Examenul microscopic al bacteriilor – preparate proaspete, frotiuri, coloranti,

coloratii.
Tehnica execuţiei frotiului din produse patologice si culturi.
Coloraţia cu albastru de metilen, coloraţia Gram, coloraţia Ziehl-Neelsen.

În schema generală de diagnostic microbiologic (direct) vom examina microscopic

produsul patologic (etapa a 2-a) sau colonia apărută pe mediul de cultură (etapa a 4-a, punctul
b, identificarea pe baza caracterelor morfotinctoriale).
Uneori examenul microscopic este decisiv pentru diagnostic, alteori are un rol orientativ.
Preparate microscopice proaspete (umede, native, între lamă şi lamelă)
- este de preferat să folosim lame şi lamele noi supuse următoarelor proceduri succesive
(imersare în amestec sulfo-cromic câteva zile, spălare, clătire, păstrare în alcool 50%)
- lamele se usucă (folosim o cârpă curată) apoi se degresează suplimentar prin flambare
(trecere de câteva ori prin flacăra becului Bunsen)
- depunem pe lamă o picătură din produsul care urmează a fi studiat
- dacă produsul patologic are consistenţă lichidiană (ex. urină, sediment urinar, materii
fecale, LCR) va fi utilizat ca atare; pentru o mai bună vizualizare putem adăuga albastru de
metilen, lugol, tuş de India, nigrozină etc
- dacă vrem să studiem spre exemplu mobilitatea microorganismelor care au format
colonii pe un mediu solid vom descărca o ansă din colonie într-o picătură de soluţie
salină fiziologică, apă distilată sau bulion
- dacă p.p. este recoltat într-o suspiciune de micoză superficială, pe lama de microscop
se va depune o picătură dintr-o soluţie 10-20% KOH-glicerol în care se va descărca şi
dispersa p.p.
- acoperim picătura cu o lamelă
- cel mai frecvent presăm uşor lamela pentru a elimina eventualele bule de aer
- în cazul p.p. recoltat într-o suspiciune de micoză superficială, încălzim uşor preparatul
prin trecere cu grijă, de 2-3 ori, pe deasupra flăcării becului Bunsen
- dacă vrem să studiem aspectul fungilor filamentoşi (mucegaiuri) dintr-o colonie, nu
trebuie să mişcăm sau să presăm lamela
- în microscopia optică pe câmp luminos aşezăm preparatul pe platina microscopului şi
examinăm iniţial cu obiectivul 10x, apoi cu obiectivul 20x sau 40x (nu folosim
obiectivul de imersie); se pot folosi şi alte tehnici microscopice.
Executarea frotiurilor din p.p. cu consistenţă fluidă sau din culturi microbiene
realizate în mediu de cultură lichid
- după ce am flambat lama, o aşezăm cu partea flambată în sus
- sterilizăm ansa bacteriologică şi aşteptăm să se răcească
- prelevăm aseptic p.p. / cultură şi depunem produsul în centrul lamei
- întindem prin mişcări de “dute-vino” (de “haşurare”) pe axul lung al lamei produsul
prelevat, în strat cât mai subţire, având grijă să nu ne apropiem de marginile lamei /
întinderea se poate face şi prin mişcări circulare, excentrice
- lăsăm lama să se usuce lângă becul de gaz (nu grăbim uscarea prin eventuale treceri
ale frotiului prin flacără) – în cazul în care avem în dotare un dispozitiv în care lama se
poate aşeza şi usca la +70ºC, vom utiliza această metodă
- fixăm frotiul; există metode chimice de fixare, însă cel mai frecvent folosim fixarea
prin căldură, distrugând în acelaşi timp şi microorganismele (care prezintă o afinitate
tinctorială mai mare decât celulele vii)
- în acest scop, trecem frotiul prin flacără (aşa cum am procedat şi pentru flambarea
lamei, înainte de executarea frotiului) însă de această dată partea pe care am întins p.p.

1
 sau cultura este orientată în sus; ca o modalitate de control, atingem dosul mâinii cu
lama flambată iar temperatura atinsă prin flambare nu trebuie să fie mai mare decât pe
care o putem suporta
- frotiul fixat este gata pentru colorare
Executarea frotiurilor din p.p. cu consistenţă solidă sau din culturi microbiene
realizate în mediu de cultură solid
- după ce am flambat lama, o aşezăm cu partea flambată în sus
- cu ajutorul flaconului cu picurător sau cu ansa bacteriologică sterilizată şi răcită
depunem în centrul lamei o picătură de soluţie salină fiziologică sau apă distilată
- sterilizăm ansa bacteriologică şi aşteptăm să se răcească
- prelevăm aseptic p.p. / un fragment din colonie şi depunem produsul în picătura de
fluid de pe lamă
- omogenizăm foarte bine p.p. / fragmentul de colonie în picătura de fluid
- procedăm ca mai sus pentru întinderea, uscarea şi fixarea frotiului
Executarea amprentelor de organ / alte p.p.
- flambăm lama
- cu partea flambată atingem suprafaţa de secţiune a organului respectiv
- lama se poate aplica şi pe suprafaţa de secţiune a unor prelevate bioptice sau obţinute
prin necropsie
- procedăm ca mai sus pentru uscarea şi fixarea frotiului
Colorarea frotiurilor
În vederea colorării avem nevoie de o trusă pentru colorare (stativ de colorare, coloranţi
conform “reţetei” de colorare, apă distilată sau apă curentă pentru spălare, stativ de uscare).
Pentru colorarea frotiurilor din produs patologic folosim cel mai frecvent coloraţiile cu
albastru de metilen (A.M.), Gram şi după caz, Ziehl-Neelsen.
În cazul multora dintre coloraţiile uzuale au fost realizate diferite modificări în funcţie de
experienţa autorilor şi scopul urmărit. De ex. coloraţia cu A.M poate avea următoarele
variante:
- albastru de metilen Löffler pentru cele mai multe coloraţii simple sau ca un al doilea
colorant în coloraţia Ziehl-Neelsen
- albastru de metilen policrom pentru evidenţierea Bacillus anthracis în p.p., pentru
corynebacterii sau înlocuind coloraţia de mai sus
- albastru de metilen (varianta Wayson) pentru p.p., cu o sensibilitate mai bună decât
utilizarea A.M. Löffler etc.
Coloraţia cu albastru de metilen
- acoperim frotiul cu soluţie de albastru de metilen, pentru 3-4 minute (nu are rost să
acoperim cu colorant lama în întregime)
- spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet
- aşezăm frotiul în stativ pentru uscare (de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare
cu sugativă sau hârtie de filtru
- examinăm la microscop, notăm observaţiile, interpretăm
Coloraţia Gram
- diluăm într-un recipient fucsina (9 părţi apă distilată / 1 parte fucsină)
- acoperim frotiul cu violet de metil sau cristal violet (violet de genţiană din punct de
vedere istoric), pentru 1-3 minute (nu are rost să acoperim cu colorant lama în
întregime)
- îndepărtăm colorantul
- acoperim frotiul cu lugol (mordant, fixator) pentru 1-3 minute
- îndepărtăm lugolul

2
 - acoperim frotiul cu un amestec de alcool-acetonă (1 parte acetonă / 3 părţi alcool de
96º) pentru un timp foarte scurt, 7-8 secunde
- spălăm insistent cu apă distilată sau apă de la robinet
- acoperim frotiul cu fucsina diluată 1/10 pentru 1 minut
- spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet
- aşezăm frotiul în stativ pentru uscare (de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare
cu sugativă sau hârtie de filtru
- examinăm la microscop, notăm observaţiile, interpretăm
Coloraţia Ziehl-Neelsen
Este o coloraţie utilă în identificarea prezenţei de bacili acid-alcool rezistenţi (BAAR),
solubilizând peretele bacterian prin creşterea temperaturii, facilitând penetrarea colorantului.
- punem frotiul uscat şi fixat pe un suport situat deasupra tăviţei de colorare
- acoperim complet lama cu fucsină bazică nediluată (filtrată extemporaneu)
- trecem becul de gaz aprins pe sub lama acoperită de fucsină, până începe emiterea de
vapori (nu atingem temperatura de fierbere). În cazul în care lama nu mai este
acoperită complet cu fucsină, adăugăm colorant. Timpul de lucru este de 10 minute,
perioadă în care repetăm de 3 ori operaţia de încălzire a lamei până la emiterea de
vapori.
- spălăm insistent cu apă distilată sau apă de la robinet
- adaugăm amestecul decolorant acid-alcool (3 ml acid clorhidric concentrat / 97 ml
alcool etilic 90-95º), pentru 2-3 minute
- spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet
- recolorăm cu albastru de metilen, 1 minut
- spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet
- aşezăm frotiul în stativ pentru uscare (de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare
cu sugativă sau hârtie de filtru
- examinăm la microscop, notăm observaţiile, interpretăm.