Curs 26.

Genul Mycobacterium. Genul Bacillus. Genul Clostridium

Genul Mycobacterium
Elementele minime necesare stabilirii apartenenei la genul Mycobacterium sunt
reprezentate de: 1. rezistena la decolorarea cu acid-alcool (bacili acid-alcool rezisteni,
BAAR); 2. prezena unor acizi mycolici care conin 60-90 atomi de carbon i care pot fi
clivai prin piroliz n acizi grai cu 22 i respectiv 26 atomi de carbon; 3. un coninut
procentual de G+C de 61-71%.
n afar de M. tuberculosis i M. leprae, au fost descoperite o serie de alte mycobacterii
considerate anterior saprofite dar care fiind condiionat patogene, sunt relativ frecvent
implicate n patologia gazdelor imunocompromise (mycobacterii ne-tuberculoase, atipice
etc). Genul Mycobacterium include peste 80 de specii diferite, multe dintre acestea fiind larg
rspndite n natur. n continuare vom discuta aspectele legate de diagnosticul de laborator
(microbiologic) n infeciile produse de M. tuberculosis, varianta hominis.
Tuberculoza poate avea localizri variate, dar cea mai frecvent ntlnit este tuberculoza
pulmonar. Din punct de vedere epidemiologic, pacienii cu tuberculoz pulmonar (care
elimin prin sput BAAR) reprezint sursa de infecie cea mai important. Diagnosticul,
tratamentul corect i complet al acestor pacieni este esenial.
Diagnosticul poate fi sugerat de elemente clinice, paraclinice (ex. radiologice), alte
elemente de laborator, dar trebuie confirmat prin izolarea i identificarea M. tuberculosis.
Diagnosticul de laborator microbiologic este n mod esenial bacteriologic, direct, la care
se pot aduga datele obinute n cadrul diagnosticului imunobiologic i serologic.
Diagnosticul de laborator bacteriologic include etapele cunoscute.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie
de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct
mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de
asepsie i antisepsie inclusiv protecia personalului medical implicat etc). n funcie de
forma clinic de tuberculoz se pot recolta urmtoarele produse patologice: sput, lichid de
spltur bronic, LCR, urin, lichide recoltate prin puncie articular, peritoneal, pleural,
pericardic, probe obinute prin biopsie, puroi etc. Uneori este necesar concentrarea p.p. prin
centrifugare. n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de sput. Sputa
trebuie decontaminat (de ex. prin tratare cu NaOH 4%) i neutralizat n vederea
baciloscopiei i cultivrii.
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim trei frotiuri
din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu AM, Gram i
respectiv Ziehl Neelsen. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se
noteaz prezena celulelor de la nivelul tractului respirator (ex. macrofage alveolare),
prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite) i prezena BAAR. n esuturile animalelor
bolnave bacilii tuberculoi apar ca bastonae subiri, rectilinii, cu dimensiunea de 0,4 m / 3
m, acid-alcool rezisteni (apar roii pe fond albastru, toate celulele i bacteriile non-AAR
sunt colorate n albastru, la coloraia Ziehl-Neelsen), imobili, necapsulai, nesporulai. Se
poate utiliza i coloraia fluorescent. Examenul microscopic rmne o etap esenial n
diagnosticul unei infecii mycobacteriene att n momentul examinrii unui produs patologic
(examenul microscopic direct) ct i n momentul cnd prin microscopie se confirm (sau
infirm) morfologia i tinctorialitatea microorganismelor dintr-o colonie izolat.
Rezultatele examenului microscopic (coloraie fluorescent i Ziehl-Neelsen) trebuie
cuantificate prin numrul de BAAR n raport cu numrul de cmpuri examinate (10-30 n

cazul coloraiei fluorescente, 100-300 n cazul coloraiei Z-N). Spre exemplu, prezena a 1-9
bacili / 10 cmpuri n microscopia cu fluorescen i respectiv a 1-9 BAAR / 100 de cmpuri
n microscopia optic permite notificarea n buletinul de analiz a unui rezultat cu 1+ n timp
ce prezena a 10-90 bacili / 1 cmp n microscopia cu fluorescen i respectiv a 1-9 BAAR /
1 cmp n microscopia optic permite notificarea n buletinul de analiz a unui rezultat cu 3+
(maxim fiind 4+, atunci cnd se identific spre ex. peste 9 BAAR / 1 cmp la coloraia Z-N).
Notaia semicantitativ este obligatorie deoarece exprim unitar densitatea BAAR pe frotiu
indiferent de metoda folosit, permind comparaii ntre laboratoare diferite, ntre bolnavi
diferii i pentru acelai bolnav n momente evolutive diferite. Dac rezultatul final este
nedeterminat trebuie s facem nc un frotiu din acelai produs patologic i s indicm
recoltarea unui nou produs patologic. Baciloscopia negativ nu exclude diagnosticul de
tuberculoz.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se
poat obine o cultur pur, care se va identifica. n momentul actual, la nivel mondial, exist
o mare varietate de medii de cultur. Mycobacteriile se dezvolt n general pe medii
complexe. Mediile de cultur utilizate n diagnosticarea unei infecii mycobacteriene se
mpart n 3 grupe principale: medii de cultur lichide (ex. bulion 7H9), medii de cultur pe
baz de ou (ex. mediul Lwenstein) i medii de cultur bazate pe compoziia n agar (tip
Middlebrook). Pentru izolarea primar a mycobacteriilor se pot folosi medii foarte variate, din
fiecare grup menionat. Mediile pe baz de ou au ca ingrediente: ou sau glbenu de ou,
fin de cartof, sruri, asparagin i glicerol. Mediul este solidificat prin coagulare. Aceste
substane reprezint elementele de baz ale mediului clasic Lwenstein-Jensen la care se
adaug verde malachit pentru selectivitate (n acelai scop se pot aduga antibiotice).
Dezvoltarea M. bovis, M. africanum precum i a tulpinilor de M. tuberculosis rezistente la
HIN este favorizat de suplimentarea cu 0,4% piruvat de sodiu a mediului Lwenstein-Jensen.
Atunci cnd ncercm s realizm izolarea primar, este necesar ca mediile de cultur s
se incubeze ntr-o atmosfer de 8-10% CO 2. Culturile se incubeaz de rutin la o temperatur
de 35-37C. Mediile de cultur solide se vor examina zilnic n prima sptmn dup
inoculare iar apoi sptmnal pn la mplinirea a 6-8-12 sptmni deoarece mycobacteriile
tuberculoase au o rat de diviziune de 12-27 ore.
Se pot utiliza i sisteme de cultivare rapid (ex. MB-Bact, Bactec) cu depistarea
creterii mycobacteriene n 4-25 de zile. n Romnia aceste sisteme au nceput s fie utilizate
n unele centre ncepnd cu anul 1998. Aceste sisteme permit testarea sensibilitii la
medicamentele anti-mycobacteriene pentru tulpinile izolate, conform recomandrilor
programului naional.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere:
a) Caractere morfotinctoriale: n frotiul realizat din colonia izolat se evideniaz BAAR.
b) Caractere de cultur: M. tuberculosis i respectiv M.. bovis-BCG formeaz colonii R,
rugoase, neregulate, conopidiforme, grunjoase, greu de emulsionat, nepigmentate. Tulpinile
de M. tuberculosis rezistente la HIN pot forma colonii de tip S.
c) Caractere biochimice: Identificarea speciei se realizeaz pe baza a cteva teste fenotipice
clasice i anume: testul producerii de niacin, testul reducerii nitrailor, testul catalazei la
22C i la 68C, hidroliza tween 80, susceptibilitatea la hidrazida acidului 2-tiofen-carboxilic
(TCH) i susceptibilitatea la acidul p-amino salicilic (PAS). Primele 3 teste dau rezultate
pozitive pentru M. tuberculosis (n timp ce pentru M. bovis numai al 3-lea test este pozitiv).
Testul catalazei la 68C i respectiv hidroliza Tween 80 sunt negative pentru ambele specii
(hidroliza Tween 80 poate fi pozitiv pentru M. tuberculosis). M. tuberculosis se dezvolt pe
mediul cu TCH n timp ce M. bovis (sau M. bovis-BCG este inhibat de ctre aceast

substan). Testul este util n special n cazul tulpinilor de M. bovis care prezint reacii
pozitive (sau slab pozitive) la primele 2 teste.
d) Caractere antigenice: Se pot examina n centre de referin.
e) Caractere de patogenitate: M. tuberculosis este patogen pentru cobai. Inocularea p.p. la
cobai este uneori practicat n vederea diagnosticului.
f) Alte caractere / teste utilizate n identificare: Se pot utiliza (la nivelul unor centre de
referin) teste care se bazeaz pe proprieti fenotipice moleculare (ex. studiul cromatografic
al acizilor grai din peretele celular) sau genotipice (fragmente de restricie ale materialului
genetic, sonde nucelotidice, PCR). Exist i posibilitatea testrii sensibilitii fa de anumii
mycobacteriofagi etc.
5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea
stabilirii tratamentului) poate fi necesar i se realizeaz conform recomandrilor
Programului Naional de control al tuberculozei. Se pot utiliza metoda concentraiilor
absolute, metoda proporiilor, metoda rapoartelor de rezisten, metode radiometrice etc.
Diagnosticul imunobiologic are la baz un mecanism de rspuns imun de tip celular. Se
utilizeaz intradermoreacia cu tuberculin (PPD, derivat proteic purificat).
Diagnosticul serologic se bazeaz pe rspunsul imun de tip umoral (anticorpii
anti-mycobacterieni pot fi evideniai prin diferite tehnici, de ex. ELISA). Cu toate c
metodologia nu este perfect standardizat, subliniem faptul c n diagnosticul tuberculozei
nici un element nu poate fi considerat ca fiind lipsit de importan ntr-un anumit context
clinic, paraclinic i epidemiologic.
***
Dei nu am prezentat elementele necesare identificrii mycobacteriilor netuberculoase
dorim s menionm c, n cazul utilizrii unui numr redus de teste, exist riscul de a pune un
diagnostic eronat i respectiv de a considera o tulpin drept Mycobacterium tuberculosis, cu
toate c a fost izolat o mycobacterie atipic.

Genul Bacillus
Genul Bacillus aparine familiei Bacillaceae i cuprinde un numr foarte mare de specii,
dintre care n patologie sunt mai frecvent implicate B. anthracis, B. cereus i B. subtilis.
Germenii din specia B. anthracis se prezint sub form de bacili gram pozitivi, de dimensiuni
mari, imobili, sporulai, cu sau fr capsul. Sunt aerobi facultativ anaerobi.
Manifestrile clinice ale infeciilor determinate de bacilul antraxului sunt reprezentate de
antraxul cutanat (forma cel mai frecvent ntlnit la om), antraxul pulmonar i respectiv
antraxul gastrointestinal; n toate formele poate avea loc diseminarea infeciei. De menionat
c B. anthracis infecteaz n special animalele i poate produce ocazional infecii umane. n
ultima perioad se discut frecvent despre implicarea acestui microorganism n bioterorism.
Diagnosticul de laborator n antrax este bacteriologic, direct i trebuie realizat ct mai
rapid; sunt urmate etapele cunoscute dar exist anumite particulariti.
Diagnosticul unui caz de antrax pornete de la datele clinice i epidemiologice. Examenul
bacteriologic va confirma diagnosticul.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile
cunoscute, n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea
antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de secreii de la nivelul
leziunilor cutanate dar se pot recolta i aspirat din edemul local i/sau din ganglionii regionali,
sput, materii fecale, alimente incriminate, lichid cefalorahidian, probe necroptice, snge
(pentru hemoculturi) etc, n funcie de forma clinic. n cazul n care este de presupus c p.p.
este contaminat se pot folosi o serie de metode, spre ex. utilizarea mediilor selective, tratarea
3

termic sau tratarea cu alcool a p.p. n cazul mediilor selective, agentul selectiv mai frecvent
utilizat este polimixina B. n cazul celei de a treia variante, utilizm etanol steril de 95. Vom
suspensiona p.p. n proporie egal n etanol pentru o durat de 30-60 minute, la temperatura
camerei, dup care vom preleva circa 0.25 ml din suspensie pe care o cultivm pe mediul de
cultur ales. n cazul n care estimm c transportul ctre laborator va dura mai mult de 60
minute, asigurm o temperatur de transport de 2-8 C. Trebuie s menionm faptul c atunci
cnd presupunem diagnosticul de antrax, trebuie luate msuri de biosecuritate speciale.
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unor frotiuri care se
coloreaz cu albastru de metilen i Gram; cel puin un frotiu se va pstra de rezerv. Se mai
pot utiliza albastru de metilen policrom (McFadyean) sau coloraia imunofluorescent, pentru
evidenierea capsulei bacteriene. n p.p. se pot remarca structuri tisulare, leucocite i bacili
gram pozitivi, cu capetele tiate drept, de dimensiuni mari (1-1,5 m / 3-10 m), capsulai,
dispui izolat, n perechi sau lanuri scurte, inclui ntr-o capsul comun. n coloraia cu
albastru de metilen policrom bacilii apar albatri iar capsula apare ca un halo de culoare roz.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se
poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica. Putem utiliza
geloz nutritiv sau geloz snge, n condiii de aerobioz, la o temperatur de 37C (dei se
poate multiplica ntre 15 i 42C). n cazul n care este de presupus c p.p. este contaminat se
pot folosi metodele menionate mai sus. Pentru izolarea B. anthracis se poate folosi un mediu
cu polimixin B, lizozim, EDTA i acetat de thaliu, mediul PLET.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere:
a) Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-pozitivicu dimensiuni de 1-1,5 m/ 3-8 m,
formnd lanuri lungi; ncepe procesul de sporogenez (sporul este oval, situat central, mai
mic dect grosimea bacilului respectiv).
b) Caractere de cultur:
Pe medii simple produc colonii de tip R, mari, cu diametrul de 2-5 mm; marginile sunt
neregulate, cu prelungiri laterale filamentoase care au permis asemnarea acestora cu capul
de meduz sau coama de leu; pe mediile cu snge, poate aprea o zon discret de
beta-hemoliz dei n mod caracteristic B. anthracis este non-hemolitic.
Pe medii speciale se poate stimula dezvoltarea capsulei polipeptidice (vezi mai jos).
Pe mediul PLET produc colonii mici, de tip S.
c) Caractere biochimice:
Bacillus anthracis este catalazo-pozitiv, produce lecitinaz i este sensibil la penicilin (fa
de majoritatea speciilor din genul Bacillus, rezistente la penicilin); exist i alte teste
biochimice care sunt efectuate la nivelul centrului de referin
Un alt caracter care trebuie investigat se refer la motilitate, absent n cazul B. anthracis i
prezent la majoritatea speciilor din genul Bacillus. n acest scop putem nsmna o coloan
de geloz moale, cu incubare la 37 C pentru 1-4 zile i urmrim dezvoltarea culturii fa de
traseul pe care am nsmnat asemntor cu interpretarea mediului MIU n cazul
enterobacteriilor.
d) Caractere de patogenitate:
Testarea producerii capsulei in vitro, caracteristic tulpinilor virulente de B. anthracis se poate
realiza prin cultivare (repicare) pe un mediu care conine bicarbonat de sodiu (0,7%), la 37C
i n prezena unui procent crescut de CO2; dup 24 de ore, tulpinile capsulate vor produce
colonii mucoide iar prezena capsulei se va demonstra microscopic (ex. coloraia McFadyean
sau Giemsa).
Testarea patogenitii la oarecele alb
Testarea sensibilitii la bacteriofagul g
e) Alte caractere / teste utilizate n identificare la nivelul centrelor de referin:

- diferite alte teste biochimice

- examene microscopice (frotiuri colorate cu negru Sudan pentru identificarea prezenei
globulelor lipidice de beta-hidroxibutirat)
- alte teste pentru demonstrarea sensibilitii la penicilin (ex. testul colierului de perle)
- tehnici ale biologiei moleculare (depistarea prezenei plasmidelor pX01 i pX02).
5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice) nu este
necesar. Bacillus anthracis este sensibil la penicilin, eritromicin, tetraciclin,
cloramfenicol, ciprofloxacin etc.
n ceea ce privete diagnosticul imunobiologic, n Romnia a fost pus la punct tehnica
IDR cu antraxin (Blteanu-Toma).
Trebuie menionat faptul c este de o deosebit importan punerea diagnosticului de
antrax la animale (n special ierbivore), principalul rezervor pentru Bacillus anthracis.
n acest scop, se pot utilizat tehnici ale diagnosticului bacteriologic (evidenierea
microscopic a bacililor n leziuni, obinerea de culturi, identificarea antigenelor prin reacii
de precipitare sau tehnici de tip ELISA; pentru reacia Ascoli, sau ale diagnosticului
imunologic (intradermoreacia cu antraxin).

Genul Clostridium
Genul Clostridium include peste 100 de specii care se gsesc n intestinul animalelor i se
pot elimina n mediul exterior prin materiile fecale, sporulnd. Sunt bacili Gram-pozitivi
(uneori la limit), de dimensiuni mari, aezai n perechi sau lanuri, mobili cu cili peritrichi
(cu excepia C. perfringens). Multe dintre specii sintetizeaz exotoxine. n cele ce urmeaz
vom discuta despre speciile care produc tetanos, botulism i gangrena gazoas.
Tetanosul este produs de Clostridium tetani patogen prin multiplicare la poarta de intrare
i toxinogenez (produce o exotoxin neurotrop). Neuronii motori spinali sunt de obicei
inhibai de ctre glicin i acidul gamma-aminobutiric. Toxina blocheaz eliberarea acestor
mediatori ceea ce determin excitarea neuronilor motori spinali, cu apariia de spasme severe
i dureroase ale musculaturii striate (paralizie spastic). Contiena este pstrat. Toxina poate
ajunge la nivelul SNC i retrograd prin propagare pe cale axonal de la poarta de intrare sau
pe cale sangvin. Clinic, la 4-5 zile de la contaminare apar spasme ale musculaturii din zona
contaminat, apoi ale muchilor masticatori, manifestate prin trismus (gura nu se mai poate
deschide) i facies de tip risus sardonicus (spasme ale musculaturii faciale). Orice stimul
extern precipit un atac de tetanos. Moartea se poate produce prin asfixie; mortalitatea este de
circa 50%.
Botulismul apare de obicei prin ingestia de alimente care conin toxina produs de
Clostridium botulinum, fiind o toxiinfecie alimentar de tip toxic (toxin preformat n
aliment). Toxina botulinic este cea mai puternic otrav cunoscut; doza letal pentru om
este de circa 1-2 mg. Dup ingerare, toxina se resoarbe la nivel intestinal, ajunge n circulaie,
iar pe aceast cale la nivelul plcilor neuromotorii unde mpiedic eliberarea de acetilcolin
(determin paralizie flasc). Paralizia ncepe la extremitatea cefalic (ex. paralizia muchilor
globilor oculari care apare la 18-24 ore de la ingestie i se manifest prin diplopie) i
evolueaz descendent. Decesul poate surveni prin asfixie (datorit paraliziei muchilor
respiratori). Botulismul infantil (posibil i la aduli) este urmare a formrii toxinei botulinice
prin germinarea la nivel intestinal a sporilor ingerai. Mortalitatea n botulismul neo-natal este
foarte mare. Botulismul plgilor poate aprea la persoane care folosesc droguri injectate
intravenos sau prezint leziuni contaminate cu pmnt.
Gangrena gazoas este produs de dou sau mai multe dintre urmtoarele specii:
C. perfringens, C. novyi (C. oedematiens), C. septicum,C. histolytic i C. sporogenes. Sporii
5

clostridieni ajung la nivel tisular prin contaminarea unor leziuni (traume). n condiii de
anaerobioz sporii germineaz, formele vegetative se multiplic, fermenteaz zaharuri i
apare gaz. Distensia tisular, obstrucia mecanic a structurilor vasculare n conjuncie cu
sinteza de toxine favorizeaz diseminarea infeciei. Enzimele (toxinele) produse contribuie i
la alterarea grav a strii generale. Gangrena gazoas este caracterizat prin edeme dure,
crepitante (datorit prezenei de gaz) i necroz. Necroza tisular se extinde, multiplicarea
bacterian se amplific, apare anemie hemolitic, toxemie i evoluie (n 20-80% din cazuri)
ctre deces.
nainte de a discuta cteva aspecte legate de diagnosticul infeciilor produse de clostridii
dorim s menionm faptul c exist i alte microorganisme anaerobe de interes medical
(bacili gram pozitivi nesporulai, bacili gram negativi, coci gram pozitivi i gram negativi,
spirochete). Diagnosticul de laborator al infeciilor produse de germenii anaerobi este
laborios, costisitor i de regul poate fi definitivat numai n laboratoare specializate; sunt
necesare dotri speciale i un personal medical cu experien.
n continuare vom prezenta cteva aspecte privind diagnosticul de laborator n infeciile
produse de microorganismele din genulClostridium.
1. Etapa de recoltare i transport a p.p. este esenial; trebuie meninute condiiile de
anaerobioz.
2. Din punct de vedere macroscopic am putea meniona mirosul putrid al p.p., prezena
unor fragmente de esut necrotic, a unor secreii de culoare nchis, existena de snge i puroi
n plag etc.
Examenul microscopic are rol orientativ (pentru majoritatea laboratoarelor este i ultima
activitate care poate fi realizat atunci cnd agentul etiologic este un microorganism anaerob).
C. tetani are dimensiuni de 0,5-2 m / 2-18 m i poate prezenta un spor rotund localizat
terminal, C. botulinum are dimensiuni de 0,5-1,5 m / 3-20 m i poate prezenta un spor oval
localizat central sau subterminal, iar C. perfringens are dimensiuni de 0,5-1,5 m / 1,5-19 m
i poate prezenta un spor oval localizat subterminal. Examenul microscopic poate permite n
acelai timp un control al calitii p.p. (evideniind prezena celulelor inflamatorii i a
celulelor lezate) i ar putea servi la alegerea terapiei antimicrobiene.
3. Pentru cultivarea p.p. vom pregti cel puin 3 medii de cultur: bulion VF (viande-foi)
cu acid tioglicolic i albastru de metilen (care testeaz digestia crnii de ctre clostridii),
mediul geloz - snge suplimentat cu neomicin 100 mg / ml incubat n anaerobioz i mediul
geloz - snge incubat n condiii aerobe. Pentru p.p. provenite din abcese sau din plgi care
sugereaz gangrena gazoas am putea folosi i mediul Nagler (cu glbenu de ou) care
permite evaluarea producerii de lecitinaz i lipaz.
Incubarea n condiii de anaerobioz dureaz 24-48 de ore la 35-37 C.
nainte de a trece la etapa de identificare trebuie s ncercm s dovedim c am izolat
germeni anaerobi i s verificm puritatea culturii care urmeaz a fi identificat. n condiiile
n care p.p. a fost nsmnat pe 2 plci cu geloz - snge incubate aerob i anaerob, este util
s realizm examenul microscopic al coloniilor. Dac apar colonii asemntoare n ambele
plci iar din punct de vedere microscopic prezint caractere similare, este vorba de
microorganisme facultativ anaerobe. Dac pe frotiurile din coloniile izolate pe mediul incubat
n anaerobioz apar i alte tipuri morfologice, nseamn c exist microorganisme strict
anaerobe. Pentru a verifica puritatea culturii obinute, nainte de a trece la etapa de
identificare, repicm coloniile suspecte n bulion VF regenerat (prelevm colonia prin
decupare cu geloza subiacent). Incubm timp de 24 ore la 35-37 C. n cazul n care exist
multiplicare bacterian procedm la:
a) realizarea unui frotiu colorat Gram (i comparm rezultatele cu cele obinute anterior);
b) repicarea pe o pant de geloz nutritiv cu incubare n aerobioz (nu trebuie s apar

cultur bacterian n cazul n care bacteriile izolate anterior sunt anaerobe). Dac rezultatele
sunt corecte, trecem la identificarea microorganismelor.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere, aa cum am discutat i n capitolele precedente.
a) Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-pozitivi cu dimensiunile menionate mai sus.
n culturi nvechite bacteriile pot fi gram negative i se pot detecta endosporii (deformeaz
bacilii). n cazul n care la examenul microscopic nu evideniem spori vom repica pe mediul
Nagler, cu incubare 48 de ore la 35-36 C i apoi la temperatura camerei. Urmrim sporularea
pe un nou frotiu colorat Gram. Putem evalua fenomenul de sporogenez i prin metode de
cultur (vezi mai jos).
b) Caractere de cultur: speciile mobile (marea majoritate) formeaz la suprafaa mediului
colonii de tip S, cu margini ondulate, neregulate, cu tendin de invadare a mediului (datorit
mobilitii). n jurul coloniilor remarcm prezena beta-hemolizei. Dac a avut loc inocularea
i n profunzimea mediului, coloniile au aspect pufos. Clostridium perfringens (specia
imobil) formeaz colonii de dimensiuni mari, de tip S, rotunde, cu margini regulate, convexe
dar care pot avea i aspect rugos. Majoritatea tulpinilor produc hemoliz dubl (zona intern,
de beta-hemoliz, este mai ngust n timp ce zona extern, de alfa-hemoliz este mai larg);
exist i tulpini care produc zone foarte largi de hemoliz precum i tulpini slab hemolitice.
Aa cum am menionat, prin cultivare putem s evalum fenomenul de sporogenez (cunoscut
fiind c sporii rezist timp de 10 minute la temperatura de 80C). Dac pe frotiul din cultur
colorat Gram nu evideniem spori, pregtim 2 tuburi cu bulion pepton, glucoz, amidon i
extract de levur. Repicm coloniile suspecte n cele 2 tuburi iar unul dintre tuburi n
supunem unei temperaturi de 80C, 10 minute. Incubm cele 2 tuburi la 35-37C pn apare
multiplicarea bacterian. Dac bacteriile se dezvolt n ambele tuburi, am dovedit existena
sporilor. Dac dup o incubare de cel mult 10 zile nu apare multiplicare bacterian n tubul
supus la temperatur, nu exist spori.
c) Caractere biochimice: Exist numeroase caractere biochimice care pot fi utile n
diferenierea speciilor de clostridii.
n identificarea microorganismelor din acest gen utilizm iniial testarea producerii de
lecitinaz i lipaz. Pe mediul Nagler inoculm tulpina n striu (se pot testa concomitent mai
multe tulpini). Pentru aprecierea producerii de lecitinaz incubarea dureaz 48 de ore. n cazul
n care testul este pozitiv (precipitat opac n mediul din jurul striului de cultur) poate fi vorba
de o tulpin de C. perfringens. Testul este negativ pentru C. tetani sau pentru C. botulinum.
Pentru tulpinile lecitinaz pozitive, la nivelul centrului de referin se mai pot testa
mobilitatea, fermentarea lactozei, producerea de lipaz, ureaz, hidroliza gelatinei, digestia
crnii etc. Pentru aprecierea producerii de lipaz incubarea dureaz 1 sptmn. n cazul n
care testul este pozitiv (film perlat, iridescent la nivelul striului de cultur i n mediul
adiacent) poate fi vorba de o tulpin de C. botulinum. Testul este negativ pentru C. tetani i
C. perfringens.
Testul plcilor semineutralizate poate fi practicat la nivelul centrului de referin. Folosim o
plac cu mediul Nagler. Pe jumtate din plac etalm anti-toxin (lecitinaz). Dup uscarea
plcii inoculm n striuri o tulpin martor pozitiv, o tulpin martor negativ i cteva tulpini de
testat. Incubm timp de 18-24 de ore la 35-37C n anaerobioz. C. perfringens (ca i tulpina
M+) d un rezultat pozitiv doar pe jumtatea de plac fr anti-toxin.
Creterea n lapte turnesolat sau cu bromcrezol purpur (C. perfringens produce cheag alveolar
n laptele turnesolat).
Clostridiile sunt sensibilie la vancomicin i rezistente la colistin. Ali autori propun testarea
sensibilitii la metronidazol.
d) Caractere antigenice: pot fi testate n centrele de referin.
e) Alte teste care pot fi efectuate la nivelul centrelor de referin

Demonstrarea prezenei tetanospasminei prin seroneutralizare la oareci (un animal este

protejat cu 1-2 ore nainte de test prin injectare subcutanat a 1000 de UAI de anti-toxin
tetanic; injectm la ambele animale 0,5 ml din cultura pe mediu lichid; animalul protejat
supravieuiete, iar cellalt va prezenta semne tipice de tetanos)
Testarea (la om) a prezenei anti-toxinei tetanice n titruri protective prin ELISA sau
hemaglutinare (T 0,01 UAI / ml).
Demonstrarea prezenei toxinei botulinice n alimente, materii fecale, ser sau n medii de
cultur. Spre ex. prelevm din bulionul VF pe care am identificat multiplicarea bacterian,
centrifugm iar supernatantul l mprim n 2 tuburi. Unul dintre tuburi l supunem
temperaturii de 100 C (toxina botulinic este termosensibil). Inoculm intraperitoneal p.p. la
dou loturi de oareci. Dac oarecii injectai cu p.p. inactivat termic mor, nu este vorba de
toxina botulinic. Urmrim oarecii timp de 2-4 zile pentru a remarca apariia semnelor de
botulism (reducerea mobilitii, respiraii ample, contracii ale muchilor abdominali urmate
de convulsii i deces). Prezena toxinei botulinice poate fi confirmat prin seroneutralizare
(protejm spre ex. un animal de laborator cu anti-toxin de tip A i un alt animal de laborator
cu anti-toxin de tip B dup care i injectm cu p.p. respectiv; dac animalul seroprotejat cu
anti-toxina de tip A supravieuiete iar cellalt animal moare cu semne caracteristice pentru
botulism, n mediul de cultur a existat C. botulinum de tip A)
Titrarea toxinei botulinice, prin metoda DL50 (folosind injectarea p.p. n vena cozii i
curbe standard pentru interpretare, pentru fiecare serotip)
Titrarea toxinei botulinice printr-o tehnic de tip ELISA (poate detecta 10 pg)
Testul inhibiiei sialidazei, pozitiv n 2-6 ore pentru C. perfringens etc.
5. Antibiograma de regul nu se realizeaz. Clostridiile sunt sensibile la penicilin,
cefalosporine, vancomicin, tetracicline, metronidazol etc, ns tratamentul este mult mai
complex; n unele dintre bolile clostridiene nu a fost eficacitatea tratamentului cu antibiotice
sau chimioterapice nu a fost dovedit.
BIBLIOGRAFIE:

1.

Popa M.I. (coord.), Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din

genul Mycobacterium, Microbiologie Medical, vol 2 - curs UMF Carol Davila, 2010.
2. Popa M.I. (coord.), Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul
Bacillus, Microbiologie Medical, vol 2 - curs UMF Carol Davila, 2010.
3. Popa M.I. (coord.), Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul
Clostridium, Microbiologie Medical, vol 2 - curs UMF Carol Davila, 2010.