Identificarea bacteriilor pe baza caracterelor de cultura, biochimice si metabolice.

Evidenţierea caracterelor biochimice pe medii diferenţiale, multitest.

Există numeroase teste utile în identificarea bacteriilor şi fungilor, având la bază diferite
proprietăţi biochimice ale acestora; Aceste teste de identificare au o importanţă diferită la
diferitele genuri şi specii bacteriene şi “fac parte” din etapa a patra a diagnosticului de
laborator bacteriologic sau micologic.
1. Mediul multitest TSI (triple sugar iron)
Principiu:
Mediul este agarizat, condiţionat în două “zone” (în coloană la bază şi în pantă) şi conţine
glucoză (în raport de 1/10 faţă de celelalte zaharuri), lactoză, zaharoză, citrat feric şi un
indicator de pH (roşu neutru). Partea dreaptă (coloana) nu vine în contact cu aerul şi oferă
condiţii relative de anaerobioză. Partea înclinată (panta) oferă condiţii de multiplicare în
aerobioză.
Dacă o bacterie se dezvoltă în partea dreaptă vor fi eliberaţi aminoacizi, care în zona
aerobă vor fi decarboxilaţi oxidativ şi vor modifica pH-ul spre alcalin. În cazul în care lactoza
şi / sau zaharoza nu sunt fermentate, cantitatea de acid produsă prin fermentarea glucozei
(toate enterobacteriile fermentează glucoza) este suficient de mică pentru ca pH-ul de la
nivelul pantei să revină rapid la neutru. În acelaşi timp, pH-ul rămâne acid (şi culoarea
mediului rămâne galbenă) la nivelul coloanei pentru că în condiţii de relativă anaerobioză nu
are loc decarboxilarea oxidativă. Dacă zaharurile de la nivelul pantei sunt fermentate,
cantitatea de acid produsă este suficient de mare pentru ca pH-ul de la acest nivel să rămână
acid şi respectiv culoarea pantei să rămână galbenă.
Prezenţa citratului feric, în cazul în care bacteria produce H2S duce la apariţia unei culori
negre (se formează sulfit feros).
La nivelul coloanei se mai înregistrează şi producerea de gaz (de la apariţia unor bule fine
pe traseul de însămânţare, până la fragmentarea sau “ruperea” coloanei).
Materiale necesare:
- tuburi de dimensiuni mici cu mediul TSI
- colonii de identificat (colonii izolate, cultură pură)
- ansă fir etc
Tehnica de lucru:
Utilizăm pentru însămânţare o ansă fir. Prelevăm din colonia izolată pe mediu neselectiv
şi însămânţăm coloana prin înţepare, apoi retragem ansa şi atingând suprafaţa coloanei
descriem un striu în “zig-zag”. Incubăm la 35-37°C timp de 24 ore.
Interpretare:
a) în ceea ce priveşte fermentarea glucozei
culoarea coloanei este galbenă – glucoza este fermentată
culoarea coloanei rămâne roşie – glucoza nu este fermentată (nu este enterobacterie)
fermentarea glucozei poate fi sau nu însoţită de producere de gaz
b) interpretarea se face similar pentru fermentarea lactozei / zaharozei, la nivelul pantei
c) în cazul în care se produce H2S, remarcăm apariţia unei culori negre la nivelul coloanei
Control de calitate:
Martor pentru pH acid la nivelul coloanei şi pantei, fără producere de H2S – E. coli
Martor pentru pH acid la nivelul coloanei, pH neutru la nivelul pantei şi producere de H 2S
– Salmonella Typhimurium

1
2 Mediul multitest MIU (mobilitate indol uree)
Principiu:
Mediul conţine uree, triptofan, roşu fenol (indicator de pH) şi este condiţionat în tuburi de
dimensiuni mici. Geloza este moale permiţând mobilitatea microorganismului însămânţat;
hidroliza ureei va duce la alcalinizare mediului (culoarea virează de la galben la roşu);
producerea de indol din triptofan va fi indicată de înroşirea reactivului Ehrlich
Materiale necesare:
- tuburi de dimensiuni mici cu mediul MIU
- hârtiuţe indicator cu reactiv Ehrlich (se poate folosi şi reactiv Kovacs)
- colonii de identificat (colonii izolate, cultură pură)
- ansă fir etc
Tehnica de lucru:
Utilizăm pentru însămânţare o ansă fir. Prelevăm din colonia izolată pe mediu neselectiv
(dacă pentru cultivare au fost utilizate medii selective trebuie să prelevăm cu grijă, fără să
atingem mediul de cultură) şi însămânţăm mediul prin înţepare încercând să realizăm o
însămânţare în “linie dreaptă”. Fixăm de dop hîrtiuţa indicator în aşa fel încât să ajungă
deasupra coloanei de mediu, fără să îl atingem. Incubăm la 35-37°C timp de 24 ore. În cazul
în care nu are loc virarea culorii mediului, incubăm până la 48 de ore.
Interpretare:
a) din punctul de vedere al mobilităţii:
opacifierea apare numai pe traiectul de însămânţare – bacteria este imobilă
opacifierea este uniformă în coloana de mediu – bacteria este mobilă
b) din punctul de vedere al producerii ureazei:
culoarea coloanei rămâne galbenă – bacteria este ureazo negativă
culoarea devine roşie – bacteria este ureazo pozitivă
apariţia unui inel de culoare roşie la suprafaţa mediului nu reprezintă un test pozitiv
c) din punctul de vedere al transformării triptofanului în indol:
schimbarea culorii hârtiei la roşu-violet – bacteria este indol pozitivă
culoarea hârtiei rămâne albă – bacteria este indol negativă
alternativ, în lipsa hârtiuţelor indicator se poate picura reactiv Ehrlich la suprafaţa
mediului şi interpreta modificarea / lipsa modificării culorii
Control de calitate:
Martor pozitiv – Proteus mirabilis M+ U+ I+
Martor negativ – Shigella spp. M- U- I-
3. Mediul multitest MILF (mobilitate indol lizin-decarboxilază fenil-alanin-dezaminază)
Principiu:
Mediul conţine o cantitate scăzută de glucoză, peptonă cu DL-triptofan, L-lizină, DL-
fenil-alanină, bromcrezol purpur soluţie 2% (indicator de pH) şi este condiţionat în tuburi de
dimensiuni mici. Geloza este moale permiţând mobilitatea microorganismului însămânţat.
Producerea de indol din triptofan va fi indicată de înroşirea reactivului Ehrlich.
Decarboxilarea lizinei va duce la alcalinizare mediului (în absenţa lizin-decarboxilazei rezultă
o uşoară acidifiere a mediului datorită fermentării glucozei). Dezaminarea fenil-alaninei duce
la apariţia de acid fenil-piruvic şi amoniac; adăugând clorură ferică rezultă o culoare verde.
Materiale necesare:
- tuburi de dimensiuni mici cu mediul MILF
- hârtiuţe indicator cu reactiv Ehrlich (se poate folosi şi reactiv Kovacs)
- colonii de identificat (colonii izolate, cultură pură)

2
 - ansă fir etc
Tehnica de lucru:
Tehnica de lucru este asemănătoare cu cea expusă la punctul 2.
Interpretare:
a) din punctul de vedere al mobilităţii:
opacifierea apare numai pe traiectul de însămânţare – bacteria este imobilă
opacifierea este uniformă în coloana de mediu – bacteria este mobilă
b) din punctul de vedere al transformării triptofanului în indol:
schimbarea culorii hârtiei la roşu-violet – bacteria este indol pozitivă
culoarea hârtiei rămâne albă – bacteria este indol negativă
c) din punctul de vedere al producerii lizin-decarboxilazei:
alcalinizarea coloanei traduce prezenţa enzimei
acidifierea uşoară a coloanei traduce absenţa enzimei
d) din punctul de vedere al producerii fenil-alanin-dezaminazei:
apariţia unui “inel” de culoare verde la suprafaţa mediului şi la nivelul traiectului de
însămânţare după adăugarea unei picături de clorură ferică 10% traduce prezenţa enzimei
Control de calitate:
Martor pozitiv – Proteus mirabilis M+ I+ FD-ază+ LD-ază-
Martor negativ – Klebsiella pneumoniae M- I- FD-ază- LD-ază+
4. Testul utilizării citratului ca unică sursă de carbon (Simmons)
Principiu:
Unele dintre enterobacterii deţin un echipament enzimatic care permite asimilarea şi
utilizarea citratului ca unică sursă de carbon. Utilizând un mediu care conţine citrat şi un
indicator de pH, putem identifica alcalinizarea mediului şi respectiv acea enterobacterie care
poate utiliza citratul ca unică sursă de carbon.
Materiale necesare:
- o suspensie relativ densă obţinută din colonia (cultură pură) bacteriei pe care dorim să o
identificăm
- mediul care conţine acid citric 0,2% (Simmons), turnat în pantă în eprubete mici; în
prezenţa indicatorului de pH şi la pH neutru, mediul neînsămânţat are o culoare verde
Tehnica de lucru:
- cu ajutorul unei anse, prelevăm suspensie bacteriană pe care o însămânţăm într-un
singur striu pe suprafaţa mediului Simmons
- incubăm la 37ºC şi examinăm dezvoltarea culturii şi eventuala modificare a culorii
mediului
Interpretare:
apariţia unei culturi bacteriene de-a lungul striului, însoţită de modificare culorii care devine
albastră, semnifică un test pozitiv = bacteria utilizează citratul ca unică sursă de carbon
în prezenţa unui tub fără dezvoltarea culturii, culoarea mediului fiind verde putem notifica un
rezultat negativ
Control de calitate:
Martor pozitiv – Klebsiella pneumoniae / Enterobacter cloacae
Martor negativ – Escherichia coli