Cultura mixtă

biomasă de celule rezultate din reproducerea mai multor celule

microbiene din specii diferite, într-un mediu nutritiv steril, cu volum
limitat

Cultura pură
biomasă de celule rezultate din reproducerea unei singure celule

Scopul cultivării
izolarea microorganismelor în cultură pură
identificarea agentului etiologic al unei infecţii
obţinerea culturilor în procesele fermentative industriale
determinarea farmacorezistenţei microorganismelor izolate
preparare seruri şi vaccinuri

Metode de cultivare Parametri de creștere metoda prin epuizare

pe medii de cultură creștere în sistem închis
artificiale
metoda în sector
(pe medii de cultură în
▪ bacterii cutii Petri sau eprubete)
metoda în strii
▪ fungi
creștere în sistem deschis metoda Koch
▪ unii paraziţi unicelulari
pe animale de experienţă
metode prin diluare
▪ bacterii Tipuri de însămânţare metoda Lindner
▪ virusuri metode fizice metoda Naumov
pe culturi celulare metode biologice
▪ virusuri inundare
▪ unele bacterii izolare cu ajutorul micromanipulatorului

metoda prin epuizare metoda prin epuizare

se descarcă produsul cu ajutorul ansei de platină într-
un prim sector, pe mediu de cultură adecvat solid
turnat în cutie Petri
se sterilizează ansa
se diseminează produsul însămânţat anterior sub
formă de striuri paralele
cu ansa resterilizată, se continuă procedura până se
acoperă toată suprafaţa mediului, terminând
diseminarea cu un zigzag
este metoda cea mai folosită pentru obţinerea
coloniilor izolate (care se vor dezvolta în ultimul
sector)
dacă produsul din care se efectuează
însămânţarea conţine mai multe specii
bacteriene, acestea vor crește
▪ confluent în primul sector, neputându-se diferenţia
▪ izolate una de alta în ultimul sector
▪ cultura = cultură mixtă
din ultimul sector se poate replica o colonie
izolată pe un mediu nou de cultură
▪ cultura = cultură pură, formată dintr-un singur tip de
bacterie
 cultură mixtă

cultură mixtă

Însămânțare prin epuizare

cultură pură

metoda în sector Însămânțare în sector

se descarcă produsul cu ajutorul ansei de platină

într-un sector de cerc, pe mediu de cultură
adecvat solid turnat în cutie Petri
dacă produsul din care se efectuează
însămânţarea conţine mai multe specii
bacteriene, acestea vor crește confluent,
neputându-se diferenţia
metoda este folosită pentru păstrarea pe o placă a
mai multor tulpini bacteriene diferite

metoda în striuri metoda Koch

se descarcă produsul cu ajutorul ansei de platină
succesiv în 3-4 eprubete cu mediu de cultură solid,
turnat în coloană înclinată
în ultima eprubetă apar colonii izolate, care se pot
replica ulterior pe medii noi pentru a se obţine
cultură pură
folosită pentru izolarea de drojdii
ca mediu de cultură se folosește mustul de malţ cu
gelatină, fluidificat la 40°C
produsul de însămânţat se introduce succesiv în 3-5
eprubete cu mediu de cultură, prin agitare asigurându-se
dispersia uniformă a microorganismelor
conţinutul fiecărei eprubete se toarnă în plăci Petri sterile
la temperatura camerei mediul se solidifică, captând
celulele de drojdie, care prin multiplicare vor forma colonii
în funcţie de densitatea celulelor recoltate iniţial, în placa 2
sau 3 coloniile vor fi suficient de distanţate pentru a fi
identificate și replicate pe placă nouă

metoda Koch
metoda Naumov
folosită pentru izolarea mucegaiurilor
din diluţia convenabilă se adaugă pe o lamă picături peste
care se adaugă mediu de cultură fluidificat
după 2-3 zile se recoltează picătura cu o singură colonie
pentru a obţine cultură pură
metoda prin inundare
folosită pentru separarea sporilor fungici
1-2 ml din diluţia convenabilă se toarnă peste mediul de
cultură din cutia Petri
excesul de lichid se aspiră
sporii atașaţi de mediu vor germina și vor forma colonii
izolate
pot fi selectate bacteriile sporogene din
mediile naturale, pe baza rezistenţei sporilor
la temperaturi ridicate
Bacillus subtilis se poate izola din infuzie de fân
prin fierbere (sporii rezistă, alte bacterii mor)
ulterior sporii germinează, bacteriile se multiplică
și formează un văl de cultură la suprafaţă
înainte de însămânţare este necesară crearea
unor diluţii succesive din produsul de
însămânţat, astfel încât numărul de germeni din
ultima diluţie să fie redus
metoda Lindner
picături din diluţia optimă se examinează la microscop
pe o lamă sterilă
se notează picătura care conţine o singură celulă
se colectează picătura cu o hârtie de filtru sterilă și se
introduce în mediu de cultură
metoda Burri
separarea bacteriilor dintr-un produs se face în funcţie
de necesarul de oxigen pentru creștere
proba de testat se omogenizează cu mediu de cultură
fluidificat la 42°C, iar după uniformizare se introduce
într-o eprubetă închisă cu dop de vată
prin răcirea și solidificarea mediului, celulele
bacteriene sunt imobilizate în coloană
după incubare
▪ bacteriile aerobe se dezvoltă în partea superioară
▪ bacteriile anaerobe se dezvoltă în partea inferioară
▪ bacteriile microaerofile se dezvoltă la mijloc
se folosește pentru a se evita
consumul nutrienţilor din mediu de către bacterii
instalarea fazei staţionare de creștere
autosterilizarea culturii prin lipsă de nutriente și
eliberare de metaboliţi toxici în mediul de cultură
în sistem deschis (continuu) se menţin constante
condiţiile de cultivare prin introducerea continuă
de nutrienţi și eliminarea produșilor de
catabolism
 chemostat turbidistat
fluxul mediului de o fotocelulă măsoară
cultură este reglat turbiditatea culturii din
mecanic, la o rată bine vasul de creștere și
stabilită reglează automat rata
rata de creștere de furnizare a agentului
microbiană este limitată nutritiv pentru a
de concentraţia menţine constantă
nutrientului proaspăt densitatea celulelor

1. Rezervor de mediu 2. Regulator 3. Valvă aer 4. Filtru aer 1. Rezervor de mediu 2. Valvă 3. Drenaj
5. Valvă pentru inoculare 6. Sifon 7. Cameră de creștere 8. Recipient deșeuri 4. Foto-celulă 5. Sursă de lumină 6. Turbistat

Colonii „S” (smooth)

suprafaţa bombată,
netedă
margini circulare
aspect strălucitor
suspensionează omogen în
SF
în mediul lichid - tulburare
caracteristice pentru
germeni patogeni

Colonii „R” (rough)

suprafaţa plată, rugoasă
margini crenelate
uscate, mate
aderente de mediu
aglutinează spontan în ser fiziologic
în mediu lichid – sediment cu supernatant clar
caracteristice pentru germeni degradaţi, cu modificări
antigenice şi de virulenţă
▪ EXCEPŢII:
▪ Mycobacterium tuberculosis;
▪ Corynebacterium diphtheriae;
▪ Bacillus anthracis
colonii „R” (Bacillus)
 Colonii „M” (mucoid)
suprafaţa netedă
foarte lucioasă, mucoasă
tendinţă de curgere,
confluare
foarte mari
caracteristice pentru
germeni cu capsulă

colonii “R” (Mycobacterium)

Colonii „untoase”
rotunde, bombate
suprafaţa netedă
mate / strălucitoare
margini regulate
consistenţă păstoasă,
cremoasă
uneori pigmentate
caracteristice pentru
levuri (Candida)

colonii “M”

Colonii „pufoase” Fenomen de „căţărare”

reţea de filamente (hife) strat continuu sub forma unor valuri succesive
aeriene caracteristic pentru Proteus spp.
caracteristice fungilor
filamentoşi
!! ÎN MEDIUL LICHID NU SE FORMEAZĂ COLONII

tulburare uniformă (omogenă) – formele „S” ale germenilor;

S. aureus
inel aderent de recipient – E. coli
peliculă (văl) la suprafaţă cu mediul limpede
▪ fină – Vibrio cholerae
▪ fină + pigment – Pseudomonas aeruginosa
▪ groasă, rugoasă – Mycobacterium tuberculosis
mediul limpede cu depozit
▪ grunjos, nisipos – Streptococcus pyogenes PELICULĂ TULBURARE
INEL DEPOZIT
▪ floconos – Bacillus anthracis