickettsia tsutsugamushi, Rickettsia akarii) i probabil i altele sunt
transmise transovarian n artropode care servesc deopotriv ca vector i rezervor. Rickettsia
prowazeckii, agentul etiologic al tifosului exantematic este considerat ca specia tip a genului
Rickettsia. n cele mai multe cazuri, rickettsiozele se caracterizeaz prin asocierea unui
sindrom infecios sever cu un exantem.
Clasificarea lor se poate face dup mai multe criterii.
Dup principalele caractere clinice i epidemiologice rickettsiozele se pot mpri n
urmtoarele grupe:
a) tifosul de pduche sau purice;
b) grupul febrelor butonoase (febrele peteiale) reunete rickettsiozele transmise prin
cpue care paraziteaz animalele domestice i slbatice;
c) grupul tifos tropical reunete rickettsiozele transmise de larvele unor mici acarieni.
Tifosul pulmonar sau febra Q are ca agent etiologic Coxiella burnetii poate fi transmis i
de cpue, contaminarea este ns posibil i pe cale respiratorie sau digestiv.
Microorganismele se multiplic n celulele endoteliului vaselor sanguine mici i produc
vasculite. Celulele se umfl i se necrozeaz, apar tromboze ale vaselor care duc la ruptur i
necroz. Leziunile vasculare par a fi baza alterrilor hemostazei. Pot aprea coagulare
intravascular diseminat i ocluzii vasculare. La nivel cerebral apar agregri limfocitare,
leucocitare i ale macrofagelor ceea ce conduce la apariia nodulilor tifici. Se observ
leziuni similare n vasele mici la nivel cardiac sau la nivelul altor organe. Infeciile
rickettsiene se caracterizeaz prin febr, cefalee, indispoziie, prostraie (stare general foarte
alterat), rash (erupie) cutanat i mrirea splinei i ficatului. n febra Q nu exist leziuni
cutanate.
Vom discuta n continuare despre diagnosticul febrei Q dei Coxiella burnetii poate
produce i un sindrom febril auto-limitat (2-14 zile), endocardit, hepatit, osteomielit etc.
Febra Q se poate manifesta prin pneumonie atipic, pneumonie rapid progresiv sau
pneumonie n care semnul principal este reprezentat de febr (simptomatologia pulmonar
fiind absent iar implicarea pulmonar putnd fi demonstrat paraclinic). Pornim de la
elemente clinice (nespecifice), paraclinice i de laborator i ncercm stabilirea etiologiei prin
diagnostic microbiologic (bacteriologic i serologic). Obinerea de hemoculturi i sputoculturi
negative pentru alte microorganisme este un element care n contextul clinic i paraclinic
reprezint un element sugestiv.
Diagnosticul bacteriologic
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile
cunoscute, n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea
antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de sput; putem recolta i
snge (ar fi de preferat cheagul sanguin), lichid pleural, lichid pericardic, fragmente de
placent (n cazul unui avort) etc. Transportul trebuie realizat rapid i n condiii de maxim
siguran (ceea ce trebuie respectat n toate etapele diagnosticului bacteriologic;
microorganismele din familia Rickettsiaceae prezint un grad nsemnat de infeciozitate prin
1

aerosoli). n cazul n care p.p. nu poate fi procesat i inoculat imediat este recomandat
meninerea la -20C (inclusiv pe parcursul transportului).
2. Examinarea microscopic a produsului patologic este rareori util pentru diagnostic. n
sput, mai ales dac este recoltat prin biopsie transbronic, putem remarca prezena
macrofagelor alveolare iar printre acestea prezena unor cocobacili de dimensiuni mici.
Pornind de la gena pentru superoxid-dismutaz au fost obinui primeri (amorse) utilizai n
amplificarea genetic, pornind de la produsul patologic.
3. Cultivarea pe produsului patologic se poate realiza numai pe gazde vii, la nivelul unui
laborator de referin. Trebuie luate toate msurile de prevenire a unei infecii n laborator.
Coxiella burnetii poate cultiva pe animal de laborator (cobai), culturi de celule sau ou de
gin embrionat (la nivelul sacului vitelin). n afar de p.p. menionate mai sus am putea
folosi pentru inoculare i artropode. La nivelul sacului vitelin C. burnetii sufer o variaie de
faz, ntructva similar variaiei de la forma S la forma R ntlnit la alte bacterii. Tulpinile
recent izolate sunt n faza I n timp ce dup subcultivare se obin tulpini cu virulen sczut,
n faza II.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza astfel:
a) Caractere morfotinctoriale:
- evidenierea prin imunofluorescen direct a microorganismelor n hemolimfa animalelor
infectate sau la nivelul sacului vitelin al oului de gin embrionat.
- realizarea de frotiuri colorate prin metoda Gimenez (microorganismele apar de culoare roie
pe fondul verde al frotiului) sau Machiavello (microorganismele apar de culoare roie pe
fondul albastru al frotiului); se poate utiliza i metoda Giemsa.
Evaluarea prezenei anticorpilor anti-C. burnetii la animalele de laborator inoculate cu p.p.
Tehnici ale biologiei moleculare (PCR) etc.
5. Testarea sensibilitii la antibiotice nu se realizeaz de rutin. Cercetri efectuate dup
cultivarea C. burnetii pe linii de celule fibroblastice L929 au permis autorilor s afirme c
tulpinile studiate au fost sensibile la chinolone (n special) i rifampicin dar mai puin la
cloramfenicol, doxicilin i trimetoprim. Totui, tratamentul febrei Q se poate face cu se face
cu tetraciclin sau macrolide n asociere cu rifampicin.
Diagnosticul serologic
Datorit dificultii i riscurilor diagnosticului bacteriologic, cel mai frecvent n practic
se utilizeaz diagnosticul serologic. Exist mai multe tehnici de laborator care pot fi utilizate
dar RFC rmne n continuare metoda de referin. O cretere de 4 ori a titrului la a 2-a
determinare ajut la punerea diagnosticului pozitiv n febra Q. Mai putem utiliza reacia de
microaglutinare, reacia de microimunofluorescen indirect, o tehnic de tip ELISA sau
reacia de latexaglutinare (pozitiv n infecia acut). Reacia de microimunofluorescen
indirect prezint un nivel ridicat de sensibilitate i specificitate n condiiile n care
personalul de laborator este bine pregtit i are experien n acest tip de diagnostic. n ceea ce
privete depistarea specific a Ac de tip IgM, n acest caz nu este util deoarece IgM pot
persista ntre 1 i 2 ani dup infecia acut.
n diferite studii epidemiologice a fost utilizat i reacia de seroneutralizare. Injectnd la
oarece ser specific anti-C. burnetii, acesta va neutraliza efectul inoculrii de microorganisme
vii pe cale intraperitoneal sau intravenoas. Pentru ultima metod reamintim necesitatea
lurii tuturor msurilor de prevenire a unei infecii a personalului de laborator.

Genul Chlamydia
Chlamydiile sunt bacterii de dimensiuni mici (0,25-1 m), gram negative, strict parazite,
imobile, care se multiplic n citoplasma celulelor gazd printr-un ciclu de dezvoltare
caracteristic. Datorit importanei pentru diagnostic, vom prezenta ciclul de dezvoltare al
chlamydiilor. Dup ce ptrunde n interiorul celulei gazd, particula infecioas (corpusculul
elementar, form cocoid, cu diametrul de 0,25-0,3 m) se transform ntr-o particul mai
mare (corpuscul reticulat, cu diametrul de 0,5-1 m). Corpusculii reticulai se reunesc i se
multiplic prin diviziune binar, formnd colonii (incluzii) intracitoplasmatice. Dup o
perioad variabil n funcie de specia de chlamydii i de celula parazitat, de la nivelul
incluziilor apar noi corpusculi elementari, care sunt expulzai, urmnd s paraziteze alte
celule. ntregul ciclu dureaz 24-48 ore.
Genul conine trei specii care pot fi implicate n patologia uman. De regul infecia este
subclinic, boala reprezentnd o excepie la gazdele naturale ale acestor germeni.
Transmiterea de la psri la om favorizeaz apariia bolii. C. trachomatis produce incluzii
compacte intracitoplasmatice, cu glicogen. Include tulpini care determin pneumonie la
oarece i cteva afeciuni umane: trahom (serovarurile A, B, Ba i C), conjunctivite, uretrite
nongonococice, salpingite, cervicite, pneumonii la nou-nscui (serovarurile D-K) i
limfogranulomatoza venerian (serovarurile L1-L3). C. psittaci produce incluzii
intracitoplasmatice difuze, srace n glicogen. Include tulpini care determin psitacoza uman,
ornitoze la psri, meningit, pneumonie la feline i multe alte afeciuni ale animalelor.
(provoac infecii la animale dar poate fi transmis omului). C. pneumoniae poate provoca la
gazda uman pneumonii atipice la fel ca i C. psittaci, Coxiella burnetii sau Mycoplasma
pneumoniae. Unii autori clasific C. psittaci i C. pneumoniae n genul Chlamydophila.
Diagnosticul de laborator n infeciile chlamydiene poate fi bacteriologic i imunologic.
Infeciozitatea (prin aerosoli) este important astfel c trebuie luate toate msurile necesare
pentru prevenirea apariiei unor infecii la personalul de laborator.
Diagnosticul bacteriologic
Diagnosticul bacteriologic complet poate fi realizat la nivelul unor centre de referin.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile
cunoscute, n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea
antibioterapiei i respectnd msurile de precauie. Produsul patologic poate fi reprezentat
deraclat conjunctival sau de la nivelul altor mucoase (ex. cervival), urin, sperm, secreie
purulent uretral, secreii nazale, secreii faringiene, sput, aspirat ganglionar, puroi din
fistul etc. Ne vom referi n continuare la diagnosticul infeciei produse de C. trachomatis. n
cazul n care spre ex. secreia uretral nu este evident, putem utiliza un tampon subire pe
care l introducem cu blndee 3-5 cm n uretr, rotindu-l uor. Indiferent de p.p. recoltat,
tampoanele nu trebuie s fie din vat sau alginat de calciu ci din Dacron. Produsul trebuie s
fie prelucrat imediat. Dac acest lucru nu este posibil, transportul se va face n medii speciale
de transport sau la cel puin -20C (preferabil -70C).
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unor frotiuri pe care
le colorm dup cum urmeaz. Cea mai sensibil i specific metod pentru punerea n
eviden a incluziilor intracitoplasmatice sau corpusculilor elementari este imunofluorescena.
Frotiul este uscat, fixat chimic (cu aceton, la -20 C) i colorat imunofluorescent (metoda
direct sau indirect). Urmrim prezena celulelor inflamatorii (PMN) i a celulelor
caracteristice esutului de la nivelul cruia am realizat recoltarea. Incluziile apar ca o mas
bine definit, cu fluorescen de ex. galben-verzui, n interiorul celulelor epiteliale. Frotiul va
fi examinat cel puin 3 minute n cazul n care pare s fie negativ. n afar de celelalte frotiuri
le putem colora prin metoda Gimenez (corpusculii elementari apar aglomerai i de culoare
roie pe fondul verde al frotiului), cu lugol (incluziile de C. trachomatis conin glicogen; apar

ca o mas de culoare brun) sau Machiavello (corpusculii elementari apar aglomerai i de

culoare roie pe fondul albastru al frotiului). Unii autori menioneaz c examenul citologic,
cu punerea n eviden a unor limfocite transparente i a unui numr crescut de histiocite
este sugestiv pentru infecia cu C. trachomatis. Prin tehnici de tip ELISA se pot pune n
eviden antigene n p.p. Exist i tehnici ale biologiei moleculare care pot fi aplicate direct pe
p.p. (sonde nucleotidice, PCR etc).
3. Pentru cultivarea produsului patologic am putea utiliza oul de gin embrionat (la
nivelul sacului vitelin) dar de regul se folosesc culturile de celule. Pentru Chlamydia
trachomatis se pot utiliza liniile celulare BGMK, HeLa 229 (tratate cu dextran i
cicloheximid), McCoy (tratate cu cicloheximid 1 mg/ml), pentru Chlamydia pneumoniae se
pot utiliza liniile celulare HeLa, HEp-2, pentru Chlamydia psittaci se poate utiliza linia
celular McCoy etc. nainte de inocularea pe culturile de celule, p.p. este centrifugat (x 3000
rot., timp de 60 minute). Se pot utiliza culturile de celule n sistemul clasic sau micrometoda
de cultivare pe culturi de celule n godeuri. Incubarea dureaz 48-72 de ore. Tehnica incubrii
este destul de complex (incubri repetate, n condiii diferite) i trebuie s respecte strict
protocolul de lucru.
4. Identificarea se va realiza difereniat. n cazul n care s-a utilizat micrometoda,
godeurile se examineaz microscopic dup colorare cu lugol sau prin imunofluorescen. n
cazul cultivrii prin metoda clasic, realizm frotiuri pe care le fixm chimic (de ex. cu
metanol). Un frotiu va fi colorat cu lugol (incluziile de C. trachomatis conin glicogen), iar
altul cu Ac monoclonali marcai fluorescent. Se pot aplica i tehnici de biologie molecular.
5. Nu exist tehnici standardizate de stabilire a sensibilitii la antibiotice i
chimioterapice a tulpinilor de Chlamydia spp. n tratament se pot folosi eritromicina (sau alte
macrolide), tetraciclinele sau fluorochinolonele.
Diagnosticul serologic
Diagnosticul serologic implic utilizarea reaciei de fixare a complementului, reaciei de
microimunofluorescen i a tehnicilor de tip ELISA. Se consider c un titru de 1/64 este
sugestiv n timp ce o cretere de 4 ori a titrului n dinamic permite diagnosticul pozitiv.
Identificarea prezenei Ac de tip IgM la nou nscui permite diagnosticul de pneumonie cu
C. trachomatis. Tehnicile imunologice sunt frecvent utilizate n scop epidemiologic (studii de
seroprevalen).
Diagnosticul imunobiologic
Utilizarea intradermoreaciei (IDR Frei) a intrat n istoria medicinii.
Genul Mycoplasma
Clasa Mollicutes include patru ordine. Ordinul Mycoplasmataceae include genurile
Mycoplasma (circa 100 specii) i Ureaplasma (6 specii). Cteva dintre speciile acestor genuri
prezint interes medical. Mycoplasmele sunt cele mai mici microorganisme care pot tri liber
n natur (125-250 nm) i se pot multiplica pe medii de laborator. M. pneumoniae este
implicat n infecii respiratorii, M. hominis poate produce infecii cu localizare genital
inclusiv infecii post-abortum i post-partum n timp ce U. urealyticum a fost izolat din
uretrite non-gonococice i din alte infecii uro-genitale.
Diagnosticul de laborator poate fi bacteriologic i / sau serologic, n funcie de localizarea
infeciei i specia implicat.
Diagnosticul infeciilor respiratorii pornete de la elemente clinice i paraclinice i poate
fi confirmat etiologic prin diagnosticul microbiologic.
Diagnosticul bacteriologic

1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile

cunoscute, n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea
antibioterapiei. Produsul patologic poate fi reprezentat de exsudat faringian, secreii nazale,
sput, secreii genitale, urin etc dar n continuare vom discuta numai diagnosticul de
laborator n infeciile respiratorii. Transportul trebuie realizat la rece (la +4C) ct mai rapid
posibil, fr a depi un maxim de 3-4 ore de la recoltare. O alternativ este reprezentat de
utilizare mediilor speciale de transport care pot asigura conservarea p.p. pentru cel mult 24 de
ore. Utilizarea azotului lichid (-70C) permite conservarea probelor timp de mai multe zile dar
nu este nc accesibil (cu foarte puine excepii) sistemului sanitar romnesc.
2. Examinarea microscopic a produsului patologic nu permite obinerea unor rezultate
utile, M. pneumoniae ca i celelalte specii ale ordinului are dimensiuni foarte reduse. Unii
autori recomand realizarea de frotiuri colorate imunofluorescent. Pornind de la p.p. s-ar
putea realiza amplificarea genetic (PCR) cu o sensibilitate foarte bun. Prin tehnici de tip
ELISA pot fi puse n eviden Ag de M. pneumoniae n sput.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se poate realiza utiliznd tehnici
i medii speciale. Unul dintre mediile de cultur cunoscut este mediul mbogit, pe baz de
infuzie de cord bovin numit generic PPLO. Acest mediu include att substane nutritive, surse
de energie, indicator de pH (rou fenol) ct i substane care i asigur selectivitatea
(penicilin i/sau acetat de taliu). Cei mai muli autori recomand nsmnarea p.p. att pe un
mediu de cultur solid ct i pe un mediu de cultur lichid (ex. bulion PPLO). Vom realiza o
incubare la 37C n atmosfer de 5% CO2 i urmrim culturile pe mediul lichid pentru a sesiza
ct mai rapid (dar nu mai devreme de 48-72 ore de incubare) modificrile de culoare care
trdeaz virajul pH-ului. Mediul devine acid prin fermentarea glucozei n cel mult 3-4
sptmni. Este recomandat s realizm repicri pe medii solide i lichide ct mai curnd
dup ce am observat virajul pH-ului.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere:
a) Caractere morfotinctoriale nu sunt utile n identificarea M. pneumoniae.
b) Caractere de cultur:
Se pot examina la stereomicroscop (cu mrire de minim 25x). n scopul identificrii trebuie s
citim placa cu mediu agarizat de cel puin 2 ori pe sptmn. Pot aprea colonii de
dimensiuni foarte mici (cu diametru de la 10 mm pn la 200 mm), cu aspect muriform. Sunt
descrise i colonii cu aspect de ou-ochi, cu centrul dens, opac, nconjurat de o zon
periferic mai clar pe care unii autori le consider drept tipice pentru Mycoplasma (astfel de
colonii ar mai putea fi produse de bacterii n form L i necesit realizarea diagnosticului
diferenial).
Se poate realiza i cultivarea pe oul de gin embrionat (inoculare intravitelin) sau n culturi
de celule.
c) Caractere biochimice:
- fermenteaz glucoza, nu metabolizeaz arginina, nu hidrolizeaz ureea dar reduce (n
aerobioz) tetrazoliul. Acesta este un compus incolor, iar n cazul n care este redus la
formazan, culoarea devine roie. Testul se poate realiza direct pe placa pe care presupunem
prezena coloniilor de M. pneumoniae.
d) Alte caractere care ar putea fi utilizate n identificare sunt:
- fenomenul adsorbiei hematiilor de cobai
- colorarea imunofluorescent a coloniilor cu seruri specifice marcate cu fluorocromi
- inhibarea dezvoltrii coloniilor n jurul unor discuri impregnate cu anticorpi specifici
- tehnici ale biologiei moleculare (sonde nucleotidice, PCR) etc.

5. Nu exist o standardizare a tehnicilor pentru determinarea sensibilitii la antibiotice i

chimioterapice. Tratamentul pneumoniei cu M. pneumoniae se poate face cu eritromicin sau
alte macrolide sau cu tetracicline. Durata tratamentului este de circa 3 sptmni.
Diagnosticul serologic
n cursul infeciei se produc Ac din diferite clase, unii fiind utili pentru neutralizarea M.
pneumoniae n timp ce alii acioneaz ca auto-Ac. Dintre acetia, aglutininele la rece sunt
Ac de tip IgM oligoclonali care reacioneaz cu un Ag de la suprafaa hematiilor pacienilor
infectai cu M. pneumoniae. Cu toate c exist i alte maladii n care apar aglutinine la rece,
iar pe de alt parte acetia nu se pot identifica la toi pacienii infectai cu M. pneumoniae,
demonstrarea aglutininelor la rece continu s fie util n diagnosticul serologic. Utilizm
serul pacientului pe care l amestecm cu eritrocite provenite de la pacieni de grup O,
incubm la 0 C cteva minute i urmrim apariia aglutinrii. Dac apare aglutinarea repetm
testul realiznd diluii de ser pentru a determina titrul. Un titru de 1/32 este sugestiv pentru
infecia cu M. pneumoniae.
Se poate utiliza i RFC, dar pentru c Ac fixatori de complement apar tardiv este util n
studii epidemiologice. Tehnica de tip ELISA poate determina Ac de tip IgM i este util n
infecia acut.

Genul Candida
Diagnosticul infeciilor fungice nu este un diagnostic facil, dar este foarte important
pentru c trebuie s avem n vedere c aceste afeciuni sunt mult mai frecvente dect sunt
raportate n ara noastr. Oricare laborator clinic ar trebui s poat realiza cel puin
examinarea microscopic n vederea evidenierii levurilor sau structurilor miceliene sau
pseudo-miceliene precum i testul filamentrii. Dintre infeciile fungice vom discuta doar
despre infeciile produse de levuri i dintre acestea numai despre infeciile produse de levurile
din genul Candida, mai precis de specia Candida albicans.
n ceea ce privete diagnosticul unei infecii cu Candida spp. (respectiv C. albicans)
exist anumite particulariti de care trebuie inut cont atunci cnd se diagnosticheaz o
candidoz localizat la nivel muco-cutanat n comparaie cu o candidoz localizat profund.
Diagnosticul poate fi micologic (direct) sau imunologic (indirect).
Diagnosticul micologic
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie
de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice
antifungice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate
normele de asepsie i antisepsie etc). n cazul candidozelor superficiale, dup antiseptizarea
suprafeei leziunii raclm spre ex. tegumentul i colectm scuamele rezultate ntr-un recipient.
Mai putem recolta fire de pr, fragmente de unghie etc. n principiu putem introduce p.p.
recoltat n pachet de hrtie, introdus la rndul lui ntr-o cutie Petri. Transportul trebuie s
dureze maxim 48 de ore. n cazul candidozelor profunde ca i n cazul candidozelor
localizate la nivelul mucoaselor trebuie s evitm uscarea p.p. pe parcursul transportului.
Vom utiliza recipiente care se pot nchide ermetic i dac estimm c transportul va dura mai
mult de 1-2 ore introducem n recipient un tampon de vat sau tifon umezit cu soluie salin
fiziologic. Pentru a preveni multiplicarea bacterian putem aduga p.p. antibiotice (ex.
penicilin, streptomicin, cloramfenicol). Este bine ca volumul de p.p. recoltat s fie ct mai
mare. n cazul candidozelor profunde preferm ca recoltarea s fie urmat imediat de
realizarea preparatelor microscopice i nsmnare pe medii de cultur (la patul bolnavului).
2. Examinarea microscopic a produsului patologic se realizeaz diferit, n funcie de p.p.
prelucrat, dar face parte din orice examen micologic.

n cazul n care examinm o secreie sau un produs obinut prin raclare de la nivel
tegumentar sau fragmente de unghie vom realiza un preparat proaspt (umed), montat n
soluie de 10-30% KOH-glicerol. Putem utiliza pentru colorare calcofluor alb, un fluorocrom
care permite evidenierea levurilor datorit faptului c au n compoziie chitin (la nivelul
peretelui celular). Elementele fungice (levuri ovoide, cu dimensiunea de 4/6 m,
pseudomicelii i micelii) apar galben-verzui sau alb-albstrui n funcie de lungimea de und
a radiaiei de excitaie. Punerea n eviden a formaiunilor menionate mai sus permite
suspicionarea prezenei Candida spp., dar pentru confirmarea prezenei C. albicans este
necesar obinerea culturilor pure i identificarea acestora.
n cazul n care examinm secreii de la nivelul mucoaselor vom pregti att preparate
umede ct i frotiuri pe care le vom colora (Gram, AM sau Giemsa). Pentru creterea
sensibilitii examinrii preparatelor umede, acestea vor fi colorate cu calcofluor alb sau cu
lactofenol albastru cotton. Indiferent de metoda utilizat, punerea n eviden a levurilor i
pseudomiceliilor ridic o suspiciune, ns datorit prezenei Candida spp., n flora microbian
normal (ex. bucal, vaginal etc) doar punerea n eviden a miceliilor alturi de prezena
formelor levurice (gram pozitive la coloraia Gram) poate permite confirmarea infeciei. Este
necesar obinerea culturilor pure i identificarea acestora. Pe de alt parte, dorim s
menionm c o cultur pozitiv n absena unui examen microscopic pozitiv ridic semne de
ntrebare privind diagnosticul infecie cu C. albicans.
n cazul candidozelor profunde, interpretarea se va face difereniat. Atunci cnd p.p. este
normal steril (recoltat prin puncie lombar, lavaj bronho-alveolar, puncie bioptic etc),
identificarea structurilor fungice (levuri, micelii) este foarte important pentru diagnostic.
Dac p.p. este reprezentat de urin, materii fecale, sput sau alt produs potenial contaminat
de flora microbian normal, interpretarea este mai dificil n ceea ce privete semnificaia
structurilor fungice observate. Pentru examinarea p.p. recoltate de la pacieni care prezint
candidoze profunde vom realiza att preparate umede ct i frotiuri fixate, colorate prin
metodele amintite. Este posibil ca elementele fungice s apar deformate datorit fixrii
precipitatelor de colorant, pe frotiul colorat Gram. n cazul biopsiilor tisulare am putea utiliza
coloraiile histochimice.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se
poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica. Exist mai multe
medii de cultur care pot fi utilizate. Cel mai cunoscut este mediul Sabouraud (agar, glucoz
sau maltoz, polipepton) produs i de INCDMI Cantacuzino. n cazul p.p. contaminate
vom folosi i medii selective, de ex. mediul Sabouraud cu antibiotice (cloramfenicol,
gentamicin i/sau tetraciclin) i/sau mediul Sabouraud cu cicloheximid. Dorim s
menionm c n cazul p.p. necontaminate realizm cultivarea numai pe mediul Sabouraud
neselectiv n timp ce n cazul p.p. contaminate vom realiza cultivarea att pe mediul
neselectiv ct i pe mediile selective. Putem incuba plcile la 22-30C, dar mai frecvent
incubarea se realizeaz la 28C (sau la temperatura camerei) i la 35-37C, timp de 24-96 ore
n cazul candidozelor superficiale i pn la maxim 3 sptmni n cazul candidozelor
profunde.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere:
a) Caractere morfotinctoriale: Examenul microscopic al culturilor de levuri se realizeaz
asemntor cu ceea ce am discutat n cazul identificrii bacteriilor. Exist ns i anumite
particulariti.
Vom realiza att preparate proaspete, colorate de ex. cu lactofenol ct i frotiuri fixate i
colorate. Vom putea remarca prezena levurilor (blastoconidii), rotunde, ovoide sau puin mai
alungite, gram pozitive, putnd prezenta muguri i pseudomicelii. Prin examenul microscopic
dovedim i puritatea coloniei.

Dup repicarea pe agar cu fin de porumb sau agar cu extract de cartof (medii srace din
punct de vedere nutritiv), examinarea microscopic a preparatului proaspt va demonstra
producerea de chlamidoconidii (chlamidospori) care apar la extremitatea pseudomiceliilor.
Testul este negativ n numai 3-4% dintre cazuri.
b) Caractere de cultur:
Produc colonii de tip S, rotunde, bombate, netede, asemntoare cu unele colonii bacteriene
dar cu dimensiuni mai mari. Coloniile apar n 1-4 zile, au o culoare alb sau alb-glbuie i
consisten cremoas. n timp suprafaa coloniilor capt un aspect zbrcit.
c) Caractere biochimice:
Auxanograma: Levurile prezint un anumit echipament enzimatic cu ajutorul cruia pot s
utilizeze un anumit carbohidrat ca unic surs de carbon. Dezvoltarea pe un mediu n care este
inclus un singur carbohidrat demonstreaz utilizarea acestuia ca unic surs de carbon. n mod
asemntor se poate testa capacitatea asimilrii unor substane azotate. C. albicans asimileaz
glucoz, maltoz, trehaloz, galactoz etc.
Zimograma: Testarea fermentrii unor carbohidrai
Utilizarea unor teste produse comercial precum API 20C, API 32C, Vitek etc.
Relativ recent au fost puse la punct medii cromogene (ex. CHROMagar) care testeaz
producerea anumitor enzime i sunt utile n identificarea C. albicans, C. krusei i C.
tropicalis.
d) Caractere antigenice:
Se pot utiliza reacia de aglutinare pe lam, reacia de latex-aglutinare sau ELISA folosind
antiseruri cunoscute. Ultimele dou tehnici sunt folosite i n scopul identificrii prezenei Ag
de Candida spp. n diferite p.p.
e) Caractere de patogenitate:
Pornind de la o cultur de 24 de ore n mediul Sabouraud lichid separm sedimentul i
realizm o suspensie 0,2% a acestuia n soluie salin fiziologic steril; inoculm n venele
cozii la un lot de oareci (cte 0,2-0,8 ml pentru fiecare animal) suspensia obinut i urmrim
evoluia animalelor timp de 4-10 zile; dac este vorba de o tulpin de C. albicans patogen,
animalele vor muri dup circa 1 sptmn (anatomopatologic vom putea evidenia abcese
miliare renale, splenice, hepatice) etc.
f) Alte teste ce pot fi studiate n scopul identificrii germenilor:
Testul filamentrii (testul producerii de tubi germinativi): verificm capacitatea
blastoconidiilor de a produce, n anumite condiii, tubi germinativi. Repicm tulpina de studiat
pe medii care conin ser de iepure sau de berbec. La intervale de 60 de minute realizm
preparate proaspete (ntre lam i lamel), examinm microscopic pentru a identifica apariia
tubilor germinativi. C. albicans produce n maxim 4 ore pseudofilamente (tubi germinativi)
relativ scurte, fr stricturi, cu acelai calibru.
Detectarea unor metabolii prin gaz-lichid cromatografie (GLC)
Teste de biologie molecular (sonde nucleotidice, PCR).
5. Antifungigrama (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea
stabilirii tratamentului) a fost pus la punct relativ recent. Eforturile depuse n vederea
standardizrii acestei tehnici au avut la baz creterea interesului fa de infeciile fungice
precum i apariia fenomenului de rezisten la medicamentele antifungice a tulpinilor izolate.
Metoda recomandat de NCCLS este cea a diluiilor n bulion.
Diagnosticul imunologic poate fi serologic i imunobiologic.
Diagnosticul serologic
Cu toate c o serie de autori consider drept nerelevant acest tip de diagnostic, diferite
studii arat c identificarea i titrarea Ac anti-C. albicans poate fi util n diagnosticul
candidozelor profunde. Iniial au fost utilizate tehnici de aglutinare pentru detectarea prezenei
Ac anti-manan. Ulterior au fost puse la punct tehnici pentru detectarea prezenei Ac fa de Ag

localizate n citoplasma C. albicans. Au fost utilizate imunodifuzia n gel,

contraimunoelectroforeza, ELISA i tehnica de latex-aglutinare.
Diagnosticul imunobiologic
Intradermoreacia cu candidin este pozitiv la practic toate persoanele adulte, fiind astfel
util nu n diagnosticarea unei infecii cu Candida, ci n aprecierea RIC. Se mai poate utiliza
testul transformrii blastice a limfocitelor n prezena unor Ag de C. albicans.
Trebuie s menionm c exist o serie de probleme privind standardizarea i interpretarea
tehnicilor diagnosticului imunologic. Cu toate c prin aceste modaliti utilizate izolat nu
putem pune diagnosticul de candidoz, interpretarea ansamblului rezultatelor de laborator
obinute poate fi de folos n elucidarea implicrii patogenice a tulpinilor de Candida albicans.
BIBLIOGRAFIE:
1. Popa M.I. (coord.), Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din Familia
Rickettsiaceae, Microbiologie Medical, vol 2 - curs UMF Carol Davila, 2010.
2. Popa M.I. (coord.), Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul
Chlamydia, Microbiologie Medical, vol 2 - curs UMF Carol Davila, 2010.
3. Popa M.I. (coord.), Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul
Mycoplasma, Microbiologie Medical, vol 2 - curs UMF Carol Davila, 2010.
4. Popa M.I. (coord.), Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul
Candida, Microbiologie Medical, vol 2 - curs UMF Carol Davila, 2010.