Microbiologie Generala

Microbiologie General - Lucrri practice
Gheorghe PUCHIANU
MICROBIOLOGIE GENERAL
Lucrri practice
CUPRINS
Numrul
Denumire
Laboratorului
1.
Norme de protecia muncii n laboratoarele de microbiologie n
vederea prevenirii contaminrii personalului
2.
Condiiile necesare
a fi ndeplinite pentru funcionarea
laboratoarelor de microbiologie
3.
Sterilizarea i dezinfecia
Mediile de cultur folosite pentru izolarea diferitelor tipuri de bacterii
4.
Tehnica nsmnrii i a transplantrilor
5.
Examenul caracterelor culturale
6.
Examinarea caracterelor metabolice (biochimice) ale germenilor
7.
bacterieni
8.
bacterieni
9.
bacterieni
Tehnica efectuarii frotiurilor
10.
Metode de colorare a frotiurilor
11.
Metode de microscopie folosite n microbiologie
12.
Diagnosticul bolilor parazitare
13 -14
Abrevieri
Definiii
Bibliografie
Pag.
1
4
9
13
19
21
26
30
33
37
40
42
47
51
52
54
LABORATOR NR. 1
Norme de protecia muncii n laboratoarele de microbiologie n vederea
prevenirii contaminrii
n laborator, microorganismele pot ptrunde n organismul uman prin mai
multe ci:
mucoasa digestiv: n cursul pipetrii cu gura , introducerea n gur a
degetelor sau diferitelor obiecte de pe mesele de laborator (creioane,
igri, alimente), inhalare de aerosoli, etc.;
mucoasa ocular: cum ar fi stropii de material lichid infecios, sau
tergerea ochilor cu degetul protejat sau nu de mnui.
calea transcutanat: mai ales n cazul preexistenei unor plgi prin
tiere sau zgrieturi sau prin nepturi (ex. cu cioburi de sticl
contaminate).
Evoluia infeciilor contactate n laborator poate fi atipic dar uneori i foarte
grav. OMS a stabilit 4 niveluri de exigen n ceea ce privete clasificarea
laboratoarelor. Nivelurile 1 i 2 corespund laboratoarelor de baz, 3 laboratoarelor cu
regim restrictiv, i 4 celor cu maxim restricie.
Pentru nvmntul universitar, din punct de vedere al biosiguranei
laboratorele de microbiologie trebuie s corespund nivelului 2 de biosecuritate,
acest lucru presupunnd obligativitatea existenei unor mijloace de protecie (halate,
semnalizarea riscului biologic, tehnologie microbiologic f. bun), iar pentru locul de
munc, existena unor mese deschise dar i a unor boxe de siguran de clasa I sau
clasa II (pentru activitile generatoare de aerosoli).
Conform Ghidului Naional de Biosoguran pentru Laboratoarele Medicale,
emis de Ministerul Sntii pentru prevenirea mbolnvirii personalului care i
desfoar activitatea n domeniul diagnosticului de laborator, trebuie respectate
urmtoarele cerine:
Accesul
Numai persoanele autorizate vor fi lsate s intre n zonele de lucru ale
laboratorului.
Uile laboratorului trebuie s stea nchise.
Protecia individual a personalului
Halatele sau uniformele trebuie purtate tot timpul ct se lucreaz n laborator.
Mnui corespunztoare de protecie trebuie purtate n timpul tuturor procedurilor
care pot implica contactul direct sau accidental cu snge, cu alte materiale
potenial infecioase sau cu animale infectate. Dup utilizare, mnuile se scot
aseptic i se spal minile.
Personalul trebuie s se spele pe
mini dup manipularea materialelor
3
infecioase i a animalelor infectate i nainte de prsirea zonei de lucru a

laboratorului.
Este interzis purtarea mbrcminii protectoare de laborator n afara
laboratorului, de exemplu ncantine, camere de oficiu, biblioteci, toalete, etc.
nclmintea decupat n partea din fa (sandale) este improprie purtrii n
laborator.
Consumul de alimente, buturi, machiajul i manipularea lentilelor de contact sunt
interzise n zonelede lucru ale laboratorului.
Depozitarea de alimente sau buturi oriunde n zona de lucru a laboratorului este
interzis.
mbrcmintea i nclmintea de protecie ce a fost utilizat n laborator nu
trebuie s fie depozitatn aceleai dulapuri cu mbrcmintea i nclmintea de
strad.
Procedurile
Pipetarea cu gura este strict interzis.
Nici un material nu trebuie dus la gur.
Toate stropirile accidentale i expunerile evidente sau posibile cu material
infecios trebuie raportate responsabilului laboratorului. Se va pstra o eviden
scris a acestor accidente i incidente.
Se va elabora i aplica o procedur scris pentru curarea-inactivarea
substanelor vrsate.
Lichidele contaminate trebuie decontaminate (chimic sau fizic) naintea evacurii
lor n reeaua de canalizare. n funcie de riscul evaluat se poate dezvolta un
sistem de tratare a acestor lichide.
Zonele de lucru ale laboratorului
n laborator trebuie pstrat curenia i ordinea, eliminndu-se toate materialele
care nu sunt necesare pentru munca desfurat n laborator.
Suprafeele de lucru trebuie decontaminate dup fiecare vrsare de materiale
potenial periculoase precum i la sfritul zilei de lucru.
Toate materialele contaminate, probele i culturile, trebuie decontaminate nainte
de a fi ndeprtatesau curate pentru refolosire.
Ambalarea i transportul trebuie s respecte reglementrile naionale i/sau
internaionale n vigoare.
Ferestrele ce pot fi deschise trebuie prevzute cu plase/ecrane pentru insecte.
Managementul biosiguranei
Responsabilul cu activitatea laboratorului (subordonat efului laboratorului)
trebuie s asigure instruirea periodic a personalului laboratorului n domeniul
siguranei.
Personalul trebuie avertizat asupra pericolelor speciale i are obligaia s citeasc
manualul de siguran i operaiuni i s respecte procedurile i practicile
standard. Responsabilul laboratorului trebuie s se asigure c toi membrii
personalului i-au nsuit aceste reguli. O copie a manualului de siguran i
4
operaiuni trebuie s existe permanent n laborator pentru a putea fi consultat n

orice moment.
Trebuie s existe un program de dezinsecie i deratizare.
Trebuie asigurate, n caz de necesitate, pentru toi membrii personalului, o
evaluare, supraveghere i tratament, i trebuie inute evidene medicale adecvate.
Conceperea structurii i facilitilor laboratorului
n proiectarea laboratorului i stabilirea efecturii anumitor activiti n spaiul
acestuia, se va acorda o atenie deosebit situaiilor despre care se tie c ridic
probleme de siguran. Acestea sunt: formarea de aerosoli; manipularea de
volume mari i/sau de concentraii ridicate de microorganisme; supraaglomerarea
spaiului de lucru sau acumularea de prea multe echipamente; infestarea cu
roztoare i insecte; accesul neautorizat.
Echipamente eseniale pentru asigurarea biosiguranei
Dispozitive de pipetare, pentru a evita pipetarea cu gura. Sunt disponibile diverse
modele.
Hotele de biosiguran, ce trebuie folosite ori de cte ori: se manipuleaz
materiale infecioase; aceste materiale pot fi centrifugate n spaiul deschis al
laboratorului dac se folosesc cupe de centrifug cu dispozitiv de securizare i
dac sunt introduse i descrcate ntr-o hot de biosiguran exist risc crescut
de infecii aerogene - se folosesc proceduri cu potenial ridicat de producere de
aerosoli: centrifugarea
Anse de transfer de unic folosin din plastic. Alternativ, n scopul reducerii
producerii de aerosoli, n interiorul hotei de biosiguran se pot folosi incineratoare
electrice pentru anse de transfer.
Tuburi i flacoane cu capace prevzute cu filet.
Autoclave sau alte mijloace folosite pentru decontaminarea materialului infecios.
Pipete Pasteur de unic folosin din plastic, ori de cte ori este posibil, evitnd
utilizarea celor din sticl.
Echipamentele precum autoclavele i hotele de biosiguran trebuie validate cu
metode adecvate nainte de a fi introduse n uz. Acestea trebuie revertificate la
intervale regulate de timp, n acord cuinstruciunile productorului (vezi Capitolul
7).
Riscul de inhalare (ex. producerea de aerosoli) cu ocazia folosirii anselor,
nsmnrii plcilor cuagar, pipetrii, etalrii frotiurilor, deschiderii recipientelor ce
conin culturi, recoltrii de probe de snge/ ser, centrifugrii, etc.
Riscul de ingerare, cu ocazia manipulrii probelor, frotiurilor i culturilor.
Riscul de expunere percutan, prin folosirea seringilor i acelor.
Decontaminarea i eliminarea materialelor infecioase.
Manipularea deeurilor
Se consider deeuri toate materialele care se arunc.
Decontaminarea
Autoclavarea cu abur este metoda de elecie pentru toate procesele de
decontaminare.
5
Materialele care urmeaz s fie decontaminate i eliminate vor fi puse n

containere adecvate (ex. saci
LABORATOR NR. 2
Condiiile pentru funcionarea laboratoarelor supuse controlului sanitar
veterinar i pentru sigurana alimentelor
Funcionarea laboratoarelor n care se desfoar activiti supuse autorizrii
pentru sigurana alimentelor este condiionat de autorizarea acestora de ctre
autoritile competente.
Categoriile de laboratoare supuse controlului pentru sigurana
alimentelor, sunt:
laboratoarele de referin: pentru sigurana alimentelor, organizate n cadrul
Institutului de Igien i Sntate Public Veterinar;
alte laboratoare naionale de referin desemnate prin ordin al preedintelui
Autoritii Naionale Sanitare Veterinare i pentru Sigurana Alimentelor;
laboratoare sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene,
respectiv al municipiului Bucureti, organizate n cadrul direciilor sanitarveterinare i pentru sigurana alimentelor judeene, respectiv a municipiului
Bucureti;
laboratoare sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor organizate n
cadrul unitilor de nvmnt medical veterinar superior de stat, desemnate
de autoritatea competent s efectueze anumite analize sau examene n
cadrul controlului oficial;
laboratoare organizate n cadrul institutelor de cercetare de stat n care se
desfoar activiti supuse controlului sanitar veterinar i pentru sigurana
alimentelor;
laboratoarele private sanitare veterinare i/sau pentru sigurana alimentelor,
care includ: laboratoare sanitare veterinare i/sau pentru sigurana alimentelor
particulare ori organizate n uniti private n care se desfoar activiti
sanitare veterinare i/sau pentru sigurana alimentelor; laboratoare organizate
n uniti n care se desfoar activiti supuse controlului sanitar veterinar i
pentru sigurana alimentelor, cunoscute sub denumirea de laboratoare
uzinale;
laboratoare sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor organizate n
cadrul unitilor de nvmnt medical veterinar superior privat, desemnate de
autoritatea competent s efectueze anumite analize sau examene n cadrul
controlului oficial;
laboratoare organizate n cadrul institutelor de cercetare private n care se
desfoar activiti supuse controlului sanitar veterinar i pentru sigurana
alimentelor.
6
Laboratoarele naionale de referin sunt autoriti centrale pentru domeniile

de competen autorizate, iar laboratoarele sanitare veterinare i pentru sigurana
alimentelor judeene, respectiv al municipiului Bucureti, sunt autoriti judeene n
domeniu.
Acestea funcioneaz sub coordonarea tehnic i operaional a Serviciului de
coordonare tehnic a institutelor de referin i a laboratoarelor sanitare veterinare i
pentru sigurana alimentelor din cadrul Autoritii Naionale Sanitare Veterinare i
pentru Sigurana Alimentelor.
Laboratoarele sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor de
supraveghere i diagnostic din structura institutelor veterinare centrale sunt autoriti
centrale pentru domeniul lor de competen i funcioneaz sub coordonarea tehnic,
controlul i supravegherea Serviciului de coordonare tehnic a institutelor de referin
i a laboratoarelor sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor din cadrul
Autoritii Naionale Sanitare Veterinare i pentru Sigurana Alimentelor.
Laboratoarele sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene,
respectiv al municipiului Bucureti, sunt autoriti judeene pentru domeniile lor de
competen i funcioneaz n cadrul direciilor sanitar-veterinare i pentru sigurana
alimentelor judeene i a municipiului Bucureti, sub coordonarea tehnic a
laboratoarelor din cadrul institutelor veterinare centrale i coordonarea operaional
prin Serviciul de coordonare tehnic a institutelor de referin i a laboratoarelor
sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor din cadrul Autoritii Naionale
Sanitare Veterinare i pentru Sigurana Alimentelor.
Laboratoarele sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor organizate n
cadrul unitilor de nvmnt medical veterinar superior de stat i privat nu au
statutul de autoriti n domeniu i funcioneaz sub supravegherea tehnic a
institutelor veterinare centrale.
Laboratoarele organizate n cadrul institutelor de cercetare de stat i private n
care se desfoar activiti supuse controlului sanitar veterinar i pentru sigurana
alimentelor nu sunt autoriti n domeniu i funcioneaz sub supravegherea tehnic a
institutelor veterinare centrale.
Celelalte laboratoare private n care se desfoar activiti supuse controlului
sanitar veterinar i pentru sigurana alimentelor nu sunt autoriti n domeniu i
funcioneaz sub supravegherea tehnic a direciilor sanitar-veterinare i pentru
sigurana alimentelor judeene i a municipiului Bucureti, prin laboratoarele sanitare
veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene, respectiv al municipiului
Bucureti.
Buletinele de analiz emise de laboratoarele autorizate Laboratoarele
naionale de Referin i Laboratoarele sanitare veterinare Judeene, precum i cele
emise de laboratoarele sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor organizate
n cadrul unitilor de nvmnt medical veterinar superior de stat i privat
autorizate au caracter oficial.
Activitile pentru care se autorizeaz laboratoarele n care se desfoar
activiti supuse autorizrii sanitare veterinare i/sau pentru sigurana alimentelor,
menionate n domeniul siguranei alimentare sunt urmtoarele:
7
1. laborator de microbiologia alimentelor - cu profilurile:

microbiologia produselor i subproduselor animaliere i de origine
animal;
microbiologia produselor de origine nonanimal;
microbiologia apei;
2. laborator de analize fizico-chimice ale alimentelor - cu profilurile:
analize fizico-chimice ale produselor i subproduselor animaliere i de
origine animal;
analize fizico-chimice ale produselor de origine nonanimal;
analize fizico-chimice ale apei;
4. laborator pentru controlul reziduurilor - cu profilurile:
a) control reziduuri la animale vii;
b) control reziduuri la produse animaliere i de origine animal;
c) control reziduuri din ap i hran pentru animale;
d) control reziduuri la produse de origine nonanimal.
3. laborator pentru controlul radioactivitii i detecia alimentelor iradiate
- cu profilurile:
a) controlul radioactivitii;
b) detecia alimentelor iradiate;
Condiii pe care trebuie s le ndeplineasc un laborator
Condiii de amplasare - trebuie s includ: referine generale privind
distanele, structura terenului i nivelul apei freatice, existena cilor de acces
adecvate, a unei suprafee de teren de rezerv sau tampon pentru eventuala
extindere.
Amplasarea cldirilor destinate laboratoarelor se face astfel nct: distana fa
de cldirile nvecinate i drumurile publice s fie astfel proiectat nct s asigure
respectarea prevederilor legale privind protecia mediului, sigurana cldirilor,
sntatea public i sntatea animalelor; structura terenului i nivelul apelor freatice
s permit amplasarea construciei n conformitate cu reglementrile n vigoare; s
aib ci de acces proprii adecvate scopului de activitate.
Condiii pentru construcie
Condiiile pentru construcie trebuie s includ: natura i calitatea
materialelor de construcie, a fundaiei, a pavimentelor, a suprafeelor
interioare, a uilor i ferestrelor, a acoperiului i a echipamentelor de
iluminare, ventilaie i protecie antiseismic.
Construcia realizat trebuie s fie rezistent, s aib spaiu suficient pentru
desfurarea proceselor de lucru i s asigure condiiile pentru aplicarea
msurilor de igienizare, realizarea confortului termic i condiiile tehnice de
funcionare a echipamentelor.
Materialele de construcie trebuie s fie netoxice, impermeabile, netede,
rezistente la uzur i coroziune i s se poat cura uor. Nu se accept
folosirea materialelor absorbante, poroase, greu de curat.
Pavimentele i pereii interiori
trebuie construii din materiale
8
netoxice, rezistente la ageni fizici i chimici, impermeabile, neputrezibile i

netede, nct s permit igienizarea uoar i eficient a acestora, protecia
termic i protecia fonic.
Tavanele din spaiile de lucru trebuie construite din materiale netoxice,
rezistente la ageni fizici i chimici, impermeabile, neputrezibile i netede,
nct s permit igienizarea uoar i eficient a acestora, protecia termic
i protecia fonic, i s fie situate la o nlime corespunztoare, adecvat
specificului activitii.
Instalaiile electrice trebuie astfel proiectate i instalate nct s respecte
reglementrile n vigoare cu privire la energia consumat, protecia
mediului, a sntii publice i sntii animalelor.
Corpurile de iluminat trebuie astfel amplasate nct s asigure iluminatul
adecvat specific activitii.
Uile i ferestrele trebuie confecionate din materiale netoxice, rezistente la
ageni fizici i chimici, impermeabile, neputrezibile i netede, nct s
permit igienizarea uoar i eficient a acestora, protecia termic,
protecia fonic, adecvate specificului activitii.
Acoperiul trebuie s fie construit din materiale rezistente i impermeabile.
Ventilaia se asigur n toate spaiile de lucru i administrative prin mijloace
adecvate, prin sisteme generale i/sau autonome de climatizare, cu
excepia spaiilor speciale n care se realizeaz activiti ce necesit
presiune negativ sau alte mijloace de biosecuritate.
Condiii privind utilitile
Condiiile privind utilitile trebuie s includ: aprovizionarea cu ap potabil
i utilitar, alimentarea cu energie electric, asigurarea condiiilor de
microclimat, gestionarea i neutralizarea deeurilor, sistemul de canalizare,
aprovizionarea cu gaze naturale, protecia mediului i condiii de
biosecuritate.
Laboratorul trebuie s se aprovizioneze numai cu ap potabil n cantiti
suficiente pentru necesitile pe flux i pentru procesul de igienizare. Apa
potabil trebuie s provin fie din reeaua de aprovizionare a municipiului
sau localitii, fie din surs proprie.
n cazul n care unitatea/instituia posed staie de clorinare proprie, se
prelev obligatoriu probe de ap din conducta de aducie a apei, ap
neclorinat i dup clorinare, pentru a se urmri eficiena operaiei de
clorinare a apei.
Apa potabil trebuie distribuit n toat reeaua sub presiune adecvat i
continu i n cantiti suficiente pentru acoperirea tuturor necesitilor de
funcionare a instituiei.
Trebuie s se asigure att ap rece, ct i ap cald. Apa cald este
furnizat dintr-o instalaie central pentru nclzirea i distribuirea apei
calde sau de la instalaii pariale.
Nu se admite utilizarea apei
nepotabile n procesul de
9
igienizare a spaiilor de lucru i a cilor de acces.

Conductele de ap trebuie s fie precis identificate. Trebuie s existe o
delimitare separat a fluxului de ap potabil fa de cel de ap nepotabil,
prin sistem separat de conducte.
n vederea prevenirii contaminrii spaiilor de lucru, conductele interioare
vor fi identificate vizibil prin culori diferite, i anume: conducte pentru apa
potabil - verde; conducte pentru apa nepotabil - negru; conducte de
canalizare - negru; conducte de nclzire - rou; conducte de gaze naturale
- galben.
Alimentarea cu energie electric trebuie s se realizeze din linia de joas
tensiune de 380/220 V i surs proprie, n caz de avarie. Pentru aparatura
cu risc de electrocutare trebuie asigurat centura de mpmntare, n
conformitate cu prevederile legale.
Instalaii pentru asigurarea parametrilor de microclimat n spaiile de lucru,
astfel: instalaii de captare i evacuare a unor factori nocivi din spaiile de
lucru; instalaii pentru meninerea parametrilor de temperatur n spaiile de
lucru sau n cele n care este amplasat aparatura de lucru, n special
aparatura de nalt precizie;
Grupurile sociale trebuie dimensionate n funcie de personalul care
activeaz n laboratoare, dotate cu instalaie de ap rece i cald, duuri i
vestiare.
Pentru managementul deeurilor rezultate din activitile ce au loc n cadrul
laboratoarelor sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene
trebuie s se respecte reglementrile n vigoare, precum i procedura
general intern privind gestionarea deeurilor. Avnd n vedere profilul de
activitate al laboratorului i amplasamentul acestuia, materialul patologic i
deeurile rezultate n urma activitilor din laborator trebuie denaturate i
inactivate prin mijloace adecvate, dup care acestea sunt preluate de o
unitate specializat.
Laboratorul trebuie s fie prevzut cu o reea de canalizare
corespunztoare, racordat la reeaua de canalizare a localitii/oraului
sau la un sistem propriu de evacuare.
Apele uzate provenite din laborator trebuie tratate pentru a se preveni
diseminarea oricrui factor de risc. De-a lungul prii externe a sistemului
de canalizare trebuie amplasate guri de vizitare, pentru curenia curent
sau pentru deblocare n caz de accidente. Acestea nu trebuie s constituie
un pericol de contaminare pentru spaiile de lucru sau pentru zonele
nvecinate.
Incinta de utilitate a instituiei trebuie s fie betonat sau asfaltat i
prevzut cu sistem de canalizare corespunztor.
Construcia i incintele trebuie s respecte condiiile de mediu.
10
LABORATOR NR. 3
Sterilizarea i dezinfecia
Sterilizarea presupune distrugerea microorganismelor indiferent de mijlocul
folosit, cu scopul prentmpinrii contaminrii personalului, dar i pentru a mpiedica
difuzarea acestora n mediu.
Sterilizarea se poate realiza prin ageni fizici i chimici.
Sterilizarea prin ageni fizici
Tipuri
sterilizare
Prin cldur
de
Felul
Exemplificare
Uscat
Flambare
nclzire la rou
Aer cald
Fierbere
Vapori de ap sub presiune (autoclavare)
Tindalizare (nclzire fracionat)
Pasteurizare
Utiliznd lmpi UV sau hote prevzute cu
lmpi UV
Chamberland
Berkefeld
Seitz
Etc.
Acid acetic 1%
Alcool etilic 70
Alcool medicinal
Apa oxigenat 1%
Bicromatul de potasiu 5%
Cloramina 5-10%
Tinctura de iod
Hidroxid de sodiu (soda caustic)
Detergeni diferii
Etc.
Umed
Prin radiaii
Prin filtrare
Prin ageni chimici
Ultraviolete
Gamma
Membrane
filtrante tip
Diferite
substane
Sterilizarea prin flambare este cea mai simpl i const n trecerea obiectului
sau a suprafeei de sterilizat prin flacr timp de cteva secunde (3 4 secunde) de
mai multe ori. Metoda se folosete n cazul extremitii efilate a pipetelor Pasteur,
gurii eprubetelor i flacoanelor sau altor recipiente.
11
Sterilizarea prin nclzire la rou este folosit n cazul anselor de nsmnare

i a spatulelor.
Sterilizarea prin aer cald se realizeaz n diferite cuptoare pe baz de curent
electric n care aerul este nclzit ntre anumite limite de temperatur etuve,
sterilizatoare Poupinel, etc. Etuva este o incint cilindric sau paralelipipedic cu
pereii dubli, din tabl termorezistent, prevzut cu rezistene electrice care menin
constant i uniformizat temperatura selectat print-un sistem de ventilaie.
Obiectele care urmeaz a fi sterilizate trebuie s fie uscate, nvelite n hrtie alb,
aceasta avnd i rolul de indicator al sterilizrii n sensul c aceasta este corect
cnd hrtia devine cafenie sub aciunea cldurii i aezate pe rafturi confecionate din
sit metalic. Timpul de sterilizare este diferit n funcie de temperatura utilizat i
anume: la 160C sunt necesare 2 ore, la 170C 1 or i la 180C 1/2ore. Prin
aceat metod se sterilizeaz sticlria de laborator cum ar fi pipetele gradate, plcile
Petri, mojarele, baloanele, etc, exceptnd materialele plastice, obiectele din cauciuc,
etc.
Sterilizarea prin cldur umed se poate realiza prin fierbere mai ales pentru
instrumentele metalice, fiind recomandat utilizarea apei distilate pentru a le proteja
de aciunea nociv a unor sruri coninute de apa de robinet, la care se adaug borax
sau carbonat de sodiu pentru a mpiedica ruginirea. Temperatura de 100C timp de
ore distruge toate formele vegetative i chiar unele forme sporulate microbiene.
Obiectele sterilizate n acest fel nu pot fi utilizate dect imediat dup fierbere.
Sterilizarea prin vapori de ap sub presiune (autoclavarea) se realizeaz cu
ajutorul unor echipamente speciale numite autoclave. Acestea se nchid ermetic i au
ca surs de alimentare curentul electric. Cu ajutorul autoclavelor se poate realiza o
atmosfer de vapori nclzii la 100 - 135C i o presiune de 1-2 atmosfere, tiut fiind
faptul c unei atmosfere i corespunde o temperatur de 120C. Presiunea din
interiorul autoclavului se realizeaz pe seama vaporilor de ap existeni, care se
elimin printr-o supap de siguran n caz de exces. Durata necesar sterilizrii prin
autoclavre este variabil n funcie de presiunea realizat i anume:
la 0,5 atmosfere (115C) 90 de minute;
la 1,0 atmosfere (121C) 30 de minute;
la 2,0 atmosfere (134C) 10 minute.
Prin autoclavare se sterilizeaz majoritatea mediilor de cultur, sticlria,
aparatele de sticl cu garnituri de cauciuc, materialele de protecie, toate materialele
infectate, etc. Recipientele care conin lichid pe lng dop, trebuie s fie legate la
gur i cu hrtie. Cele ale cror dop a fost aruncat n timpul autoclavrii nu se
consider autoclavate. Verificarea sterilizrii se realizeaz utiliznd hrtie indicatoare,
sau prin utilizarea unor substane solide la temperatura camerei care se lichefiaz la
temperatura de sterilizare (acidul oxalic la 101C, chinina la 116C, floarea de sulf la
120C, acidul benzoic la 121C i ureea la 132C.
n vederea sterilizrii materialele trebuie pregtite corespunztor. Ex. plcile
Petri i mojarele se mpacheteaz n hrtie de ambalaj, baloanele se astup cu
dopuri de vat, se nvelete gtul cu hrtie i apoi se leag cu sfoar; eprubetele se
astup cu dopuri de vat i tifon, se nvelesc n hrtie i se pun n couri de
12
srm, etc. Autoclavul este un cazan cu perei rezisteni, n care dup nchiderea
etan cu un capac masiv, fixat pe buloane (pentru a rezista presiunii create), vaporii
de ap se comprim la presiunea necesar sterilizrii.
Sterilizarea prin tindalizare (nclzire fracionat), se folosete cnd substanele
care urmeaz a fi sterilizate prezint un grad de termolabilitate, care const n
denaturarea lor la o temperatur de 120C. n aceast categorie intr mediile de
cultur care conin zaharuri sau substane proteice macromoleculare cum ar fi oul
(sterillizarea se realizeaz la 100C), serul coagulat, (la 70 - 80C), etc. Ea const n
nclzirea materialelor de sterilizat la temperatura impus de compoziia lor, timp de
30 60 de minute, la intervale se 24 de ore, de trei ori consecutiv. n prima zi de
nclzire se distrug formele vegetative ale bacteriilor. Sporii rezist dar dup 24 de
ore la 37C acetia se transform n forme vegetative care vor fi distruse prin
nclzire a doua zi. nclzirea din a treia zi se face pentru distrugerea ultimelor forme
vegetative, rezultate n urma germinrii sporilor.
Sterilizarea prin pasteurizare se folosete pentru lichide (lapte, bere, sucuri,
etc.), realiznd numai distrugerea formelor vegetative, nu i a celor sporulate. Ea se
poate realiza la urmtoarele temperaturi:
la 60 - 65C timp de 30 de minute;
la 70 - 75C timp de 10 20 de minute;
la 85 - 90C timp de cteva secunde urmat de o rcire brusc
(pasteurizare nalt).
Ultarapasteurizarea (uperizarea) const n injectarea de vapori supranclzii
(150C) n masa lichidelor destinate pasteurizrii.
Sterilizarea prin radiaii se poate realiza utiliznd razele ultraviolete i radiaiile
gamma. Razele ultraviolete care au o lungime de und cuprins ntre 2400 - 2800
se folosesc pentru sterilizarea boxelor sau ncperilor, numrul acestora fiind n
corelaie cu volumul ncperii de sterilizat. Aciunea lor bactericid se limiteaz la
distrugerea formelor bacteriene vegetative. Lmpile vu UV sunt nite tuburi de sticl
special, n care descrcrile electrice ntr-o atmosfer cu vapori de mercur la joas
presiune genereaz radiaii ultraviolete. Viaa de funcionare este de aproximativ 100
de ore.
Sterilizarea prin radiaii gamma se utilizeaz n special pentru vasele din
material plastic cum ar fi plcile Petri.
Sterilizarea prin filtrare se utilizeaz pentru sterilizarea lichidelor sau gazelor.
Filtrele pot fi de mai multe feluri cum ar fi: Chamberland (confecionate din porelan
ars), Berkefeld (fabricate din pmnt cu infuzori sau kiselgur) filtre Seitz (fabricate din
amestec de celuloz i azbest) filtre din sticl (sub forma unor plci montate n plnii)
i membranele filtrante (confecionate din colodiu, celuloz sau material plastic),
utilzate n special n virusologie. n ultimul timp se utilizeaz n special membranele
filtrante tip Milipore. Ele sunt racordate n special la pompe de vid sau la pompe de
presiune i au capaciti variabile.
Sterilizarea prin ageni chimici se realizeaz utiliznd substane care au un
efect nociv asupra microorganismelor. Ele pot avea un efect bacteriostatic, atunci
cnd se utilizeaz doze reduse sau bactericid cnd se utilizeaz doze
13
mari. Substanele chimice pot avea o aciune selectiv, bactericid pentru unii
germeni patogeni sau bacteriostatic pentru alii. Pe acest principiu se bazeaz
selectivitatea unor medii de cultur n care sunt nglobate unele substane (ex. verde
briliant).
Incinerarea presupune arderea cu reducerea materialului inial la stadiul de
cenu. Este indicat pentru deeurile biologice i materialele consumabile
confecionate din plastic
14
LABORATOR NR. 4
Mediile de culture folosite pentru izolarea diferitelor tipuri de
bacterii
Un mediu de cultur reprezint un substrat nutritiv complex, care trebuie s asigure
microorganismului ce urmeaz a fi cultivat, cantitatea necesara de ap, surse de carbon,
azot, substane minerale, factori de cretere, substane care s i furnizeze cantitatea de
energie ct i toate elementele folosite de celul n procese de cretere, reproducere i
ntreinerea funciilor vitale.
Mediile de cultur sunt utilizate n tehnici microbiologice de laborator, pentru
izolarea, cultivarea i ntreinerea culturilor pure i pentru controlul microbiologic al
produselor alimentare. Diversitatea mediilor de cultur este datorat si capacitaii de
adaptare a numeroase microorganisme ntlnite n habitaturile naturale ct i de faptul
c prin modificarea compoziiei mediilor de cultur se pot obine randamente superioare
n produi de metabolism microbian cu valoare economic.
Pentru a pune un diagnostic bacteriologic corect, sigur si prompt, folosirea unor medii
de cultivare corespunzatoare este de o importan hotrtoare. Cunoscndu-se
nsuirile germenilor cautai, condiiile lor optime de dezvoltare, bacteriologul trebuie
sa foloseasc mediile cele mai eficiente i indicate de izolare, n funcie de specia
microorganismului n cauz.
Mediul de cultur trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:

s asigure substratul nutritiv pentru creterea i multiplicarea microorganismelor;
sa aib un pH care s permit desfurarea normal a proceselor metabolice
microbiene (n general 7,27,4);
s asigure condiiile de aerobioz sau anaerobioz;
s aib o concentraie a substanei dizolvate n mediu care s nu influeneze
negativ schimburile osmotice ale
celulei;
15
- s nu conin substane toxice sau s genereze compui toxici n urma creterii

culturii microbiene;
- s fie steril astfel nct s nu dezvolte numai celule introduse prin inocul;
- sa fie pastrate in recipiente care sa impiedice contaminarea cu alte
microorganisme.
pH metru
Medii de cultur pstrate n baloane Erlenmeyer
n practica de laborator mediile de cultur se folosesc pentru izolarea din medii

naturale a diferitelor microorganisme pentru obinerea de culturi pure, pentru cultivarea
acestora n scopul obinerii de biomas sau pentru ntreinerea culturilor pure
selecionate.
n scop industrial mediile de cultur se folosesc pentru obinerea de celule sau a
compuilor rezultai prin activitatea microorganismelor selecionate.
Clasificarea mediilor de cultur
Mediile de cultur se pot mpri n dou categorii:
Medii uzuale (obinuite) - pe care se dezvolt majoritatea germenilor
patogeni. Ele pot fi: pentru bacterii aerobe; pentru bacterii anaerobe;
Medii speciale - destinate izolarii, cultivarii si cercetarii insusirilor biologice ale
anumitor specii de germeni. Ele mai pot fi sistematizate n medii: de izolare, de imbogatire,
selective, diferentiale:
mediile speciale de izolare - favorizeaza dezvoltarea anumitor germeni, care nu
se pot cultiva de la inceput pe mediile obisnuite, ei necesitnd anumite condiii
speciale sau anumii ,,factori de plecare";
medii de prembogire pentru resuscitarea germenilor distrui subletal, se
utilizeaz atunci cnd n probele prelevate din alimente, numrul de
microorganisme este in mod obinuit sczut, motiv pentru care, pentru sporirea
anselor de izolare, devine necesar utilizarea mediilor de prembogire, aa
cum este apa peptonat tamponat;
medii de mbogire (fortifiante) - aceste medii permit multiplicarea numrului
sczut de microorganisme (ex. Bacterii din genul Salmonella), care altfel ar putea
fi ucise de efectul relativ toxic al mediilor de mbogire, sau resusciteaz
microorganismele subletal distruse prin uscarea, congelarea sau nclzirea
probelor. Exemple de medii de
mbogire pot fi Mediul Rappaport16
Vassiliadis cu soia (bullion RVS) i bulionul Muller-Kauffmann

tetrationat/novobiocin (bullion MKTTn) care se inoculeaz cu cultura obinut n
urma inoculrii apei peptonate n cazul salmonelelor, mediul KaufmannMuller
(pentru enterobacteriaceae), mediul Chapman (pentru stafilococi patogeni), mediul
Sabouraud (pentru ciuperci), etc;
mediile selective favorizeaz prin compoziia lor chimica, dezvoltarea anumitor
germeni. Ele sunt medii lichide sau semisolide ce conin aditivi cu efect stimulator
pentru unii germeni bacterieni i inhibitor pentru alte bacterii. Unele au totui efect
toxic pentru anumite serovariante de microorganisme. Astfel selenitul este toxic
pentru S. choleraesuis i verde brilliant pentru S. dublin. Selectivitatea mediilor de
mbogire crete prin ridicarea temperaturii. Pentru a crete rata de izolare a
unor microorganisme pot fi utilizate, de asemenea, medii de mbogirea selective
pentru mobilitate i pasarea culturilor mixte n agar nutritiv 0,10,15%, ceea ce
face s creasc proporia unor microorganisme, comparativ cu alte bacterii.
Formula mediului, temperatura i durata de incubare, volumul probei nsmnate,
sunt factori ce cresc rata de izolare, iar aceste aspecte nu trebuie neglijate.
Exemple de medii selective pot fi: n cazul bacteriilor din genul Salmonella agar
xiloz-lizin-dezoxicolat (agar XLD); Rambach, MC Conkey sau Rou Fenol. Pe
astfel de medii, microorganismele formeaz colonii caracteristice, uor de
difereniat de coloniile altor bacterii, fiind totui posibile i excepii, care n cazul
salmonelelor de exemplu includ Proteus, Pseudomonas i Citrobacter.
mediile difereniale - sunt medii solide care ntr-o anumit msur permit cretere
difereniat a unor specii microbiene sau pun in evidena anumite particularitati
metabolice cu semnificaie diagnostic. Ele inhib dezvoltarea altor bacterii i
ofer cteva informaii asupra principalelor caracteristici biochimice permitnd in
acest fel identificarea lor (fenomene proteolitice, zaharolitice, oxidoreductoare etc.) n principal fermentarea lactozei i producia de H2S. Includerea in componena
acestor medii a unor substane indicatoare sau revelatoare este menit s fac
vizibil procesul respectiv. Rezultatele pot fi interpretate dup incubare la 37C,
timp de 24-48 ore.
Dup starea lor fizica mediile se pot impart in: solide, semisolide, lichide.
Dupa compozitie pot fi: medii simple si complexe. Exista si medii ,,sintetice"
bazate pe componente cunoscute din punctul de vedere al structurii lor chimice. In
comparatie cu bulionul, agarul sau alte medii ale caror componente nu sunt identificate
chimic in totalitate, mediile sintetice au avantajul ca permit anumite determinari capabile
sa ofere relatii asupra metabolismului bacterian (prin dozarea inainte si dupa cultivare a
diferitelor componente se poate cunoaste ce anume a fost consumat in cursul
multiplicarii si in ce cantitate).
Dintre cele mai frecvent folosite medii de cultura sunt :
Apa peptonata - este unul din cele mai simple medii de cultura, dar care are
largi utilizari, in special cnd i se adauga zaharuri, in vederea determinarii spectrului
zaharolitic al diferitelor specii de bacterii. Se prepara din: ap distilat 100,0 ml;
pepton 1,0 g; NaCl 0,5 g.
Se ajusteaza pH-ul la 7,27,4, se incalzete 15 minute la 115C pentru
17
precipitare, se filtreaza prin hrtie de filtru si se sterilizeaza din nou !a autoclav.
Ap peptonat
Cnd se adauga zaharurile, acestea se pun in proportie de 1% in balonane

separate, se adauga albastru de bromtimol (12 ml la 1 litru de mediu) ca indicator
si se sterilizeaza prin tindalizare 30 de minute, 3 zile consecutiv. Soluia de
albastru de bromtimol folosita in acest scop se prepara din: 1 g albastru de bromtimol
+ 25 ml NaOH n/10 + 475 ml apa distilata.
Bulionul de carne se prepara mai ales din came de bovine i cabaline, mai rar
din cea de pasare. Muschii se curaa de aponevroze, tendoane, fascii si grasime, se
taie bucati mici, sau se toaca la masina de tocat came. La 500 g tocatura, se adauga
1000 ml apa de robinet, se tine 24 de ore la rece, pentru macerare, apoi se fierbe 30
minute, se decanteaza i se stoarce, iar lichidul obtinut se filtreaza prin mai multe
straturi de tifon si se completeaza cu apa la volumul iniial. Se incalzeste la 8090C si se adauga peptona 10 g si NaCl 5 g la 1000 ml lichid.
Se ajusteaz pH-ul cu o soluie de NaOH n :1 (la 7,27,6) prin metoda colorimetrica.
Se nclzete la autoclav la 115C timp de 15 minute. nclzirea n prezena NaOH
produce o precipitare abundent, ceea ce impune o filtrare prin hrtie de filtru. Apoi
se face repartizarea n tuburi, n cantitate de cca 5 ml, n sticle sau baloane, care se
astup cu dopuri de vat i se sterilizeaz 30 minute la auitoclav la 115C.
Pentru repartizare se pot folosi pipete de 2550 ml, dar cel mai practic este s se
folosesca dispozitive speciale - plnii suspendate, prevazute cu un tub de cauciuc i
clem. n unele laboratoare exist dispozitive automatizate care asigur un debit
constant, reglabil (aa numitele turntoare de medii).
Bulionul astfel preparat are un aspect asemanator cu untdelemnul si trebuie sa
fie perfect limpede. Pastrarea lui se poate face vreme indelungata in vase bine
inchise, in incaperi reci si la adapost de lumina.
La ora actual, este din ce n ce mai raspindit folosirea extractelor de carne
care sunt livrate n stare deshidratat, purificat i standardizat, ceea ce asigur
obinerea unor medii de o calitate superioar (extractele Merck, Oxoid etc.).
18
Agarul nutritiv (geloza) este un mediu solid obinut prin adugarea la bulionul
de carne a agarului (fibre sau pulvis). Acesta nu are nici un rol nutritiv, dar determin
solidificarea mediului.
La 1 litru de bulion, se calculeaz 30 g agar fibre sau 25 g agar pulvis, care se
topete apoi prin nclzire la 115C, timp de 15 minute la autoclav. Se filtreaz prin vat,
n autoclavul cu capacul deschis (pentru a evita solidificarea pe parcursul filtrrii).
Se repartizeaz n eprubete sau alte recipiente unde urmeaz a fi pstrat. Se
astup cu dopuri de vat, se sterilizeaz 20 de minute la 120C dup care
eprubetele se pun n pziie inclinat pentru solidificare.
Pstrarea se poate face n flacoane nchise etan pentru a evita pierderea apei,
dar n general este bine s nu se prepare arje prea mari pentru a dispune de mediu
ct mai proaspt.
Curaba de cretere a culturilor microbiene
Prin inocularea de celule, aparinnd unei culturi pure, ntr-un mediu nutritiv steril
se poate stabili dinamica de cretere prin studiul vitezei de acumulare a biomasei sau
prin creterea numrului de celule raportat la unitatea de volum a mediului.
n condiiile experimentale, dinamica multiplicrii microorganismelor este bine
cunoscut. Procesul evolueaz ntr-o serie de faze succesive.
12-faza de repaos (faza lag);

1a-perioada de adaptare;
a2-perioada de refacere;
23-faza exponenial; 34-faza staionar;
3b- perioada de spor de cretere negativ;
b4-perioada de staionare propriu-zis;
5-faza final de declin.
Faza de laten, de cretere zero sau de lag reprezint etapa de timp cnd dup
inoculare numrul celulelor rmne neschimbat, sau chiar scade, noile condiii de mediu
implic latena induciei acelor enzime necesare pentru adaptarea la mediul nutritiv. Faza
de laten apare deci ca o perioad de adaptare la condiiile noi de cultur, n care
microorganismele viabile din inocul i acumuleaz n celul metabolii i sistemele
necesare creterii, n cazul n care aceste componente biochimice le lipseau datorit
condiiilor de mediu anterioare inoculrii. n cazul drojdiilor aceast faz poate dura 1-2
ore,durat ce depinde de compoziia mediului i capacitatea de reglare a metabolismului
propriu. Faza lag se poate prelungi mult dac inoculul este obinut din culturi vechi sau
care s-au pstrat n condiii de refrigerare. n schimb dac la inoculare s-a folosit o
cultur viguroas, aflat n faza activ de cretere, n mediul cu o compoziie
19
similar, faza lag este scurt sau poate s fie absent.

Faza de multiplicare exponenial sau de cretere logaritmic este
caracterizat prin aceea c, dup o scurt perioad (cca. 2 ore) de accelerare a ritmului
de cretere, n care multiplicarea se produce cu o vitez progresiv mrit, acest ritm
devine constant i caracteristic n anumite condiii de cultur, durata unei generaii fiind
minim. Perioada de echilibru poate fi meninut numai att ct nu intervin alterri
importante, pe care creterea le poate provoca n compoziia mediului. De exemplu,
numrul de celule de drojdie sau de bacterii i cantitatea de materie vie format crete
temporar dup o progresie geometric cu raia 2. Celulele aflate n faza exponenial de
multiplicare sunt cele mai potrivite pentru cercetri de genetic i fiziologie.
Faza staionar (de maturare) n care numrul celulelor viabile este maxim i
rmne constant o perioad de timp. De exemplu, celulele de drojdie nu mai
nmuguresc, i mresc volumul i tind spre forma sferic, se rotunjesc. Celulele de
microorganisme au n aceast faz caracteristicile morfologice cele mai tipice genului i
speciei. Aceast faz poate fi prelungit atunci cnd urmrim pstrarea culturii pure, prin
modificarea unor factori care scad viteza de metabolism celular.
Faza de declin se caracterizeaz printr-o scdere n progresie geometric n
raport cu timpul a numrului de celule vii. Pe msur ce mediul devine mai puin
favorabil, celulele vii nu se mai multiplic, dei activitatea lor mai continu un timp dup
care mor i intr n autoliz. La sfritul acestei ultime faze se nregistreaz maximum
absolut al numrului total de celule formate pe parcursul ntregii evoluii a culturii.
20
LABORATOR NR. 5
Tehnica nsmnrii i a transplantrilor
Examenul bacteriologic presupune izolarea, cultivarea si identificarea
germenilor bacterieni din diferite alimente suspecte de contaminare. Fata de
examenul microscopic, care permite decelarea prezentei agentului etiologic,
metodele bacteriologice complexe permit, pe lnga izolare si cercetarea diferitelor
insusiri biologice care-l caracterizeaza. Faptul are o deosebita importanta si din
punct de vedere epidemiologic, prin aceste examene evitindu-se, de exemplu darea
in consum a unor produse alimentare care pot provoca la om infectii sau toxiinfectii,
uneori cu evolutie grava. Este suficient sa se aminteasca pericolul pe care-l prezinta,
mai ales carnea animalelor sacrificate de necesitate, la care intreruperea procesului
patologic, prin sacrificare, face ca modificarile organoleptice si organice sa nu
trezeasca suspiciune la examinare. Un examen bacteriologic insa poate pune in
evidenta agentii unei salmoneloze, leptospirozei, antraxului etc., toate transmisibile la
om. Examenul bacteriologic da adesea si indicii referitoare la sursa de infectie si
permite deci, eliminarea ei.
Tehnica nsamnarii - ca tehnici de nsamnare pot fi aplicate mai multe
procedee:
Pentru aceasta, trebuie parcurse urmtoarele etape.
Se ordoneaz pe masa de lucru echipamentele necesare;
Operatorul se aeaz comod pe scaun cu antebraele sprijinite complet
de blatul mesei de lucru;
Se ia ansa de nsmnare n mna dreapt (ca pe un creion);
Cu mna stng se ia recipientul din care se preleveaz sau se
introduce materialul manipulat, ct mai aproape de extremitatea
inferioar, n aa fel nct operatorul s aib vizibilitate optim asupra
coninutului;
Se scoate dopul recipientului, cuprinzndu-l ntre degetul mic, inelar i
palma minii drepte;
Se sterilizeaz prin flambare gura recipientului, trecndu-l de mai multe
ori (3-5 ori) prin flacra generat de becul Bunzen;
Se introduce ansa n eprubet pentru prelevarea sau depunerea
materialului microbian, evitndu-se atingerea cu ansa a pereilor
recipientului;
Dup retragerea ansei, se flambeaz gura recipientului i se introduce
dopul sau se nurubeaz capacul;
Se resterilizeaz ansa.
21
Cu ajutorul acului de nsmnare drept - se cauterizeaz suprafaa

produsului alimentar i se sterilizeaz acul prin nclzire la rou (tija se trece i ea de
3 ori prin flacar), iar dup rcire se neap prin suprafaa cauterizat, facnd cteva
micri spre interior. Se scoate acul i se face nsamnarea prin cltirea acestuia
n mediul lichid.
Fr a se flamba, acul se introduce apoi n tubul cu mediul solid, facndu-se
pe suprafaa acestuia micri n zig-zag, ncepnd de la baza mediului spre partea
superioar, sau se cltete acul n lichidul de condensare, dup care se umecteaz
ntreaga suprafa a mediului cu acest lichid, prin nclinri repetate. Dup fiecare
prob, acul se sterilizeaz prin nroire la flacar.
Cu pipeta Pasteur - se cauterizeaza suprafafa probei cu o spatula incalzita,
se extrage cu ajutorul unei pipete Pasteur, flambata si ea si racita, o cantitate de
lichid organic din profunzime si se insaminteaza nti pe mediul lichid (bulion), iar apoi
pe mediul solid (agar inclinat, agar cu snge, agar ou ser etc.). La inchiderea si
deschiderea tuburilor se iau toate masurile de asigurare a sterilitatii, flambnd gura
lor imediat dupa deschidere si inainte de inchidere.
Cu poriuni de aliment - cnd alimentul a fost recoltat in conditii de
sterilitate, se poate recurge la secionarea unor bucai cu ajutorul unor instrumente
sterile, iar cu una din suprafeele sectiunii se disperseaza materialul patologic pe
suprafaa unei placi cu mediu. In unele laboratoare aceasta tehnica este folosita
aproape in exclusivitate.
Prin introducerea direct, in mediu a portiunilor de aliment - metoda se
foloseste mai rar, in special cnd se banuieste saracia in germeni a materialului
patologic. Recoltarea si manipularea acestuia trebuie sa se faca in conditii de
sterilitate perfecte. Ca principiu general, se va evita deschiderea probelor alimentare
sau secionarea tesuturilor inainte de recoltarea materialului pentru examenul
bacteriologic.
Tehnica transplantarilor. Are ca scop fie izolarea din culturile mixte a diferitilor
germeni in stare pura, fie meninerea lor in timp, in conditii de laborator (tulpini de
colectie).
Din culturile pe medii lichide, transplantarea se face cu pipeta Pasteur sau cu
ansa de insamintare. In primul caz, se recolteaza o cantitate arbitrara (cteva
22
picaturi) din cultura veche, care apoi se insamnteaza in mediul proaspat. In cel
de al doilea, se introduce ansa flambata si racita in cultura veche, dupa care se
face insamntarea pe mediile proaspete (inti in mediul lichid si apoi in mediul
solid, daca este cazul).
Din culturile pe medii solide, transplantarea se face cu ansa, raclnd o
cantitate foarte redusa de cultura, care apoi se depune pe mediile proaspete.
In timpul insamntarilor de orice natura, este necesar sa se aiba in vedere
cteva reguli general valabile:
nsmnrile se execut n boxe sterile sau n hote speciale care
permit sterilizarea periodic i nu permit formarea de cureni de
aer n timpul lucrului;
n timpul operaiunilor de nsmnare se evit pe ct posibil
conversaia i orice micare de prisos n jurul operatorului;
ansa cu care se execut nsmnarea nu trebuie s fie atins de
nici un obiect nesteril (mn, halat, mas de lucru, etc.);
nsmnrile se vor executa ct mai repede, cu scopul de a
reduce la minim contactul materialului de nsmnat cu atmosfera
ambiant;
n timpul ct recipientele sau tuburile de cultur, sterile sau
nsmnate sunt deschise, vor fi inute n poziie nclinat ct mai
aproape de flacr pentru a evita contaminarea cu germeni sau
spori din atmosfer;
imediat dup nsmnare se face notarea tuburilor cu creioane
speciale fr a se omite data nsmnrii.
23
LABORATOR NR. 6
Examenul caracterelor culturale
Dezvoltarea germenilor bacterieni pe mediile de cultur ia aspecte diferite n
funcie de specia n cauz, mediul folosit i uneori condiiile de cultivare. Pentru unele
specii, o serie de caractere culturale reprezint particulariti deosebit de preioase
pentru identificarea lor.
n mediile lichide, n aprecierea dezvoltrii bacteriilor se au n vedere turbiditatea,
depozitul i formaiunile de suprafa.
Turbiditatea - poate fi pronunat, discret sau poate s lipseasc.
Depozitul - ia natere prin depunerea la fundul tubului a germenilor care

s-au dezvoltat n mediu. El poate fi discret sau abundent, granular, vscos
sau pulverulent, omogenizabil sau neomogenizabil prin agitare, aderent sau nu
la fundul tubului.
24
Depozit neomogenizabil
Suprafaa - mediului poate oferi aspectul unei membrane de grosimi variabile,

rugoas, granular, ncreit sau neted, sau al unui inel de grosimi
variabile la suprafaa lichidului.
Culoarea - mediului poate oferi aspectul
Pe mediile solide, germenii constituie, prin multiplicare, aglomerri cunoscute sub

numele de colonii, vizibile cu ochiul liber sau cu lupa. n aprecierea lor, se au n
vedere: dimensiunile, forma n ansamblu, profilul, suprafaa, marginile, culoarea,
opacitatea, consistena, emulsionabilitatea.
Sub aspectul dimensiunii, coloniile pot fi de talie variabil, pna la civa milimetrii
diametru.
Forma poate fi circular, ovalar, radiat sau neregulat;
Profilul (n seciune prezumtiva) poate avea un aspect plat, convex,
concav, ombilicat, mamelonat sau papiliform;
Suprafaa poate fi neted, aspr, granular, lucioas sau mat;
Marginile pot fi uniforme, neregulate sau cu prelungiri;
Culoarea coloniilor este diferit n funcie de prezena i natura
pigmentului pe care eventual l conin (alb, galben, verde, rou, portocaliu
etc.);
Sub raportul opacitii, coloniile pot fi translucide sau opace, ntre ele
existnd grade intermediare;
25
Consistena este i ea variabil: untoas, vscoas, uleioas,

grunjoas, friabil, filant, ea determinnd cel mai adesea i gradul de
aderen la suprafaa mediului. n timp ce coloniile de consisten
untoas i granular se desprind cu uurin, cele vsooase ader,
determinnd o dificultate n desprinderea lor;
Emulsionabilitatea poate fi uoar sau dificil i face ca suspensiile care
se practic s fie omogene sau neuniforme.
Cteva exemple n acest sens, pot fi edificatoare.

n medii lichide:
mediul poate fi tulbure omogen (salmonele, stafilococi);
mediul poate fi tulbure cu un inel pe perete la limita superioar a
mediului (E. coli);
mediul poate fi clar, ns la fund prezint un depozit grunjos
sau nisipos (streptococi);
mediul poate fi clar, cu un depozit floconos i aderent la fundul tubului
(bacilul antraxului);
mediul prezint un voal subire la suprafa (vibrionul holeric);
mediul prezint o membran uscat la suprafa (Bacillus subtilis);
mediul prezint o membran groas, rugoas, plisat la suprafaa,
restul lichidului ramnnd limpede (M. tuberculosis); mediul este colorat
n verde-albastrui (B.piocianic).
Pe medii solide:
E. coli d colonii rotunde cu margini i suprafee netede de
35 mm diametru, de culoare alb-laptoas, lucioase;
Pasteurella d, de regul, colonii mici, abia vizibile, transparente,
uneori uor albstrui, aderente la mediu;
Bacilul antraxului formeaz colonii cu suprafaa aspr i cu margini
avnd prelungiri laterale, efilate, care privite cu lupa, au aspectul unor
ondulaii ale firelor de pr;
stafilococii dau colonii rotunde, bombate, cu margini i suprafee
netede,
unele
din
ele
pigmentate n alb, auriu sau
26
citrin;
streptococii dau colonii mici bombate;
Bacilul tuberculozei umane produce colonii rugoase, uscate, cu margini
neregulate.
Bacteriile anaerobe ofer i ele aspecte variabile n funcie de mediul folosit n
cultivarea lor.
n cazul mediilor lichide, n general, se produce o tulburare uniform cu
sau far producie de gaze, vizibile sub forma unor bule fie n intimitatea
lui, fie la suprafa.
n cazul mediilor semisolide (geloza Veillon) se pot forma doua tipuri de
colonii, n funcie de difuzibilitatea germenilor in mediu, nsuire legat
de prezena mobilitii . Bacteriile mobile ( Cl. tetani ) produc colonii
pufoase de aspect sferoid , n timp ce cele imobile ( Cl. perfringens )
produc colonii de aspect lenticular , de talie variabil.
LABORATOR NR. 7
Examinarea caracterelor metabolice (biochimice) ale germenilor bacterieni
27
Reacii de punere n eviden a capacitii zaharolitice

Au o importan deosebit pentru confirmarea datelor furnizate n urma
examinrilor morfo culturale. Ele se bazeaz pe anumite particulariti metabolice ale
bacteriilor care sunt variabile n funcie de specia microbian sau chiar de tulpin i au la
baz existena unui echipament enzimatic diferit care le confer capacitatea de a aciona
asupra unor substane coninute n mediu sau de a elabora n cursul multiplicrii lor
anumite substane noi identificabile prin diverse reacii chimice.
A. Reacii de punere n eviden a capacitii zaharolitice
Medii de cultur lichide

Fermentarea zaharurilor se datoreaz elaborrii de ctre germeni a unor enzime
capabile s scindeze glucidele cu formare de aldehide, acizi i gaze (dioxid de carbon,
hidrogen, metan). Ea se determin prin folosirea unor medii de cultur lichide sau solide
la care se adaug diferite zaharuri i un indicator care s releve transformrile
biochimice care survin deobicei consecutive modificrii pH-lui mediului.
Substanele hidrocarbonate care se folosesc cel mai frecvent n acest scop sunt:
1. dizaharide maltoza, lactoza, zaharoza sau sucroza;
2. trizaharide rafinoza;
3. pentoze arabinoza, xiloza, ramnoza;
4. hexoze glucoza, fructoza, manoza, galactoza;
5. polizaharide inulina, amidonul, glicogenul;
6. glicozide salicina, esculina;
7. polialcoli ;
8. alcooli trivaleni (glicerina); tetravaleni (aritrina); pentavaleni
(adonita); hexavaleni (manita, dulcita, sorbita, inozita).
Dintre mediile de cultur lichide cel mai frecvent se utilizeaz apa peptonat n
care se dizolv n proporie de 1% substana hidrocarbonat ce urmeaz a se identifica
i o soluie indicatoare (albastru de bromtimol, tinctur de turnesol, rou neutru). Mediul
se repartizeaz de preferin n tuburi de reacie tip Wasermann.
n mediul zaharat, nsmnarea tulpinii bacteriene de cercetat se soldeaz
28
cu virarea culorii mediului n caz c s-a produs fermentarea sau cu pstrarea culorii
iniiale dac aceasta nu s-a produs. Modificarea culorii mediului are loc n timpul
incubaiei la 37C dup o perioad variabil n funcie de rapiditatea cu care fenomenele
fermentative au loc. La unele specii aceasta se produce dup cteva ore n timp ce la
altele este nevoie de o incubaie mai ndelungat de cteva zile sau chiar sptmni.
Foto nr. Glucoza, Salicina, Trehaloza

(nainte de nsmnare)
Foto nr. Arabinoza, Xiloza, Rafinoza, Manita

(nefermentate)
29
Foto nr. Glucoz, Salicin, Trehaloz

(fermentate)
Foto nr. Zaharuri fermentate i nefermentate
Foto nr. Zaharuri fermentate i nefermentate

(2 lizin +, 4 gllucoz +, 5 lactoz -)
Medii de cultur solide

Testul utilizat este TSI (triple sugar iron). El permite evidenierea capacitii
fermentative a bacteriilor i punerea n eviden a hidrogenului sulfurat (H2S) n urma
scindrii proteinelor (eliminarea gruprilor sulhidrice di aminoacizii sulfurai ca cisteina i
metionina).
Mediile solide folosite pentru a evidenia capacitatea fermentativ a bacteriilor au
nglobate n ele zaharul respectiv (glucoza, lactoza, zaharoza) i un indicator care relev
prin virarea culorii prezena procesului de fermentare. Mediul se toarn n tuburi de
dimensiuni mici (tip Wasemann), astfel nct s aib o poriune dreapt (inferioar) i
oblic (superioar)
Testul se utilizeaz pentru identificarea unor genuri sau specii bacteriene (ex.
Enterobacteriaceae, Pseudomonas, etc.).
Materialele necesare realizrii testului sunt: cultura de testat, o ans
bacteriologic, o eprubet cu mediu TSI steril i un bec Bunsen.
Tehnica de lucru presupune parcurgerea urmtoarelor etape: se sterilizeaz ansa
de nsmnare cu ajutorul flcrii generat de becul Bunsen i se rcete n aer; se ia
placa Petri cu cultura de testat, se preleveaz un fragment dintr-o colonie izolat
suspect, dup care se las placa pe mas acoperit cu capacul; se ia tubul cu mediul
TSI, se scoate dopul de vat i se flambeaz gura eprubetei; se introduce ansa ac n
tub, se neap poriunea dreapt a mediului, apoi se disperseaz cultura prin micri n
zig zag de jos n sus, pe toat suprafaa nclinat a acestuia; se flambeaz din nou
gura tubului, se acoper cu dopul de vat i se aeaz n stativ; se sterilizeaz ansa de
nsmnare i se depune pe masa de lucru n suport; mediul TSI nsmnat se
introduce n termostat la o temperatur de 37C pentru o perioad de 24 de ore.
Interpretarea se face dup cum urmeaz::
Partea dreapt
galben - glucoz pozitiv (fermenteaz glucoza);
rou sau neschimbat - glucoz negativ (nu fermenteaz glucoza);
negru - formare de hidrogen sulfurat
(H2S);
30
bule de gaz sau spargerea agarului - formare de gaz din glucoz. (Foto nr...)
Partea nclinat
galben - lactoz i/sau zaharoz pozitiv (unul sau ambele
zaharuri sunt folosite);
rou sau neschimbat - lactoz i zaharoz negativ (nici un zahar nu este
folosit.
TSI nainte de nsmnare
TSI dup nsmnare i incubare
Formare de gaz din glucoz
nglbenirea mediului de cultur se datoreaz virrii indicatorului de pH (rou

fenol) ca urmare a acidifierii datorate fermentrii zaharurilor.
LABORATOR NR. 8
Reacii de punere n eviden a a existenei fermenilor activi fa de
substanele proteice i aminoacizi i existena unor produi rezultai din
dezintegrarea substanelor proteice
Testul de hemoliz se folosete pentru a determina capacitatea de a hemoliza
globulele roii aparinnd unor specii variate (cal, oaie, bovine, cobai, iepure, om).
31
nsuirea este prezent numai la anumite specii bacteriene i este de cele mai multe ori
legat de patogenitatea acestora. Capacitatea hemolizant este prezent n diferite
grade la unele tulpini de E. coli, streptococci, stafilococi, listerii, Cl. perfringens, etc.
Hemoliza poate fi de tip alfa care se caracterizeaz prin producerea n dreptul i
n jurul coloniei a unei decolorri mai mult sau mai pui ntinse nsoit de o nverzire a
mediului (datorit modificrilor chimice de oxidare ale hemoglobinei effect viridans) i
beta care se caracterizeaz numai prin decolorarea mediului din dreptul i din jurul
coloniei i denot o liz total a globulelor roii di zona respectiv.
Tulpinile care pe medii cu snge nu au nici un fel de aciune asupra globulelor
roii se numesc anhemolitice sau de tip gamma i caracterizeaz de regul germenii
lipsii de patogenitate att n condiii experimentale ct i naturale.
Pentru stabilirea capacitii hemolitice, nsmnarea se face la suprafa n plci
Petri pe mediu ce conine snge defibrinat de diferite specii n proprie de 5%. Citirea se
face dup o incubaie de 24 ore la 37C. Testul de hemoliz se poate efectua i n mediu
lichid, dar este mai puin utilizat.
Testul indolului indolul rezult din dezintegrarea triptofanului. Pentru punerea
lui n eviden se prefer culturile bacteriene n ap peptonat fr zaharuri, care ofer
rezultatele cele mai fidele. Se folosesc n acest scop diferii reactivi sau hrtii impregnate
cu indicatori.
Cel mai frecvent se folosete reactivul Erlich Kovacs, care se adaug cu ajutorul
unei pipete la o cantitate de 1 2 ml cultur proaspt de 24 de ore n ap peptonat,
att ct s formeze un strat de 1-2 mm la suprafaa mediului. Colorarea stratului de
reactiv n rou nchis (din galben deschis) este indiciul unei probe pozitive.
Foto nr.
Indol pozitiv ( + )
Foto nr.
Indol negativ ( - )
n cazul folosirii hrtiei impregnate, aceasta se pregtete astfel: se taie benzi de

hrtie de filtru lungi de cca 5 cm i late de 5 .-7 mm; se mbib cu reactiv Kovacs
proaspt preparat: se usuc i se pstreaz n sticle brune la un loc ntunecat. Bentile se
fixeaz cu ajutorul dopului la tuburile nsmnate cu tulpina de cercetat n mediu de ap
peptonat. n cazul unei reacii pozitive, banda se coloreaz rou sau roz. Dac reacia
este negativ se execut i reacia dup tehnica anterioar. Reacii pozitive dau
colibacilii, pasteurelele, bacteriiile din genul Proteus, etc, iar negative dau bacteriile din
genurile Salmonella, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, Serratia, etc.
Testul de evideniere a H2S permite stabilirea capacitii unor bacterii de a
dezintegra aminoacizii care conin sulf (cistina, cisteina, etc.) sub aciunea
32
unor enzime specifice.

n acest scop se pot folosi medii care conin acetat de plumb sau benzi
impregnate cu aceai substan.
n primul caz, pe medii solide cu acetat de plumb (tuburi sau plci Petri) se
procedeaz la nsmnarea bacteriilor de cercetat, dup care are loc incubarea la
37C. dac se produce H2S, mediul se negrete n jurul coloniilor H2S pozitive din
cauza sulfurii de plumb care rezult.
n cele de al doi-lea caz, benzi de hrtie de filtru de 6-8 cm lungime i 8 10
mm lime, se mbib cu soluie de 10% acetat de plumb, dup care se usuc. Se
introduc n tuburi sau flacoane i se sterilizeaz la autoclav. Benzile astfel pregtite
se introduc cu mediul de cultur, pn la nlimea de aproximatim 1 cm deasupra
mediului de cultur. n cursul incubaiei dac germenul produce H2S, banda se
negrete n poriunea inferioar, pe o lungime mai mare sau mai mic, n funcie de
cantitatea de gaz degajat, ntr-uu timp variabil de la cteva ore la cteva zile.
Germenii aparinnd genurilor Salmonella, Pasteurella, Citobacter, produc
H2S, n timp ce alii cum ar fi Escherichia, Schigella, Enterobacter, Klebsiella,
Staphylococcus, etc. nu produc H2S.
Testul MIU (mobilitate-indol-uree)

Este un test care permite studierea mobilitii bacteriilor i a capacitii
acestora de a produce indol i ureaz (enzim care degradeaz ureea). Este utilizat
n scopul identificrii unor genuri sau specii bacteriene (ex. Enterobacteriaceae,
Pseudomonas, etc.).
Materialele necesare efecturii testului sunt: cultura de testat, o ans
bacteriologic, un tub de hemoliz cu mdiu MIU steril, bec Bunsen.
Pentru realizarea testului trebuie parcurse urmtoarele etape: se ia ansa ac
i se sterilizeaz prin nclzire pn la incandescen n flacra becului Bunsen, dup
care se rcete n aer; se ia n mna stng placa Petri cu cultura de testat i se
preleveaz o colonie izolat, suspect, dup care se depune pe masa de lucru
nchis.; se ia tubul cu mediu MIU, se scoate dopul de vat i se flambeaz gtul
tubului; se introduce ansa n tub i se neap mediul vertical, pn n profunzime,
dup care se flambeaz din nou gura tubului;.se introduce n tub o band pentru
indol, care se fixeaz cu ajutorul dopului de vat (banda se plaseaz cu poriunea
33
impregnat cu reactiv n jos, fr a atinge suprafaa mediului); se pune tubul n stativ;

se sterilizeaz ansa de nsmnare i se las pe masa de lucru; mediul MIU
nsmnat se introduce n termostat la o temperatur de 37C pentru o perioad de
24 de ore.
Dac bacteria este imobil se dezvolt numai n lungul liniei de nsmnare,
mediul din jur rmnnd transparent, iar dac bacteria este mobil se extinde n
mediu, tulburndu-l. Dac bacteria este productoare de ureaz, enzima acioneaz
asupra ureei din mediu i acesta se nroete. Dac bacteria produce indol,
extremitatea inferioar a benzii se coloreaz n rou.
Testul mobilitii
Alte teste
Testul de gelatinoliz;
Testul de lichefiere al serului coagulat;
Testul cultivrii bacteriilor n lapte;
Testul de hidroliz al cazeinei;
Testul de hidroliz al ureei.
LABORATOR NR. 9
Reacii de punere n eviden a fermenilor oxidoreductori
Testul catalazei se folosete pentru punerea n eviden a existenei catalazei
n culturi pe medii lichide sau solide. Principiul testului const n evidenierea catalazei de
origine bacterian, enzim care elibereaz O2 din peroxidul de hidrogen. Testul se
folosete pentru diferenierea germenilor catalaz pozitivi (ex. Staphylococcus) de cei
catalaz negativi (ex. Streptococcus).
34
Materialele necesare efecturii testului sunt: cultura de testat, o ans cu bucl, un

flacon de ap oxigenat (peroxid de hidrogen 20%), o lam de microscop steril i un
bec Bunsen.
Pentru realizarea testului trebuie parcurse urmtoarele etape: se aeaz lama pe
masa de lucru; se sterilizeaz ansa la flacra becului Bunsen, prin nclzire pn la
incandescen; se rcete cteva secunde ansa n aer; se scoate dopul flaconului de
ap oxigenat i se flambeaz gtul acestuia; se introduce ansa n flacon i se ncarc;
se pun 1 -2 picturi n centrul lamei; se flambeaz din nou gura flaconului, se acoper cu
dopul i se las pe mas; se sterilizeaz din nou ansa; se rcete n aer; se ia n mna
stng placa cu cultura de testat, deschis; se preleveaz cu ansa un fragment dintr-o
colonie suspect i se descarc pe lam, n imediata apropiere a picturii de ap
oxigenat; se amestec circular cu ansa cteva secunde.
Dac enzima a fost sintetizat de bacterie, se observ apariia efervescenei
lichidului (bule de gaz).
n funcie de tipul culturilor (solide sau lichide), se procedeaz diferit. Astfel n
cazul culturilor pe medii solide se pune o pictur de ap oxigenat pe lama de
microscop i se adaug cu o ans bacteriologic, o cantitate de cultur. Reacia pozitiv
este dat de apariia unor bule de gaz (oxigen), care se degaj cu o intensitate variabil,
n funcie de cantitatea de catalaz existent n cultur.
Foto. nr. Testul catalazei reacie pozitiv
n cazul culturilor pe medii lichide, se amestec 5 ml de cultur n bulion triptic de

24 de ore cu 3 ml de ap oxigenat. Reacia pozitiv este dat de producerea unei
efervescene cu degajare de bule de oxigen care dureaz 1-2 minute. Reacia devine
mai evident dac naintea soluiei de ap oxigenat se adaug la cultur o cantitate
egal dintr-o soluie de 10% spun.
Pentru evitarea contaminrii operatorilor trebuie respectate cteva cerine: lama
trebuie s fie aezat pe o bucat de hrtie de filtru, mbibat cu un dezinfectant; lama
trebuie s fie stabilizat cu policele i indecxul minii stngi pe toat durata efecturii
testului; cantitatea de ap oxigenat de pe lam s nu fie prea mare pentru a nu curge
pe marginile acesteia, cultura s nu fie prelevat de pe medii cu snge pentru c
hematiile conin catalaz i n aceste condiii se obin reacii fals negative, este util
folosirea unor martori pozitivi i negativi.
Testul oxidazei permite identificarea unor genuri sau specii bacteriene (ex.
Pseudomonas, Vibrio, Enterobacteriaceae, etc.). Principiul reaciei const n faptul c
producerea de enzim oxidativ de ctre unele tipuri de bacterii, este evideniat
35
prin apariia unor compui colorai rezultai n urma transformrii unor amine aromatice.
Materialele necesare efecturii reaciei sunt: cultura de testat, o lam de
microscop steril, benzi pentru oxidz, un flacon de ser fiziologic steril, o pipet Pasteur
steril, o ans de nsmnare cu fir de platin (firele metalice care conin fier pot da
reacii fals pozitive), bec Bunsen.
Benzile pentru oxidaz sunt impregnate cu reactiv Kovacs 1% (dimetil-parafenilendiamin hidrocloric). Ele sunt livrate mai multe buci n cutii sau nvelite n hrtie
neagr pentru a fi protejate de razele de lumin. Pstrarea lor se realizeaz la frigider,
ferite de razele solare n vederea prevenirii oxidrii spontane. Hrtia de filtru
recomandat a fi utilizat este cea de tip Whatman nr.1.
Tehnica de lucru presupune parcurgerea mai multor etape: lama de microscop se
aeaz pe masa de lucru; banda pentru oxidaz se aplic pe centrul lamei; se scoate o
pipet steril din ambalaj i se flambeaz; se deschide flaconul cu ser fiziologic steril i
se flambeaz gura acestuia; se introduce pipeta n flaconul cu ser fiziologic i se ncarc
o mic cantitate; se umecteaz banda cu ser fiziologic steril; se sterilizeaz ansa de
nsmnare cu bucl de fir de platin; se rcete ansa cteva secunde n aer n
apropierea flcrii genrate de becul Bunsen, se preleveaz cu ajutorul ansei de
nsmnare un fragment dintr-o colonie suspect care se descarc apoi pe zona
central a benzii (ca la executarea unui frotiu).
Dac bacteria produce enzima, n aproximativ 20 30 secunde zona din band
pe care a fost depus cultura de cercetat se coloreaz n violet. Dac reacia este
negativ, banda i pstreaz culoarea iniial.
n absena benzilor pentru oxidaz se poate pune reactiv Kovacs direct pe colonia
suspect sau pe toat suprafaa culturii de testat, care devine violet n cazul unei reacii
pozitive. De asemenea se poate folosi o bucat de hrtie de filtru mbibat la una din
extremiti cu reactiv Kovacs care se depune pe suprafaa unor colonii dup ce n
prealabil se efectueaz nite micri de amestecare. Producerea de oxidaz este
evideniat ca i n tehnicile descrise mai sus prin colorarea n violet a poriunii
impregante cu reactiv Kovacs.
Testul oxidazei reacie pozitiv

Colonii de Enterobacteriaceae
Testul oxidazei reacie negativ
Agar cu uree
Se nsmneaz panta agarului n striuri. Se incubeaz la 35o sau 37oC (conform
acordului) timp de 24 h i se examineaz din cnd n cnd. n cazul reaciei pozitive
36
descompunerea ureei produce degajarea amoniacului, fcnd s vireze rou de fenol la

roz apoi la rou nchis Reacia este deseori vizibil dup 2 pn la 4 h.
Testul de reducere a nitrailor n nitrii (denitrificare)

Bacterile de cercetat se cultiv pe medii coninnd nitrat de potasiu. Dup 3-5 zile
de incubare se adaug 5 picturi din cei doi reactivi Gries Ilosvay. n caz de
pozitivitate, mediul se coloreaz n rou. Dac reducerea nitrailor nu a avut loc, culoarea
mediului nu se modific.
Alte teste
Testul Voges Proskauer
Testul de reducere a unor substane colorante;
Testul cu rou metil;
Testul decarboxilazei.
Reacii care urmresc punerea n eviden a folosirii ca surs de
hran a unor substraturi coninute de mediu
Testutul cultivrii pe medii care conin citrat de sodiu

Se folosete pentru a afla dac bacteriile utilizeaz sau nu citratul de sodiu ca
surs de carbon.
37
Mediul coninnd citrat de sodiu este favorabil dezvoltrii numai anumitor

bacterii (ex. Enterobacter, Pseudomonas, Citrobacter, S. gallinarum), n timp ce
altzele (ex. Shigella, Escherichia coli, S. pulorum) nu pot folosi citratul de sodiu ca
surs energetic. Cele care se dezvolt prin alcalinizare determin i viraraea culorii
mediului ctre albastru intens.
Materiale necesare efecturii testului sunt urmtoarele: cultura de testat, o
ans bacteriologic, un tub de hemoliz cu mediu Simmons steril (care conine citrat
de sodiu i care este turnat nclinat), bec Bunsen.
Tehnica de lucru presupune parcurgerea mai multor etape: se sterilizeaz ansa
ac dup care se rcete n aer; se ia placa Petri cu cultura de testat, lsndu-se
capacul acesteia rsturnat pe masa de lucru; se preleveaz un fragment dintr-o
colonie izolat, suspect; se las placa petri pe masa de lucru; se ia tubul cu mediu
Simmons i se scoate dopul de vat, dup care se flambeaz gura acestuia; se
introduce ansa n tub i se disperseaz cultura prin micri n zig zag de jos n sus
pe toat suprafaa mediului, se flambeaz din nou gura gura tubului cu mediul de
cultur i se acoper cu dopul de vat, dup care se pune n stativ; se sterilizeaz
ansa i se las pe masa de lucru; se incubeaz mediul nsmnat 24 de ore la 35 37C.
Dac testul este pozitiv se va observa c culoarea mediului Simmons va vira
de la verde glbui la albastru ca urmare a alcalinizrii acestuia, datorat
metaboliilor bacterieni. Dac testul este negativ, mediul i conserv culoarea iniial.
LABORATOR NR. 10
Tehnica efectuarii frotiurilor
Frotiul este un preparat expeditiv, efectuat din diferite alimente, produse
patologice (organe, lichide patologice etc.), sau din culturi ale diferitilor germeni, care
permite punerea n eviden a formaiunilor celulare i cerecetarea nsuirilor lor
morfologice i tinctoriale.
Frotiul mai poate fi definit ca un preparat microscopic constituit dintr-un singur
strat subtire i ct mai uniform de celule, care este supus unor tratamente speciale de
fixare i colorare, n vederea examinrii. n urma acestor tratamente , microorganismele
se studiaz la microscop n stare moart.
38
Avantajele metodei:
pot fi observate anumite particulariti morfologice specifice i este mult sporit
vizibilitatea la microscop, chiar i atunci cnd se examineaz microorganisme mici
sau refringente;
se elimin riscul contaminrii pentru ca microorganismele sunt omorte prin
folosirea coloranilor concentrai;
preparatele se pot pstra timp ndelungat fr a se altera;
forma i structura microorganismelor este clar, mai stabile, ceea ce usureaz
examinarea lor;
se pot evidenia anumite caracteristici tinctoriale ale microorganismelor ceea ce
ajut la ncadrarea lor in anumite grupe specifice i diagnosticarea mai rapid.
Dezavantajele metodei:
nu permite studierea mobilitii germenilor din preparat;
necesit mai mult experien i dexteritate, nerespectarea ntocmai a tehnicilor i
a succesiunii etapelor putnd duce la dprecierea materialului microbian din
preparat i la imposibilitatea evidenierii elementelor dorite;
uneori pot surveni n structura microorganismelor de studiat modificri n timpul
uscrii i fixrii.
Tehnica efecturii frotiurilor difer n funcie de materialul din care se face i de
natura germenilor n cauz.
Din alimente cu consisten lichid, frotiurile se realizeaz prin ntinderea
materialului respectiv ntr-un strat subire, cu ajutorul unei anse bacteriologice sau a
unei lame lefuite pe lame de microscop obinuite. Este recomandabil ca pelicula s
fie ct mai fin i s aib o ntindere mai redus dect marginile lamei de microscop.
Dac se presupune c alimentul respectiv conine o cantitate mai redus de
microorganisme, se poate realiza o concentrare a acestora prin centrifugare, frotiul
practicndu-se astfel din sediment.
Pentru examinarea laptelui de exemplu se procedeaz mai nti la centrifugarea
acestuia (o cantitate de aproximativ 10-20ml), iar din sediment se efectueaz frotiuri care
vor fi colorate cu metode obinuite (Gram, Giemsa, Ziehl), n funcie de suspiciune. Se pot
astfel pune n eviden bacterii din genul Staphylococcus, Streptococcus, Micobacterium,
etc.
Din alimente cu consisten solid, frotiul se poate realiza n mod diferit n
funcie de natura acestora. Cel mai frecvent se face prin aplicarea unei lame de
microscop pe suprafaa de seciune a probei de examinat, n acest fel rmnnd o
impresiune corespunzatoare formei suprafeei atinse (metoda prin amprent). Este bine
ca pe aceeai lam s se practice mai multe amprente, pentru a se putea examina
frotiurile mai subiri (ultimile amprente sunt ntotdeauna mai fine). Se poate recurge, de
asemenea, la glisarea unei poriuni de organ, tiat geometric, pe suprafaa unei
lame de microscop, avndu-se grij de a nu se atinge marginile lamei. i n acest
caz se prefera frotiurile ct mai fine.
Uneori, frotiurile se execut prin strivirea ntre dou lame (n cazul unor
leziuni de tip nodular. n acest scop, se depune o formaiune nodular suspect
39
pe o lam i cu o a doua se strivete prin compresiune.

Dac este vorba de frotiuri ce se practic din culturi, n cazul mediior lichide frotiul
se face cu ansa bacteriologic, sau cu pipeta Pasteur, din mediul de cultur, iar n
cazul mediilor solide se face prelevarea cu ansa bacteriologica a unei cantiti reduse
de cultura care se emulsioneaz bine ntr-o picatur de ap distilat, pus n
prealabil pe o lam de microscop bine degresat i apoi se ntinde suspensia n strat
subire. n cazul culturilor n medii solidificate n poziie vertical (de exemplu geloza
Veillon) se recurge la o pipeta Pasteur la care se adapteaz un tub de cauciuc, n aa
fel ca el sa permit manipularea pipetei n profunzimea mediului sub control vizual.
Materialul microbian se recolteaz prin aspirarea coloniilor izolate, care se gsesc n
diferite puncte ale mediului.
Frotiurile astfel obinute se fixeaz dup uscare la flacar i se coloreaz.
Fixarea este necesar pentru a realiza o bun aderen a materialului patologic
pe lam i implicit evitarea desprinderii de ctre soluiile colorante a materialului de
examinat pe de o parte i inactivarea germenilor etalai pe de alta.
Fixarea are urmtoarele roluri:
inactiveaza enzimele care pot distruge unele elemente morfologice i atunci cnd
este corect executat este metoda care nu permite modificarea structurii celulei
prin colorare;
omoar microorganisemele din preparat prin denaturarea proteinelor microbiene,
fapt ce nltur pericolul contaminarii n cazul n care se examineaz germeni
patogeni;
asigur aderena bacteriilor pe lam pentru a nu fi splate odat cu folosirea
diferitelor soluii pentru colorare;
asigur permeabilizarea pereilor celulari i o mai bun retenie a coloranilor, deci
o colorare mai eficient i posibilitatea evidenierii unor detalii structurale;
structurile intra i extracelulare sunt fixate i devin mai uor de examinat.
Fixarea se poate obine prin mijloace termice sau chimice.
Fixarea termic presupune trecerea frotiului uscat de 34 ori prin flacara unui
bec de gaz sau a unei lmpi cu alcool, avnd grij ca lama s fie orientat spre
flacar cu partea opusa celei pe care s-a etalat materialul. Viteza de trecere este
moderat, n aa fel ca n final temperatura lamei s fie n jur de 60C.
Fixarea termic se poate face i prin flambare, punnd pe frotiu cteva
picturi de alcool etilic, metilic sau alcool-acetona (din bateria de colorare Gram) i
dndu-li-se foc imediat dupa scurgerea excesului de alcool.
Fixarea chimic se realizeaz prin folosirea unor substane fixatoare (alcool etilic,
amestec de alcool etilic, eter i alcool metilic). Acestea se pun n cantitate suficient
pentru a acoperi pelicula de material de pe lam i se las pna la evaporarea total.
Trebuie menionat c unii colorani (de exemplu soluia Giemsa din metoda cu
acelai nume) au i capacitatea de a fixa frotiurile, aa nct n acest caz nu mai
este necesar fixarea prealabil.
Dupa fixarea i rcirea frotiului urmeaz colorarea, care este bine s se fac
ct mai curnd dup efectuarea frotiurilor.
40
LABORATOR NR. 11
Metode de colorare a frotiurilor
Prin colorare se pot stabili unele particularii morfologice ale germenilor
(dimensiuni, forma, afinitati tinctoriale) ca si relaiile cu esuturile n care se afla,
facilitindu-se in acest fel precizarea diagnosticului.
Metodele de colorare sunt diverse si se aplica in mod diferentiat, in funcie de
scopul urmarit. Exista metode care se aplica n mod curent si metode speciale,
mai pretentioase si aplicate numai in anumite situatii.
Coloraia Gram se foloseste pentru diferentierea germenilor Gram pozitivi de
cei Gram negativi din frotiurile efectuate din diferite tesuturi sau din culturi
microbiene. Este o metoda de baza in practica bacteriologica. Ea consta in:
41
colorare cu solute de violet de Gentiana 1% timp de 1 minut

varsarea colorantului de pe lama
tratarea frotiului cu solutie Lugol timp de 2 minute
decolarea cu amestec de alcool-acetona pna cind amestecul ce se scurge de pe lama nu mai este colorat
spalare cu apa de robinet
recolorare cu fucsina diluata 1/10 timp de 2030 secunde
spalare cu apa de robinet
uscare
examinarea la microscop.
Germenii Gram pozitivi vor aparea colorai n albastru-violet iar cei Gram
negativi n rou. Aceasta diferen de colorare rezult din faptul c germenii Gram
pozitivi fixeaz violetul de Geniana n aa fel nct prin tratarea cu soluia de
alcool-aceton nu se decoloreaz, n timp ce cei Gram negativi se decoloreaz i
apar ca urmare colorri n rou cu cel de al doi-lea colorant (fucsina diluat). Sporii
bacterieni apar sub forma de vacuole.
Coloratia cu albastru de metilen (Loffler) - se foloseste pentru punerea in
evidenta a germenilor intr-un material patologic, fara a-i diferentia sub raportul
afinitatii lor tinctoriale.
In acest scop se acopera frotiul fixat cu o solutie de albastru de metilen 3% i,
dupa 25 minute, se spala cu apa, se usuca, se examineaza. Germenii vor aparea
colorati in albastru, uniform. Metoda permite si observarea unor particularitati
morfologice cum ar fi prezenta capsulei si sporului. Capsula se coloreaza in rozpal, iar sporul apare sub forma unei vacuole.
Coloraia ZiehlNeelsen - se foloseste pentru punerea in evidenta a
germenilor acidorezistenti, care nu se coloreaza prin metodele obinuite (mai ales
micobacteriile):
acoperirea frotiului, in prealabil fixat la flacara, cu soluie de
fucsina Ziehl
incalzirea la flacara pna la aparitia vaporilor si mentinerea prin
incalziri repetate timp de 510 minute (se va avea grija ca soluia coloranta sa nu fiarba si sa se completeze in caz c s-a evaporat de pe
anumite portiuni de frotiu)
varsarea colorantului
decolorarea cu o solutie de acid sulfuric 1/4 sau acetic 1/3, timp
de cca 2 minute
spalare cu ap
tratare cu alcool absolut timp de 5 minute
spalare cu apa
recolorare cu solutie de albastru de metilen 1% timp de 23
minute
spalare cu apa
uscare si examinare cu imersie.
42
Acidorezistena rezid n structura chimic particular a peretelui celular al

germenilor, n sensul c n cazul acidorezistenilor acesta fiind bogat n substane
lipoide impiedic ptrunderea acidului decolorant ca dealtfel i a coloranilor (fucsina
ptrunde datorit concentraiei ridicate i a cldurii). Pentru acest motiv, germenii
acidorezisteni nu sunt colorabili prin metode obinuite.
Alte metode de colorare:
Coloratia Koster - se foloseste pentru colorarea brucelelor;
Metoda Koslovski - se foloseste pentru colorarea brucelelor;
Metoda Tribondeau - Fontana - se foloseste pentru colorarea
leptospirelor;
Pentru colorarea capsulei bacteriene - coloraia Giemsa, metoda de
colorare negativa a capsulei cu tus de China, etc.;
Pentru colorarea sporilor: Metoda Moller, Metoda Pooman, Metoda cu
verde de malahit;
Pentru colorarea cililor - Metoda CasaresGill.
LABORATOR NR. 12
Metode de microscopie folosite n microbiologie
Examinarea microscopic, urmrete punerea n eviden a bacteriilor prin
examinarea la microscop a frotiurilor colorate prin diferite metode.
Valoarea unui microscop este definit de puterea de rezoluie a acestuia.
Numarul de detalii structurale si precizia cu care pot fi evidentiate acestea la microscop,
depind de puterea de rezolutie. Ea reprezinta capacitatea unui sistem optic de a separa
sau distinge imaginile a doua puncte adiacente (cea mai mica distanta la care doua
particule sau linii separate pot fi vazute individualizat, formand imagini distincte pentru
ochi). Rezolutia maxima se obtine cu o lumina avand o lungime de unda mai scurta, 450500 nm(in zona albastra a spectrului vizibil).
43
Aceasta este direct proporional cu apertura numeric (constant a

obiectivului, definit ca produs al aperturii sale unghiulare i indicelui de refracie al
mediului dintre preparat i lentila frontal a obiectivului) i invers proporional cu
lungimea de und a radiaiilor folosite.
Principiul de functionare al microscopului are la baz fenomenul de refracie a
razelor luminoase la trecerea printr-un sistem de lentile ce constituie de fapt partea
optica a acestuia. La trecerea unei raze de lumin dintr-un mediu n altul, aceasta este
refractat, adic este deviat la limita dintre acestea.
Lentilele sunt instrumente optice facute in mod obisnuit din sticla, marginite de
doua suprafete curbe (convexe au concave) sau o suprafata curba si una plana. Puterea
unei lentile depinde de distanta focala (distanta dintre axa longitudinala a lentilei si
centrul focal). O lentila cu distanta focala mica are capacitate mai mare de marire asupra
obiectului decat o lentila cu distanta focala mai mare. Omul nu-si poate acomoda privirea
la o distanta mai mica de 25 cm. Aceasta limita se poate depasi doar utilizand o lupa sau
un microscop si apropiind foarte mult aceste instrumente de obiectul de examinat.
n prezent sunt utilizate 2 categorii de microscoape:
Fotonice care utilizeaz spectrul luminii vizibile;
Electronice care folosesc fascicule de electroni.
Un microscop este format din urmtoarele componente: stativul, piciorul sau
corpul microscopului, surs de lumin; macroviz; corpul mobil; suporii de fixare ai
lamei; obiectivele; capul revolver; capul binocular; inel de reglare dioptrii; ocularele
(obiective uscate - 8x,10x,20x,40x i obiective cu imersie - 60x,90x,100x); masa port
obiect sau platina care cuprinde clrei, bare metalice gradate cu vernier, uruburi
pentru stabilirea poziiei; condensatorul; microviza; buton reglaj condensator; loca
filtre; rozeta diafragmei de cmp; buton de reglaj al oglinzii.
Modalitile de examinare ale unui preparat, nativ sau fixat, cu ajutorul
microscopului optic sunt urmroarele:
examinarea n lumin direct (cel mai des utilizat n microbiologia
alimentelor);
examinarea pe fond ntunecat;
examinarea n contrast de faz;
microscopia cu fluorescen;
microscopia electronic cu transmisie;
microscopia electronic cu baleaj.
Examinarea n lumin direct pentru care se utilizeaz microscopul optic
obinuit cu raze luminoase cu lungimea de und de 4000 - 7000, permind
examinarea preparatelor native pe care se pot evidenia bacteriile vii, necolorate,
eventual mobile, ct i a frotiurilor fixate pe care pot fi observate caracteristicile
morfologice ale germenilor, avnd o limit de rezoluie de 0,2m. Examinarea n
lumin direct se poate efectua n dou moduri.
Examinarea uscat:
o Se aeaz lama pe platin i se fixeaz cu cavalerii;
o Se
coboar
condensatorul cca. 1,5
44
cm sub platin iar diafragmul trebuie s fie jumtate deschis;

o Se aduce n axul microscopului un obiectiv mic (10x, 20x sau 40x)
care este cobort pn n apropierea lamei cu ajutorul macrovizei,
privind din lateral;
o Privind prin oculare cu ambii ochi, se ridic ncet tubul prin
manevrarea cu grij a vizei macrometrice, pn cnd se nfieaz
privirii imaginea unei zone circulare a preparatului, care constituie un
cmp microscopic:
o Se realizeaz reglajul fin al imaginii, cu ajutorul vizei micrometrice,
privind prin oculare;
Examinarea cu imersie:
o Se aeaz lama pe platin i se fixeaz cu cavalerii;
o Se prinde imaginea cu un obiectiv mic, procednd ca mai sus i se
alege o zon a preparatului care s ofere ct mai multe informaii;
o Se scoate din ax obiectivul mic;
o Se aplic pe lam o pictur de oleu de cedru;
o Se ridic condensatorul pn la poziia maxim (lipit de lam) i se
deschide diafragmul complet;
o Se aduce n axul microscopului un obiectiv mic (90x, 100x, etc.) care
este cobort pn n pictura de cedru cu ajutorul macrovizei;
o Se manevreaz cu grij viza macrometric privind prin oculare, pn
cnd apare imaginea preparatului; se clarific prin manevrarea
microvizei.
O examinare corect a preparatelor microscopice la microscopul optic obinuit
const n:
Examinarea preparatelor native- preparatele proaspete se examineaz
uscat, cu condensatorul cobort la aproximativ 1,5 cm sub platin i cu
duafragmul semideschis folosind unul dintre obiectivele mici (10X, 20X,
40X);
Examinarea preparatelor fixate frotiurile se examineaz iniial uscat, n
scopul alegerii unui cmp microscopic mai semnificativ, pe zoba respectiv
aplicndu-se apoi o pictur de ulei de cedru i realizndu-se o examinare
cu imersie pentru evidenierea microorganismelor.
Examinarea pe fond ntunecat
Pentru examinare se folosete microscopul fotonic cu fond negru (intunecat), la
care condensatorul obinuit de tip Abbe, a fost nlocuit cu unul cardioid sau paraboloid
care are n partea inferioar un disc opac ce mpiedic ptrunderea direct a razelor
luminoase n obiectivul microscopului. Funcionarea microscopului are la baz
Fenomenul Tyndall, conform cruia particulele foarte fine din atmosfer care nu se vd
n lumina direct, devin vizibile cu ochiul liber atunci cnd se gsesc n calea unor raze
de lumin care ptrund ntr-o camer ntunecoas.
Pentru examinare se utilizeaz ca radiaii razele luminoase cu o lungime de
und de 4000 - 7000. Cmpul ntunecat se obine prin folosirea unui dispozitiv de
iluminare lateral a preparatului datorit cruia cmpul microscopic neprimind
45
lumina direct rmne negru, iar microorganismele laminate apar stralucitoare, putnd fi
observate foarte bine. Formarea imaginii ia natere prin reflectarea razelor luminoase
de ctre marginile bacteriilor din preparatul nativ ce apar strlucitoare i albe, pe
fondul ntunecat al cmpului microscopic.
Examinarea pe fond ntunecat se utilizeaz pentru examinarea unor bacterii
greu evideniabile prin metode obinuite, datorit dimensiunilor lor mici sau
dificultilor de colorare. Limita de rezoluie este de 0,1m.
Examinarea n contrast de faz
Permite observarea unor obiecte transparente fr a fi colorate. Pentru
examinare se folosete microscopul cu contrast de faz prevzut cu obiective cu
plcue de faz, notate pe montur cu F sau PH i un condensator special, cu
revolver. Pentru examinare se utilizeaz ca radiaii razele luminoase cu o lungime de
und de 4000 - 7000. Efectul contrastului de faz este dat de un fascicul de lumin
venit de la surs, care trece printr-un disc optic localizat n obiectiv i prevzut n
interiorul su cu un inel transparent.
Formarea imaginii ia natere prin interferena razelor defazate i nedefazate n
plcua de faz (propagarea razelor este ncetinit de zonele mai dense sau mai
groase ale preparatului, ceeace conduce la apariia unor diferene de faz,
corespunztoare diverselor structuri. Fondul format de lumina nedeviat este luminos,
n schimb obiectul apare nchis la culoare (umbrit) i contrastat.
Examinarea n contrast de faz se utilizeaz pengtru examinarea de preparate
microscopice transparente, necolorate. Limita de rezoluie este de 0,2m.
Microscopia cu fluorescen
Pentru examinare se folosete microscopul cu fluorescen. Acesta utilizeaz ca
radiaii ultravioletele cu o lungime de und de 1800 - 4000. Formarea imaginii
fluorocromiii (izotiocianatul de fluorescen, etc.), sunt substane ce absorb radiaiile
ultraviolete din domeniul apropiat spectrului vizibil, cu o lungime de und mai mare.
Substanele fluorescente emit radiaii de culoare diferit dac sunt iradiate de un fascicul
de raze cu o lungime de und mic i o frecven nalt.
Examinarea n fluorescen se utilizeaz pentru examinarea unor bacterii,
antigene sau anticorpi, marcate n prealabil cu fluorocromi. Limita de rezoluie este de
0,1m.
Microscopia electronic cu transmisie
Pentru examinare se folosete microscopul electronic cu transmisie. Acesta
utilizeaz ca radiaii fascicule de electroni accelerai cu o lungime de und de 0,05.
(datoritp vitezei mari de deplasare a elecronilor). Formarea imaginii ia natere printr-o
deviere elastic a electronilor din fascicul de ctre nucleii atomici. Examinarea se
utilizeaz pentru studiul ultrastructurii bacteriilor. Limita de rezoluie este de 1,4.
Microscopia electronic cu baleiaj
Pentru examinare se folosete microscopul electronic cu baleiaj. Pentru
examinare se utilizeaz ca radiaii fascicule de electroni accelerai cu o lungime de
und de 0,1. (datorit vitezei mari de deplasare a elecronilor). Formarea imaginii ca
urmare a bombardrii suprafeei microbilor cu un fascicul de electroni accelerai,
acesta emite electroni secundari, ce sunt captai i particip la formarea imaginii
46
pe ecranul unui tub cinescopic. Examinarea se utilizeaz pentru studiul unor detalii de
pe suprafaa exterioar a microorganismelor. Limita de rezoluie este de 70.
Stereomicoscopul
Lateral fa de obiectivul frontal este fixate o bar curb pe care se deplaseaz o
lamp tubular electric ce asigur iluminarea lateral a obiectului pentru a-i contura
forma. (Internet)
Dimensionarea bacteriilor
Este o operaiune care poate fi efectuat prin comparaie cu diferite elemente a
cror dimensiune este cunoscut sau prin utilizarea de metode micrometrice.
Metoda comparaiei recurge la folosirea de obicei a elementelor eritrocitare, al
cror diametru cunoscut este de 7,7 - 8. Pentru aceasta se amestec o suspensie
bacterian n ser fiziologic cu o pictur de snge. Din amestec se realizeaz un frotiu
care dup colorare se exmineaz la microscop, comparndu-se dimensiunile bacteriilor
cu cele ale eritrocitelor.
Metoda micrometric se recurge la utilizarea unor dispozitive speciale din sticl,
pe care sunt gravate scri gradate. Acestea se adapteaz la microscop sub lentila
superioar a ocularului i micrometrul obiectiv, aezat pe platina microscopului.
Micrometrul obiectiv se regleaz astfel nct liniile zero ale celor dou micrometre s se
suprapun. Se noteaz apoi care din diviziunile celelalte se suprapun. Valoarea gsit la
micrometrul obiectiv se nmulete cu 10 (valoarea n microni a unei diviziuni) i se
mparte la valoarea de pe scara micrometrului ocular, cu care se fac apoi determinrile.
Micrometrul obiectiv se scoate de pe platina microscopului i se pune preparatul de
examinat. Numrul de diviziuni ocupat de formaiunea bacterian sau celular ce
urmeaz a fi determinat, se nmulete cu cifra corespunztoare valorii n microni a unei
diviziuni a micrometrului ocular, determinndu-.se astfel mrimea formaiunii respective
Conservarea frotiurilor
Din diferite considerente se impune oneori conservarea frotiurilor (colorate sau
necolorate) o perioad mai ndelungat de timp. Indiferent de starea n care urmeaz a fi
conservate, este necesar s se aleag locuri uscate, ferite de praf i de lumin. Este
preferabil ca frotiurile s fie puse n cutii speciale, cu rastel, n care s existe i
posibilitatea identificrii rapide.
Dac se dorete pstrarea unui frotiu care a fost examinat n imersie, se terge
oleul de cedru cu ajutorul unui tampon de vat, tifon sau hrtie de filtru mbibat n xilol,
dup care se usuc i se pune la pstrare. Montarea n balsam de Canada, dei
realizeaz o bun protecie mecanic, accelereaz decolorarea frotiurilor, ngreunnd
astfel identificarea microorganismelor fihate i colorate.
47
LABORATOR NR. 13
Diagnosticul bolilor parazitare
Trichineloza
Animalele slbatice receptive cu destinaie consum uman (porci, mistrei, uri),
trebuie examinate pentru Trichinella spp. Recoltarea probelor pentru decelarea
Trichinella spiralis se face conform prevederilor Regulamentului Comisiei nr.
2075/2005/CE, cu amendamentele ulterioare.
Carnea proaspt provenit de la speciile de animale receptive se admite pentru
consum uman numai dup efectuarea examenului pentru decelarea Trichinella spp. de
ctre medici veterinari oficiali sau medici veterinari de liber practic mputernicii de
ctre DSVSA.
Examenul pentru decelarea Trichinella spiralis se efectueaz n cadrul Institutelor
Naionale de Referin, la LSVSA din cadrul DSVSA, n Circumscripiile Sanitare
Veterinare i pentru Sigurana Alimentelor, n laboratoarele din Circumscripiile
48
Sanitare Veterinare de Asisten, ori n laboratoarele din unitile care manipuleaz

carne de vnat slbatic. Carnea proaspt provenit de la speciile de animale receptive
se admite pentru consum uman numai dup efectuarea examenului pentru decelarea
Trichinella spp. de ctre medici veterinari oficiali sau medici veterinari de liber
practic mputernicii de ctre DSVSA.
Examenul pentru depistarea trichinei se efectueaz prin una din urmtoarele
metode:
1. examen trichineloscopic direct prin compresie pe lam n condiiile prevzute de
Regulamentul Comisiei nr. 2075/2005/ CE,
2. metoda digestiei - metoda digestiei eantioanelor combinate/colective, utiliznd
un agitator magnetic metoda de referin; metoda digestiei eantioanelor
combinate/colective cu asisten mecanic (tehnica sedimentrii - metoda
echivalent; tehnica de izolare prin filtrare-metoda echivalent), metoda de
digestie automat pentru eantioane combinate/colective pn la 35g metoda
echivalent.
Ambele metode de testare a prezenei paraziilor folosesc ca material de lucru
esut muscular recoltat din zone n care este tiut c paraziii au o inciden mare:
diafragma, musculatura de la baza limbii, muchii intercostali, muchii maseteri, etc.
Recoltare de probe din pilierii diafragmatici
Alegerea celei mai potrivite metode pentru examinarea carcaselor de porc pentru
trichineloz, depinde de posibilitile existente i de numrul probelor care trebuiesc
testate, cea de a doua fiind recomandat n cazul unui numr mare de probe.
Prima metod const n examenul trichineloscopic direct pentru evidenierea
larvelor. Aceast metod necesit existena unui microscop specializat sau a unui
trichineloscop, iar eficiena ei este estimat pentru detectarea a aproximativ 3
larve/gram de esut. Metoda are dezavantajul c necesit un timp de lucru considerabil,
n cazul vnatului fiind necesar examinarea a 4 lame presoare, fiecare cu 28 de
cmpuri.
49
Etalarea probelor recoltate pe lama presoare
Examinarea probelor la trichinelooscop
Larve de Trichinella spiralis
A doua metoda const n digestia artificial a probelor individuale sau comune.

Mrimea probei poate varia, probele individuale de 100 g pot fi recoltate de la un singur
animal sau multiple, cnd probele pot fi colectate de la mai multe animale pentru a
totaliza 100 g de prob comun. n final proba este examinat microscopic pentru
detectarea larvelor. Ea are o eficien aproximat la 3 larve/gram de esut muscular,
examinat n faza n care proba de esut are o mrime de 1 gram. Cnd larvele sunt
detectate prin metoda de digestie n cadrul unei probe comune, procedura total trebuie
repetat pentru fiecare dintre probele care au compus proba comun (Foto nr. 61).
Aceste metode au ns unele limite, eficacitatea lor fiind dependent de
pregtirea i experiena examinatorului, intensivitatea infestaiei, funcie de regiunea
corporal. Aplicarea acestor examene depinde de aparatur, de modul de recoltare al
probelor, de metodele de lucru i de stadiul evoluiei parazitului n cadrul ciclului biologic.
n funcie de aceasta, eroarea de diagnostic poate fi cuprins ntre 1 i 70% i de aceea
evaluarea diagnosticului din punct de vedere medico legal, trebuie s se realizeze cu
mult discernmnt.
Referitor la zonele musculare de elecie, n urma unor studii, s-a constatat c
larvele de Trichinella prezint o intensivitate maxim n muchii extrinseci ai limbii i
maseteri la mistre, muchii limbii i maseterii interni la urs, muchii ochiului i
antebrahiali la vulpe, muchii flancului (abdominali inferiori) i maseteri la oareci
maseterii interni la iepuri (n urma infestrii artificiale), muchii antebrahiali la arici
(infestai artificial).
Carnea de la animale slbatice la care a fost diagnosticat Trichinella spiralis se
declar improprie consumului uman, lundu-se msuri pentru interzicerea
50
punerii pe pia a crnii la care a fost depistat Trichinella. Se va dispune distrugerea

acesteia i se vor iniia investigaii epidemiologice n vederea identificrii originii bolii.
Marcarea crnii la care s-a efectuat examenul pentru decelarea Trichinella
spiralis se efectueaz conform prevederilor legale (aplicarea pe carcas a tampilei
Fr trichin.
Sensibilitatea metodelor serologice pe animalele n via este egal sau mai bun
dect cea a metodelor directe cu meniunea c un rspuns serologic este adesea
nedectat la 3 sptmni sau mai mult dup ce larva a devenit infectant. n astfel de
cazuri se obine un rezultat serologic fals negativ.
Identificarea speciei/tipului de Trichinella din esutul muscular poate fi valoroas
n nelegerea epidemiologiei parazitului i n evaluarea riscului relativ pentru om.
Solicitrile pentru specie/tip, pot fi fcute prin Laboratorul de Referin al OIE din Roma,
Italia. Identificarea speciilor de Trichinella este determinat prin multiplex PCR i PCR
RFLP, metode eficiente pentru determinarea genotipului.
Sarcosporidioza
Pe animalele n via se poate efectua examenul coproscopic al gazdelor
definitive cnd se pot pune n eviden sporochitii. (52)
Animalele slbatice receptive mpucate cu destinaie consum uman (mistrei i
cerbi), trebuie examinate pentru identificarea sarcochitilor. Examenul se realizeaz de
ctre medici veterinari oficiali sau medici veterinari de liber practic mputernicii de
ctre DSVSA.
Examenul pentru depistarea sarcochitilor se efectueaz odat cu examenul
trichineloscopic direct prin compresie pe lam n condiiile prevzute de Regulamentul
Comisiei nr. 2075/2005/ CE. (98), folosind ca material de lucru esut muscular recoltat
din zone n care este tiut c paraziii au o inciden mare: diafragma, musculatura de la
baza limbii, muchii intercostali, muchii maseteri.
Metoda necesit existena unui microscop specializat sau a unui trichineloscop,
fiind necesar examinarea a 4 lame presoare, fiecare cu 28 de cmpuri.
La vnatul parazitat mpucat sau gsit mort se gsesc n muchi sarcochiti de
dimensiuni i forme diferite. Ct privete numrul, acesta poate fi mare - 700 800 pe
cm de muchi. Sarcochitii se localizeaz mai frecvent n muchii laringieni, esofag,
intercostali, diafragm i cord.
La mistrei, formaiunile de sarcosporidii se difereniaz microscopic de cele de
trichin, acestea fiind mai mari i de form alungit.
51
Abrevieri
ANSVSA Autoritatea Naional Sanitar Veterinar i pentru Sigurana Alimentelor
BPE Bun Practic de Fabricaie
Comisia BIOHAZ Comisia tiinific pe Riscuri Biologice
CSMVSP - Comitetul tiinific pentru msuri veterinare legate de sntatea public
CSVSA Circumscripia Sanitar Veterinar i pentru Sigurana Alimentelor
DDD Dezinfecie, Dezinsecie, Deratizare
DSA Direcia de Sntate Animal
DSVSA Direcia Sanitar Veterinar i pentru Sigurana Alimentelor
EFSA Autoritatea European pentru Siguran Alimentar
HG Hotrre de Guvern
IISPV Institutul de Igien i Sntate Public Veterinar
NACMF National Advisory Commitee on Microbiological Criteria of Foods
NCP Numrul cel mai probabil
LCR Laborator Comunitar de Referin
LNR Laborator Naional de Referin
LSVSA Laboratorul Sanitar Veterinar i pentru Sigurana Alimentelor
52
OMS Organizaia Mondial a Sntii

PCR reacia de polimerizare n lan
PIF Puncte de Inspecie la Frontier
Reg Regulament
T Thrner
TU Testul Unic
TCS - Testul Comparativ Simultan
UE Uniunea European
ufc uniti formatoare de colonii
UHT - Ultra High Temperature
WHO (OMS) - Organizaia Mondial a Sntii
Definiii
Criteriu microbiologic - criteriul ce defineste acceptabilitatea produsului, a lotului de
produse alimentare sau a prelucrarii bazat pe absenta, prezenta sau numarul de
microorganisme, si/sau cantitatea toxinei/metabolitilor lor, pe unitate (ti) de masa,
volum, arie sau lot ;
Criteriul de siguranta a alimentelor - criteriul ce defineste acceptabilitatea unui
produs sau lot de produse alimentare aplicata produselor plasate pe piata ;
Criteriul de igiena a prelucrarii - indica acceptabilitatea functionarii procesului de
prelucrare. Criteriul nu se aplica produselor plasate pe piata. Stabileste o valoare de
contaminare deasupra careia sunt necesare masuri pentru a mentine igiena in
prelucrare in conformitate cu legea alimentelor.
Evaluarea riscului - un proces cu baze tiinifice, constnd din patru etape:
identificarea pericolului, caracterizarea pericolului, evaluarea expunerii i
caracterizarea riscului;
Gestiunea riscului - procesul, diferit de evaluarea riscului, de apreciere a politicilor
alternative prin consultarea prilor interesate, lund n considerare evaluarea riscului
i ali factori legitimi i, dac este necesar, selectnd opiunile de prevenire i control
adecvate;
53
Microorganisme - bacterii, virusi, drojdii, mucegaiurii, alge, protozoare parazitice,

helminti paraziti microscopici si toxinele si metabolitii acestora ;
Lot - un grup sau o serie de produse identificabile obinute n urma unui anumit proces
n condiii practic identice i produse ntr-un anumit loc n cadrul unei perioade de
producie determinate;
Operator n sectorul alimentar - persoanele fizice sau juridice care rspund de
ndeplinirea cerinelor legislaiei n domeniul alimentelor n cadrul ntreprinderii cu profil
alimentar aflat sub controlul lor;
Pericol - un agent biologic, chimic sau fizic aflat n alimente, avnd potenialul de a
cauza un efect negativ asupra sntii;
Probe - un set compus din una sau cateva unitati sau o portiune de materie selectata
din diferite medii intr-o populatie sau o importanta cantitate de materie care este
destinata pentru a obtine informatii pe un caracter dat din populatia studiata si sa ofere
o baza pentru deciziile in ceea ce priveste populatia sau materia in discutie sau in ceea
ce priveste procesul care l-a realizat.
Proba elementara - cantitatea de material prelevata dintr-un singur punct al lotului.
Proba global - totalul combinat al tuturor probelor elementare prelevate din lot.
Proba de laborator - parte din proba global, destinat examenului de laborator.
Probe reprezentative - o proba in care toate caracteristicile lotului din care s-a extras
sunt mentinute. Acesta este cazul unei probe simple luate la intamplare unde fiecare
articol sau produs al lotului i s-a dat aceeasi probabilitate de a forma proba.
Respectarea criteriilor microbiologice - obtinerea de rezultate satisfacatoare sau
acceptabile stabilite in Anexa I a Regulamentului 3073/2005, cand testele pentru
valorile criteriilor stabilite prin prelevarea de probe, realizarea analizelor si
implementarea de masuri corective in acord cu legea alimentatiei si instructiunile date
autoritatea competenta.
Risc - o funcie a probabilitii unui efect negativ asupra sntii i gravitatea acelui
efect, determinat de un pericol;
Trasabilitate - capacitatea de a depista i a urmri anumite alimente, un animal de la
care se obin produse alimentare sau o substan destinat ncorporrii sau care este
de ateptat s fie ncorporat n anumite alimente, pe parcursul tuturor etapelor de
producie, prelucrare i distribuie;
Valabilitate - perioada corespunzatoare celei anterioare a se consuma inainte de
sau durabilitatea minima, definita in Articolul 9 si 10 al Directivei 2000/13/CE.
54
Bibliografie
1. Bacterial Nomenclature up to date (Approved lists, validation lists), April 2012.
Compiled by Leibniz Institute DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroornismen
und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany.
2. Brzoi D., Meica S., Negu M. 1999. Toxiinfecii alimentare. Editura Diaconu
Coresi, Bucureti.
3. Brzoi D., Apostu S., 2002. Microbiologia produselor alimentare. Editura
Risoprint, Cluj Napoca.
4. Enache T., Paul I., Snescu V., Popescu O., Iordache I.,1994. Medicin Legal
Veterinar. Editura ALL Bucureti.
5. Ivana Simona 2007. Microbiologie Medical Veterinar, Vol I. Editura tiinelor
Medicale.
6. Ivana Simona, 2007. Microbiologie Medical Veterinar, Vol II. Editura Asclepius.
7. Mateescu C., Nicolae I., Negu Lucia, Bluc N., Onac N., Nicolae F., 2006.
Tratat de Siguran Alimentar. Editura Biotera Bucureti.
8. One E., Constantinescu Virginia, 1978. Diagnosticul de laborator n medicina
veterinar. Editura Ceres
9. Savu C., 2002. Igiena i controlul produselor de origine animal. Editura Semne E,
Bucureti.
10. Savu C., Georgescu Narcisa, 2004. Sigurana Alimentelor. Editura Semne E,
Bucureti.
55
11. Savu C. 2008. Igiena i controlul produselor de origine animal. Editura Semne.
12. Savu V. 2012. Metoda recuperrii pe mediu solid pentru izolarea i cuantificarea
enterococilor din brnzeturi. Revista Romn de Medicin Veterinar , Vol. 22, nr.
1/2012.
13. tirbu C., Turcu D., 1999. Noiuni de bacteriologie. Editura Brumar Timioara.
14. Turcu D., 2005. Virusologie Lucrri aplicative. Editura Fundaiei Romnia de
Mine.
15. Turcu D., 2007. Bacteriologie General. Editura Fundaiei Romnia de Mine.
16. Turcu D., 2004. Bacteriologie Lucrri aplicative. Editura Fundaiei Romnia de
Mine.
17. Ordinul ANSVSA nr. 43/2012. Norme metodologice de aplicare a Programului
aciunilor de supraveghere, prevenire, control i eradicare a bolilor la animale, a
celor transmisibile de la animale la om, protecia animalelor i protecia mediului,
de identificare i nregistrare a bovinelor, suinelor, ovinelor i caprinelor pentru
anul 2012
18. Regulamentului (CE) nr. 2073 / 2005 din 15 noiembrie 2005 privind criteriile
microbiologice pentru produsele alimentare publicat n Official Jurnal of the
European Union. Realizat la Brussels, la 15 Noiembrie 2005.
19. Regulamentul (CE) Nr.2074/2005 al Comisiei din 5 decembrie 2005 de stabilire
a msurilor de aplicare privind anumite produse reglementate de Regulamentul
(CE) nr. 853/2004 al Parlamentului European i al Consiliului i organizarea unor
controale oficiale prevzute de Regulamentele (CE) nr. 854/2004 al Parlamentului
European i al Consiliului i (CE) nr. 882/2004 al Parlamentului European i al
Consiliului, de derogare de la Regulamentul (CE) nr. 852/2004 al Parlamentului
European i al Consiliului i de modificare a Regulamentelor (CE) nr. 853/2004 i
(CE) nr. 854/2004
20. Regulamentul (CE) nr. 1441/2007 al Comisiei din 5 decembrie 2007 de
modificare a Regulamentului (CE) nr. 2073/2005 privind criteriile microbiologice
pentru produsele alimentare.
21. Ghidului Naional de Biosoguran pentru Laboratoarele Medicale, emis de
Ministerul Sntii n anul 2005
56

Microbiologie Generala

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Microbiologie Generala

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Microbiologie General - Lucrri practice

Microbiologie General - Lucrri practice

Microbiologie General - Lucrri practice

Microbiologie General - Lucrri practice

infecioase i a animalelor infectate i nainte de prsirea zonei de lucru a

Microbiologie General - Lucrri practice

operaiuni trebuie s existe permanent n laborator pentru a putea fi consultat n

Microbiologie General - Lucrri practice

Materialele care urmeaz s fie decontaminate i eliminate vor fi puse n

Microbiologie General - Lucrri practice

Laboratoarele naionale de referin sunt autoriti centrale pentru domeniile

Microbiologie General - Lucrri practice

1. laborator de microbiologia alimentelor - cu profilurile:

Microbiologie General - Lucrri practice

netoxice, rezistente la ageni fizici i chimici, impermeabile, neputrezibile i

Microbiologie General - Lucrri practice

igienizare a spaiilor de lucru i a cilor de acces.

Microbiologie General - Lucrri practice

Prin ageni chimici

Microbiologie General - Lucrri practice

Sterilizarea prin nclzire la rou este folosit n cazul anselor de nsmnare

Microbiologie General - Lucrri practice

Microbiologie General - Lucrri practice

Microbiologie General - Lucrri practice

Mediul de cultur trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:

Microbiologie General - Lucrri practice

- s nu conin substane toxice sau s genereze compui toxici n urma creterii

Medii de cultur pstrate n baloane Erlenmeyer

n practica de laborator mediile de cultur se folosesc pentru izolarea din medii

Microbiologie General - Lucrri practice

Vassiliadis cu soia (bullion RVS) i bulionul Muller-Kauffmann

Microbiologie General - Lucrri practice

precipitare, se filtreaza prin hrtie de filtru si se sterilizeaza din nou !a autoclav.

Cnd se adauga zaharurile, acestea se pun in proportie de 1% in balonane

Microbiologie General - Lucrri practice

12-faza de repaos (faza lag);

Microbiologie General - Lucrri practice

similar, faza lag este scurt sau poate s fie absent.

Microbiologie General - Lucrri practice

Microbiologie General - Lucrri practice

Cu ajutorul acului de nsmnare drept - se cauterizeaz suprafaa

Microbiologie General - Lucrri practice

Microbiologie General - Lucrri practice

Depozitul - ia natere prin depunerea la fundul tubului a germenilor care

Microbiologie General - Lucrri practice

Suprafaa - mediului poate oferi aspectul unei membrane de grosimi variabile,

Culoarea - mediului poate oferi aspectul

Pe mediile solide, germenii constituie, prin multiplicare, aglomerri cunoscute sub

Microbiologie General - Lucrri practice

Consistena este i ea variabil: untoas, vscoas, uleioas,

Cteva exemple n acest sens, pot fi edificatoare.

Microbiologie General - Lucrri practice

Microbiologie General - Lucrri practice

Reacii de punere n eviden a capacitii zaharolitice

Medii de cultur lichide

Microbiologie General - Lucrri practice

Foto nr. Glucoza, Salicina, Trehaloza

Foto nr. Arabinoza, Xiloza, Rafinoza, Manita

Foto nr. Glucoz, Salicin, Trehaloz

Microbiologie General - Lucrri practice

Foto nr. Zaharuri fermentate i nefermentate

Foto nr. Zaharuri fermentate i nefermentate

Medii de cultur solide

Microbiologie General - Lucrri practice