Microbiologie general Note de curs, CEPA II

Conf. univ. dr. Marian JELEA

7. PROCESE METABOLICE ALE MICROORGANISMELOR I APLICAII N INDUSTRIA ALIMENTAR

BIOENERGETICA MICROB IAN (METABOLISMUL OXIDATIV ENERGETIC) Procurarea energiei este o proprietate vital a celulei microbiene, care se realizeaz prin eliberarea energiei chimice a diferitelor alimente i formarea compuilor macroergici prin procesul de fosforilare. n metabolismul energetic, prin procese de oxidare i oxidoreducere pe cale enzimatic, substratul nutritiv trece n substrat oxidat, cu eliberarea de energie potenial (Q1). Substratul oxidat rezultat, avnd energia potenial diminuat (Q2), sufer n continuare transformri pn la produii finali:
E1 E Substrat nutritiv Substrat oxidat 2 CO 2 H 2 O

Q1 ADP Pi ATP

Q2 ADP Pi ATP

Substratul oxidat poate servi drept precursor sau, dac nu este util celulei, se poate elimina n mediu sub form de catabolit. Cantitatea de energie obinut prin catabolism poate fi obinut direct n biosintez, iar energia excedent este stocat n compui macroergici prin procesul de fosforilare, denumit astfel deoarece componenta macroergic, care stocheaz energia rezultat, conine grupri fosfat. Se consider compus macroergic un compus capabil s elibereze o cantitate de energie mai mare sau egal cu 30 kj/mol. Principalii compui macroergici sunt: ATP-ul, acetil fosfatul (Acetat~P), ADP-ul, fosfoenolpiruvatul, compui care pot disponibiliza cantiti variabile de energie, prin ruperea legturii macroergice. n figura urmtoare se prezint, simplificat, ciclul ADP-ATP. Procese exergonice ATP Fermentaii anaerobe Fosforilare oxidativ ADP Fig. 1.20. Procese metabolice cu participarea ATP. Fosforilarea poate fi de trei tipuri: fotosintetic, ntlnit la bacteriile din diviziunea Photobacteria care folosesc energia radiant; oxidativ,cnd formarea compuilor macroeregi cu fosfor are loc prin nmagazinarea energiei eliberate prin reacii de oxidare, n procesele de respiraie aerob sau anaerob; de substrat, n urma formrii de compui macroergici prin reacii de oxido-reducere, prin care glucidele sunt transformate, prin procese de fermentaie anaerob, n compui intermediari, acceptorul de H sau electroni fiind un compus organic. 1 Biosintez Reproducere Transport Cldur Procese endergonice

Microbiologie general Note de curs, CEPA II

Conf. univ. dr. Marian JELEA

La fosforilarea oxidativ eliberarea energiei poteniale din diverse substraturi de natur organic se realizeaz prin procese de oxidare, care se pot desfura astfel: reacii de oxidare prin pierdere de electroni, caz n care are loc un transfer de electroni de la substane cu potenial de oxidoreducere negativ (maxim 0,41 pentru hidrogen), la substane cu potenial de oxidoreducere pozitiv (maxim +0,82 pentru oxigen); reacii de oxidare prin transfer de hidrogen (electroni i protoni): acest tip de oxidare este folosit de unele microorganisme anaerobe i aerobe i transferul este realizat de enzime active la diferite valori ale potenialului de oxidoreducere. Enzimele implicate n reaciile de oxidoreducere sunt dehidrogenazele aerobe (aldehid-dehidrogenaza) i anaerobe (alcool-dehidrogenazele), care au drept coenzime NAD-ul sau NADP-ul i care preiau atomii de hidrogen trecnd din forma oxidat (NAD+) n forma redus (NADH + H+); reacii de oxidare prin ctig de O2, cnd, n prezena enzimelor care acioneaz la un potenial de oxidoreducere pozitiv, are loc transferul de H la O2 provenit din aer i se formeaz apa; aceast reacie de oxidare este caracteristic microbiotei aerobe. Respiraia aerob este un metabolism oxidativ dependent de oxigenul din aer, iar produsele finale sunt CO2 i apa, ntreaga energie a substratului oxidat eliberndu-se prin produsele finale ale respiraiei. Respiraia aerob este din punct de vedere energetic foarte avantajoas pentru celula microbian; de aceea, atunci cnd se urmrete obinerea de celule n cantiti mari (drojdie comprimat) sau de substane intracelulare, cultivarea se face n condiii de aerare. Microorganismele aerobe dispun de o caten respiratorie diversificat, n componena creia intr dehidrogenaze, citocromi, citocrom-oxidaze, oxidaze. Numeroase bacterii pot oxida hidrogenul (Pseudomonas), amoniacul pn la NO2 (Nitrosomonas), sulful i H2S pn la sulfit (Acidithiobacillus thiooxidans), sau Fe2+ la Fe3+ (Acidithiobacillus ferrooxidans), reacii cu rol important n ciclul natural al elementelor. Respiraia anaerob este un metabolism oxidativ n care substratul este transformat pn la CO2, iar electronii sunt cedai prin oxidare unor compui anorganici. Acest tip de respiraie este ntlnit la bacteriile strict anaerobe. Astfel, bacteriile denitrificatoare pot transforma NO3 la azot molecular, bacteriile metanogene pot transforma dioxidul de carbon n metan, bacteriile acetogene ale genului Clostridium pot transforma dioxidul de carbon n acid acetic. Aceste bacterii obin o cantitate mic de energie i pot crete n absena oxigenului molecular, la un potenial de oxidoreducere de 0,2...-0,3 V. innd cont c mediile care vin n contact cu O2 au un potenial redox de +0,2...+0,4 la un pH= 7, pentru a asigura dezvoltarea anaerobilor, n mediu se adaug substane cu caracter reductor ca: tioglicolat de sodiu, cistein-SH, sulfur de sodiu. Substanele reductoare menin un potenial oxidoreductor sczut, care permite dezvoltarea anaerobilor n plci, chiar cnd mediul vine n contact cu aerul. Pentru cultivarea anaerobilor se pot folosi i vase speciale numite anaerostate, n care O2 este legat chimic, sau cultura se menine n atmosfer de gaze inerte (CO2, N2). Metabolismul oxidativ anaerob poate fi ntlnit i la microorganisme facultativ anaerobe. Aceste microorganisme au capacitatea de a crete aerob, utiliznd oxigenul din aer (respiraie aerob), sau anaerob, utiliznd compui organici ca acceptori finali ai electronilor produi prin catabolism. n condiii aerobe microorganismele facultativ anaerobe i adapteaz echipamentul enzimatic pentru procese de oxidare pn la produi finali, utiliznd preferenial oxigenul, cnd este disponibil, datorit cantitii mai mari de energie rezultat prin respiraie aerob (36 moli ATP/mol glucoz asimilat, fa de 2-3 moli ATP/mol glucoz fermentat).

Microbiologie general Note de curs, CEPA II

Conf. univ. dr. Marian JELEA

Celula microbian prelucreaz nutrienii obinnd energie i diferii compui, iar produii de catabolism sunt eliminai. n cursul acestor prelucrri metabolice, n funcie de faza de cretere a celulei, rezult produi de metabolism, care pot fi mprii astfel: produi primari, care se formeaz n faza de cretere exponenial a celulelor (trofofaza) i sunt produi eseniali pentru celul; produi secundari, care sunt formai n faza de declin a creterii celulelor (idiofaz) i nu sunt eseniali celulei (toxine, alcaloizi). Procesele fermentative utilizate n industria alimentar, produse de culturi selecionate, sunt prezentate n urmtorul tabel: Fermentaii anaerobe Microorganisme i produse de fermentaie selecionate Saccharomyces sp. Alcoolic (alcool etilic i CO2) Lactobacillus, Lactic (acid lactic, diacetil) Lactococcus Propionibacterium Propionic (acid propionic, acid acetic, CO2) Clostridium Butiric (acid butiric, CO2, H2) Fermentaii oxidative i produse de fermentaie Acetic (acid acetic, H2O) Gluconic (acid gluconic) Citric (acid citric) Oxalic, fumaric Microorganisme selecionate Acetobacter Gluconobacter Aspergillus niger Aspergillus niger Aspergillus

Microbiologie general Note de curs, CEPA II

Conf. univ. dr. Marian JELEA

FERMENTAII ANAEROBE
Fermentaia alcoolic Fermentaia alcoolic este un proces anaerob prin care glucidele fermentescibile sunt metabolizate prin reacii de oxidoreducere, sub aciunea echipamentului enzimatic al drojdiei, n produi principali (alcool etilic i CO2) i produi secundari (alcooli superiori, acizi, aldehide ,a.). Agenii tipici ai fermentaiei sunt drojdiile genului Saccharomyces care, prin fermentarea glucidelor, pot s produc mai mult de 8o alcool etilic. Fermentaia alcoolic este un proces ntlnit i la alte microorganisme: Bacillus macerans, Clostridium acetonoetilicus, Zygomonas mobilis, dar acestea produc prin fermentare cantiti mai reduse de alcool etilic comparativ cu drojdiile i nu sunt considerate ageni tipici. Proprieti biotehnologice ale drojdiilor fermentative Pentru a putea fi folosite n practic, drojdiile genului Saccharomyces sunt selecionate n funcie de unele proprieti cum ar fi: puterea alcooligen, care se refer la concentraia mare de alcool ce se poate acumula cnd n mediu exist zahr n exces. Drojdiile sunt sensibile la creterea concentraiei n alcool. n timp ce drojdiile cu putere alcooligen slab (Kloeckera, Torulopsis) sunt inhibate la o concentraie n alcool de 4-6o, drojdiile de vin i spirt (S.cerevisiae var. ellipsoideus, S. cerevisiae-cerevisiae) au o putere alcooligen mare i produc fermentaie alcoolic pn se acumuleaz 16-18o alcool. alcoolorezistena, care se refer la capacitatea drojdiei de a continua fermentaia la creterea concentraiei de alcool, deoarece alcoolul etilic poate aciona ca un denaturant al proteinelor i produce inactivarea enzimelor sensibile. sulfitorezistena, o proprietate important a drojdiilor de vin de a se adapta la concentraii de 200-500 mg SO2/dm3, concentraii care pot influena negativ activitatea altor drojdii din must, neadaptate (drojdii peliculare sau oxidative), ca urmare a scderii potenialului de oxidoreducere. capacitatea de floculare i pulverulena, sunt proprieti datorate structurii peretelui celular i modificrii pH i rH din timpul fermentaiei. Drojdiile floculante pot forma asociaii ce se depun mai uor, n timp ce drojdiile pulverulente se menin mai mult timp n suspensie i produc o fermentaie mai avansat. Pentru drojdiile de ampanie se urmrete ca acestea s se depun uor n gtul sticlei i prin operaia de degorjare, s se separe sedimentul, obinndu-se o ampanie limpede. osmotolerama, care se refer la capacitatea drojdiilor de a produce fermentaia n mediu cu concentraie crescut de zahr. Aceast proprietate este recomandat drojdiilor folosite la obinerea spirtului din melas. frigofilia, este o adaptare a drojdiilor de vin de a produce fermentaia la temperaturi sczute (10-15 oC); astfel sunt evitate fermentaiile secundare, iar vinul conine mai multe substane de arom. caracterul killer, ntlnit la unele drojdii capabile de a acumula intracelular o toxin cu efect inhibitor asupra altor drojdii sensibile. n selecionarea drojdiilor de vin, culturile care au acest caracter dau randamente superioare, deoarece n cursul fermentaiei se produce o autoselecie natural. 4

Microbiologie general Note de curs, CEPA II

Conf. univ. dr. Marian JELEA

Factorii care influeneaz dinamica fermentaiei alcoolice Fermentaia alcoolic, n condiii industriale folosete substraturi naturale bogate n glucide fermentescibile, iar viteza de fermentare i transformare a glucidelor n produi primari i secundari este dependent de numeroi factori care pot fi mprii n dou mari categorii: factori biologici (dependeni de microagenii fermentrii) i factori fizico-chimici (dependeni de compoziia mediului supus fermentrii i de condiiile de mediu). Factorii biologici 1. Fermentaia alcoolic este cauzat de enzimele elaborate de celula de drojdie, deci fermentaia este un proces de natur enzimatic. Complexul zimazic acelular obinut prin mojararea celulelor de drojdie este format din 15 enzime care catalizeaz, n diferite etape, procesele de oxido-reducere ale glucidelor fermentescibile i, n final, formarea de alcool etilic. Enzimele cele mai importante sunt dehidrogenazele: glicerat-aldehid-dehidrogenaza i alcool dehidrogenaza, care au drept coenzim NAD, cu rol n transferul de hidrogen n reaciile de catabolism. 2. Fermentaia decurge rapid dac celulele sunt n faza de cretere exponenial sau la nceputul fazei staionare de cretere. Drojdiile autolizate i pierd proprietile fermentative ca rezultat al hidrolizei proteinelor intracelulare (inactivarea enzimelor). 3. Viteza de fermentaie depinde i de numrul de celule/cm3 mediu. Viteza crete cu numrul de celule prin vitez nelegnd coninutul de alcool format la 100 ml lichid n unitatea de timp. n practic concentraia de microorganisme este stabilit (din raiuni economice), fiind de 106-107 celule/cm3, pentru declanarea rapid a fermentaiei. 4. Spectrul de fermentare al glucidelor este un factor important, tiind c drojdiile produc fermentarea unui numr limitat de glucide. Glucidele direct fermentescibile sunt formele dextrogire ale glucozei i fructozei i n mai mic msur ale galactozei. Diglucidele sunt hidrolizate de ctre enzimele drojdiilor n glucide simple:
Maltaz Maltoza 2 Glucoz Invertaz Zaharoza Glucoz Fructoz Celobiaz Celobioza 2 Glucoz Lactaz Lactoza Glucoz Galactoz

Pentru obinerea alcoolului etilic de fermentare plecnd de la poliglucide, deoarece drojdiile nu produc amilaze/celulaze i nu pot produce hidroliza enzimatic a poliglucidelor, este necesar zaharificarea prealabil a acestora. Substraturile naturale ce conin poliglicide (amidon, celuloz) sun hidrolizate n prealabil pe cale chimic sau enzimatic, pn la obinerea glucidelor fermentescibile. 5. Comportarea drojdiilor fermentative n funcie de accesul oxigenului n mediul supus fermentrii. n condiii anaerobe, prin imersare n must, celulele de drojdie produc fermentarea glucidelor, obinnd o cantitate mic de energie (2 moli ATP/mol glucoz fermentat). De aceea ele trebuie s prelucreze o cantitate mare de glucoz pentru a obine energie, dar creterea numrului de celule se face foarte lent. Dac mediul de fermentare este puternic aerat atunci are loc efectul Pasteur, prin care se observ conversia fermentaiei n respiraie. Oxidarea se face pn la produii finali CO2 i H2O, iar cantitatea de energie este mult mai mare, pentru acelai echivalent energetic consumndu-se o cantitate mai mic de zahr. 5

Microbiologie general Note de curs, CEPA II

Conf. univ. dr. Marian JELEA

n practica vinificrii, atunci cnd fermentaia decurge lent, ca rezultat al prezenei n mediu a unui numr mic de celule, se poate stimula creterea prin aerare. n industriile fermentative (spirt, vin, bere) nu se urmrete obinerea de biomas celular; de aceea, condiiile sunt anaerobe, pentru ca o cantitate mare de zahr s fie transformat n alcool etilic. La fabricarea drojdiei comprimate sau a drojdiei furajere, pentru obinerea unei cantiti mari de biomas, se procedeaz la aerarea mediilor nutritive. Factorii fizici i chimici Fermentaia alcoolic este influenat i de factori fizici i chimici care acioneaz att asupra vitezei de fermentare ct i asupra bilanului masic i a raportului dintre produii primari i secundari. 1. Compoziia mediului de fermentare Componentele mediului nutritiv pot fi metabolizate n mod diferit. Acesta este motivul pentru care la vinuri, de exemplu, n funcie de calitatea mustului (care este influenat de soiul i gradul de coacere a strugurilor), apar diferene de arom, buchet. Din punct de vedere al compoziiei mediului urmtorii factori au un rol deosebit: concentraia n zahr, influeneaz direct proporional viteza de fermentare atunci cnd se situeaz ntre 5-12%. Cu creterea concentraiei de zahr unele drojdii mai sensibile sunt inhibate n activitate. Drojdiile fermentative sunt osmotolerante i produc fermentaia n condiii bune a mustului de struguri cu o concentraie de 170-250 g zahr/dm3. Substraturi folosite industrial n fermentaia alcoolic: o mustul de struguri la fabricarea vinului; o mustul de mal cu coninut de maltoz (80% din subst. solubil) la fabricarea berii; o melasa (cu 45-55% zaharoz necristalizat) spirt i a drojdie comprimat; o plmezi amidonoase (hidrolizate mai nti enzimatic, cu obinere de glucoz, maltoz, dextrine) alcool etilic; o zerul rezultat de la fabricarea brnzeturilor (cu coninut de 4,7% lactoz) alcool etilic (ageni de fermentare drojdii din genul Kluyveromyces, productoare de lactaz); o celuloza (dup hidroliza chimic/enzimatic din care rezult celobioz i cellodextrine) alcool carburant. concentraia n alcool: n mediile fermentate cu microbiot natural, dac se ajunge la o concentraie alcoolic de 4-6o, se produce o ncetinire a fermentaiei drojdiilor care nu au rezisten la alcool (Kloeckera, Torulopsis, Hansenula), iar fermentarea este continuat de drojdii alcoolorezistente, pn la acumularea a 18-20o alcool (g alcool absolut/100 ml). 2. pH-ul mediului determin dou forme ale fermentrii: o fermentarea alcoolic propriu-zis, ce se desfoar la pH 3,5-5, cnd produsul principal este alcoolul etilic i dioxidul de carbon, cu produi secundari n cantiti mici; o fermentarea la pH alcalin cnd n afar de alcool etilic i dioxid de carbon, se formeaz n cantitate mai mare glicerol (pn la 30% din zahrul fermentat). Mustul de struguri are un pH acid, 3,6, de aceea la fabricarea vinurilor drojdiile sunt avantajate avnd cele mai bune condiii de dezvoltare i activitate metabolic. 3. Substanele chimice existente sau adugate mediului pot influena procesul fermentativ: o fosfaii au o influen pozitiv deoarece particip la formarea acizilor adenilici i la formarea esterilor fosforici ai glucidelor, forme sub care acestea sunt transportate n celule i fermentate; o dioxidul de sulf se adaug n cantiti de 200-500 mgxdm 3 pentru a favoriza activitatea drojdiilor fermentative, care spre deosebire de alte drojdii sunt sulforezistente. 6

Microbiologie general Note de curs, CEPA II

Conf. univ. dr. Marian JELEA

4. Temperatura. Enzimele sistemului zimazic prezint un optim de activitate (determinat genetic). o 28-30 oC, pentru drojdia de spirt i panificaie (S. cerevisiae); o 15-20 oC, pentru drojdiile de vin (S. cerevisiae var. ellipsoideus i oviformis), care produc o fermentare mai lent, dar conduc la obinerea unui vin de calitate, deoarece la temperaturi mai sczute se evit pierderile de substane volatile; o 6-12 oC, pentru drojdia de bere (S. carlsbergensis). Biochimismul formrii produilor principali i secundari n fermentaia alcoolic propriu-zis Conversia prin fermentare n mediu acid a glucidelor, catalizat de ctre enzime din drojdii, se desfoar n 5 etape: 1. transformarea diferitelor tipuri de glucide n esteri ai glucozei i formarea esterului fructofuranozo-1,6-difosfat. Se consum energie prin transformarea ATP-ului n ADP; 2. formarea triozelor: aldehid fosfogliceric i fosfodioxiaceton; 3. transformarea triozelor pn la formarea de acid piruvic. Energia eliberat n procesul de oxidoreducere este nmagazinat prin procesul de fosforilare; 4. decarboxilarea acidului piruvic i formarea de aldehid acetic; 5. aldehida acetic se reduce devenind acceptor de hidrogen i se formeaz alcoolul etilic. Reacia global a fermentaiei alcoolice n mediu acid este:
2 ADP 2 Pi C 6 H 12 O 6 2C 2 H 5 OH 2CO 2 2ATP 117 kJ

Formarea produilor secundari n fermentaia alcoolic rezult o diversitate de produi secundari. n vinuri au fost identificate prin cromatografie 300-500 de substane diferite care rezult prin fermentare sau depind de compoziia mediului. Principalii produi secundari sunt: glicerolul, care se acumuleaz n cantiti de 3,3 g/100 g glucoz fermentat i are un rol benefic asupra calitii vinului, conferindu-i catifelaj; aldehidele, din care cea mai important este aldehida acetic i la concentraii ce depesc 2,5 mg/dm3 influeneaz indirect gustul vinului, deoarece prin oxidare duce la formarea de acid acetic; acizii, care provin din must i din procesul fermentativ; ei dau aciditate vinului (acid acetic, formic, propionic, butiric) precum i o aciditate fix (acid lactic, succinic), care se regsete n aciditatea total a vinului. Acidul lactic se poate acumula n cantiti de 20 mg/dm3, iar acidul acetic se acumuleaz n cantiti de 80-120 mg/dm3. Prin formarea esterilor (acetat de etil), gustul vinului este depreciat. Acidul succinic se formeaz din zahr sau din aminoacizi i poate reprezenta 0,7% din cantitatea de zahr fermentat. alcooli superiori, care rezult din surse hidrocarbonatate i din aminoacizi. La fabricarea spirtului se acumuleaz urmtorii alcooli superiori: amilic, izoamilic, propanolol (contribuie la formarea unor substane de arom). Alcooli superiori distilai la 130oC formeaz o fraciune numit ulei de fuzel, folosit n industria vopselelor. La fabricarea vinului, cantitatea de alcooli superiori este de 250 mg/dm3. Ei sunt precursori de arom: din fenilalanin se formeaz alcool feniletilic, care d arom de trandafir.

Microbiologie general Note de curs, CEPA II

Conf. univ. dr. Marian JELEA

diacetilul i acetona se formeaz atunci cnd numrul de celule de drojdie este prea mare. La concentraii de 0,4 mg/dm3 d gust de diacetil, iar la concentraii mai mari d gust neplcut, mai ales la bere. mercaptanii, apar cnd gruparea OH din alcooli este nlocuit cu gruparea SH. Prezena acestor substane d gust neplcut i se datoreaz aciunii unor drojdii cu caliti nedorite. Bilanul masic al fermentaiei alcoolice este urmtorul: C6H12O6 2CH3-CH2-OH + 2CO2 180 g 2 x 46 + 2 x 44 teoretic = (92/180) x 100 = 51,1. Randamentul practic este de (0,64-0,67) x teoretic , deoarece nu toat cantitatea de zahr este transformat n alcool. O parte din zahr este transformat n produi secundari, n produi de biosintez intracelulari (biomas), iar o alt cantitate este transformat prin respiraie n produi finali. Bilanul energetic al fermentaiei alcoolice. Din punct de vedere energetic, fermentaia alcoolic nu este avantajoas pentru celula de drojdie, deoarece, n anaerobioz, prin fermentarea unui mol de glucoz celula consum 2 moli de ATP (n etapa de formare a esterilor fosforici), apoi nmagazineaz energia eliberat n 4 moli de ATP, astfel nct ctigul este de 2 moli ATP/mol glucoz fermentat. Energia potenial a glucozei se regsete n proporie de 92,5% n alcool etilic (alcoolul etilic are o putere mare energetic, de 1363 kJ/mol alcool), 2,5-3% din energie este nmagazinat n ATP, iar restul se regsete n produse secundare sau se pierde sub form de cldur. Fermentaia n mediul alcalin Este o derivat de la fermentaia propriu-zis, atunci cnd pH-ul mediului este alcalin. Acest lucru se obine prin adugare de Na2CO3 3%, iar din glucoz se formeaz alcool etilic, glicerol, acid acetic i dioxid de carbon. Formarea glicerolului n cantiti mai mari este datorat reaciilor de oxidoreducere ale aldehidei acetice n mediu alcalin (reacie Canizzaro): CH3-CHO O CH3-COOH + | CH3-CHO H2 CH3-CH2OH Cultura de Zygosaccharomyces acidifaciens, folosit n primul rzboi mondial la obinerea glicerinei (folosit la obinerea nitroglicerinei), poate produce prin fermentarea glucidelor, n mediu alcalin, aproximativ 30 g glicerol/dm3. Fermentaia sulfitic Poate avea loc la pstrarea marcurilor de fructe n prezena SO2 (sulfit), cnd aldehida acetic formeaz n prezena sulfitului de sodiu un compus sulfitic: OH CH3-CHO + NaHSO3 CH3-C-H NaSO3 n aceste condiii se reduce cantitatea de alcool etilic i crete cantitatea de glicerol. n afar de aspectele pozitive ale fermentaiei alcoolice (fabricarea spirtului, vinului, distilatelor, berii, pinii), aceasta poate prezenta i aspecte negative, atunci cnd se produce fermentarea spontan a unor produse bogate n zahr (siropuri, dulceuri, compoturi, miere). n acest caz fermentarea este determinat de drojdii osmotolerante, care produc prin fermentare alcool etilic, CO2 i o cantitate apreciabil de acid acetic, alternd produsele. 8

Microbiologie general Note de curs, CEPA II

Conf. univ. dr. Marian JELEA

Fermentaii alcoolice neconvenionale produse de bacterii Exist bacterii care pot produce cantiti apreciabile (10o alcool): Bacillus macerans, Leuconostoc, Clostridium acetono-etilicus, Zymomonas mobilis, Z. anaerobica i care pot fi folosite la fermentarea derivatelor celulozice, pentru obinerea de alcool carburant. Aceti alcooli au ntrebuinri industriale, nu i alimentare, deoarece bacteriile nu produc i substane secundare de arom, iar randamentul de conversie este mai mic dect al drojdiilor.

BIOCHIMISMUL FERMENTAIEI ALCOOLICE

REACIA GLOBAL A FERMENTAIEI ALCOOLICE N MEDIU ACID

2 Pi C6 H 12O6 2 ADP 2C2 H 5OH 2CO2 2 ATP 117 kJ

Microbiologie general Note de curs, CEPA II Fermentaia lactic

Conf. univ. dr. Marian JELEA

Fermentaia lactic este un proces anaerob prin care glucide le fermentescibile sunt metabolizate sub aciunea echipamentului enzimatic al microorganismelor n acid lactic ca produs principal i produse secundare, cum ar fi: diacetil, aceton, acid acetic, alcool etilic i CO2. Calea metabolic de producere a acidului lactic este frecvent ntlnit n lumea microbian. Randamente superioare de convertire a glucidelor n acid lactic sunt ntlnite la bacterii i mucegaiuri. Bacteriile lactice, considerate ageni tipici ai fermentaiei, sunt folosite industrial n biotehnologii alimentare, la industrializarea laptelui i a crnii, n panificaie, la conservarea produselor vegetale i la obinerea acidului lactic. Mucegaiurile selecionate ale genurilor Aspergillus, Penicillium i Mucor pot fi cultivate submers cu aerare dirijat, pentru obinerea industrial a acidului lactic. n condiii naturale, acidul lactic se poate forma i n esutul muscular prin procesul de glicoliz, prin secvene biochimice catalizate de enzime similare cu cele ale celulei microbiene. Caracterele morfo-fiziologice generale ale bacteriilor lactice. Bacteriile lactice sunt foarte rspndite n natur n diferite biotopuri; aparatul foliar al plantelor, microbiota intestinal (in primii ani de via sau cnd n alimentaie predomin laptele), cavitatea bucal, suprafaa pielii. Dintre sursele alimentare permanent asociate cu bacteriile lactice amintim laptele, n care bacteriile lactice prezente pe canalele galactofore sunt antrenate la mulgere, i legumele (varz, castravei .a.). Caracterele morfologice. Bacteriile lactice prezint heterogenitate morfologic; principalele forme sunt derivate de la forma coccus: streptococi (genul Lactococcus i Streptococcus), diplococi (genul Leuconostoc), tetrade (genul Pediococcus). Numeroase alte bacterii lactice se prezint sub form cilindric, de bastonae cu dimensiuni variabile, izolate sau formnd lanuri lungi (genul Lactobacillus). Caracterele fiziologice. Bacteriile lactice sunt pretenioase din punct de vedere nutritiv i nmulirea lor are loc n medii cu compoziie chimic complex. Ca surse de carbon i energie, bacteriile lactice pot s produc asimilarea sau fermentarea pentozelor (riboz, xiloz, arabinoz), a hexozelor (glucoz, galactoz), a diglucidelor (lactoz, maltoz, zaharoz). Dintre acizi, acidul malic poate fi transformat n acid lactic, iar acidul citric n aceton i diacetil. Acidul lactic nu poate fi folosit de ctre bacteriile productoare i acumularea sa prin fermentare conduce la inhibarea nmulirii i la ncetinirea vitezei de fermentaie. Ca surse de azot, bacteriile lactice prefer aminoacizi, peptide i amide, fr s poat folosi srurile amoniacale. Bacteriile lactice au enzime proteolitice intracelulare, care pot avea un rol pozitiv la maturarea brnzeturilor, dup eliberarea lor din celulele autolizate. Specia Lactobacillus casei poate produce o hidroliz enzimatic a cazeinei. Bacteriile lactice, n general, i cete termofile, n special, necesit prezena n mediu a unor factori de cretere (vitaminele: B2 i B6, biotina, acidul para-amino-benzoic, acidul folic, acidul pantotenic). Bacteriile lactice sunt acidotolerante, valorile minime de pH la care are loc creterea fiind de 4,3 - 4,8, pentru lactococi, i 3,8 - 4,4, pentru lactobacili, cu valori optime n domeniul de pH = 4 - 6. n report cu oxigenul din aer, bacteriile lactice sunt anaerobe sau facultativ anaerobe. Prin cretere n medii lichide (bere, vin, sucuri) dau o tulbureal persistent i acrire, iar prin dezvoltarea n lapte produc coagularea acid a cazeinei cnd pH-ul se reduce la 4,6, ca urmare a formrii de acid lactic. Bacteriile lactice sunt adaptate s creasc ntr-un domeniu larg de 10

Microbiologie general Note de curs, CEPA II

Conf. univ. dr. Marian JELEA

temperaturi (0...55 0C), cu valori optime n domeniul mezofil (20...25 0C - streptobacterii, 30...35 0C - lactococi) sau termofil (35...45 0C - lactobacterii). Sunt bacterii nesporulate i pot fi inactivate pe cale termic la temperaturi mai mari de 65 0C (n 30 de minute) sau la 72...740C, n 15-20 de secunde (regim de pasteurizare a laptelui). Caracterele taxonomice i clasificarea bacteriilor lactice. Dup punerea n eviden a bacteriilor lactice de ctre Louis Pasteur, n 1875, ca ageni de acrire ai berii, muli cercettori au studiat aceste bacterii att de rspndite n natur. O clasificare de referin aparine lui Orla Jensen (1919), care mparte bacteriile lactice n dou mari grupe: - bacterii lactice adevrate, Gram-pozitive, facultativ anaerobe, care produc numai acid lactic cu un randament de 90-100% din zahrul consumat. Genunile mai importante sunt Thermobacterium i Streptobacterium, n care erau inclui lactobacilii, streptococii lactici (genul Streptococcus), precum i reprezentanii genurilor Betacoccus (actual Leuconostoc) i Tetracoccus (actual Pediococcus); - pseudofermeni lactici (bacterii lactice atipice), care produc prin fermentaie cantiti mici de acid lactic, i, n cantiti superioare, gaze: CO2, H2, acid acetic a. Sunt bacterii Gramnegative, aerobe. n aceast grup erau incluse bacteriile coliforme cu genul Escherichia i Aerogenes (actual Enterobacter). O alt clasificare, cea a lui Bergey, separ bacteriile lactice adevrate n familia Lactobacteriaceae, n timp ce bacteriile coliforme se regsesc n familia Enterobacteriaceae. Cea mai recent clasificare aparine tui Kandler i Weiss (1986), care, n afar de proprietile fiziologice i tinctoriale ale bacteriilor lactice, are la baz cunoaterea procentual a coninutului de guanin i citozin din structura acizilor nucleici, criteriu taxonomic stabil, pe baza cruia s-au putut constata similitudini sau diferenieri ntre speciile cunoscute. Conform acestei clasificri, bacteriile lactice sunt incluse n familia LACTOBACTERIACEAE cu mai multe genuri: 1. Genul Streptococcus cuprinde: - grupul streptococilor lactici inclui n genul Lactococcus cu speciile: Lactococcus lactis; Lactococcus lactis biovar diacetilactis; Lactococcus lactis biovar acetoinicus i Lactococcus cremoris (sin. Str. cremoris - streptococul smntnii); - grupul viridans, bacterii ce aparin genului Streptococcus, avnd ca specii importante pe: Streptococcus salivarius subsp. thermophillus (SST) (sin. Streptococcus thermophillus) cultur folosit la fabricarea iaurtului i Streptococcus bovis; - grupul streptococilor fecali, denumii i enterococi, cu specia reprezentativ Streptococcus fecalis; - grupul streptococilor patogeni, cu speciile Streptococcus pyogenes (agentul scarlatinei) i Streptococcus agalactiae (agentul mastitei, transmisibil prin laptele colectat de la vaci bolnave). 2. Genul Lactobacillus (sin. Lactobacterium) include aproximativ 50 de specii clasificate n funcie de temperatura optim de activitate i de modul de fermentare a glucidelor n homofermentativi - lactobacili care produc numai acid lactic i cantiti minore de substane de arom - i heterofermentativi lactobacili productori de acid lactic, acid acetic, diacetil, CO2. Lactobacilii homofermentativi se pot clasifica astfel: - termofili (TO = 40.. .50 0C): - Lactobacillus delbrueckii subspecia delbrueckii; - Lactobacillus delbrueckii subspecia lactis; - Lactobacillus delbrueckii subspecia bulgaricum (LDB); - mezofili (TO = 30...35 0C): - Lactobacillus acidophillus; - Lactobacillus helveticus. 11

Microbiologie general Note de curs, CEPA II

Conf. univ. dr. Marian JELEA

Lactobacilii facultativ heterofermentativi mezofili sunt: - Lactobacillus casei; - Lactobacillus sake. Lactobacili heterofermentativi mezofili sunt: - Lactobacillus brevis; - Lactobacillus, Lb. fermenti; - Lb. inulinus (sin. Sporolactobacillus inulinus); - Lb. bifidum (sin. g. Bifidobacterium bifidus). 3. Genul Leuconostoc include bacterii sub form de coci, diplococi, heterofermentative mezofile - produc prin fermentaie acid lactic, alcool etilic, CO2, iar prin biosintez, poliglucidele de tip dextran. Dintre speciile cu importan practic se amintesc: Leuconostoc cremoris, Leuconostoc citrovorum i Leuconostoc paracitovorum, bacterii care pot folosi ca surse de carbon citraii; i subspeciile lui Leuconostoc mesenteroides i Leuconostoc dextranicum, productoare de dextran prin conversia zaharozei i polimerizarea dextrozei. 4. Genul Pediococcus include bacterii lactice homofermentative, mezofile, cu temperatura optim la 30 0C, cu speciile: Pediococcus acidilactici, Pediococcus cerevisiae. Ci de formare a produilor principali i secundari n fermentaia lactic. Biochimismul formrii produilor de fermentaie difer n funcie de echipamentul enzimatic al bacteriilor lactice i de sursele de carbon fermentescibile. Bacteriile lactice homofermentative produc fermentarea anaerob a hexozelor pe calea Embden - Mayerhof - Parnas (EMP) pn la formarea acidului piruvic, apoi, fiind lipsite de enzima piruvat decarboxilaz, reduc acidul piruvic, obinndu-se acidul lactic sub aciunea a dou lactatdehidrogenaze care necesit NAD/ NADP n calitate de coenzime: L-Lactatdehidrogenaz L(+)lactat + NAD <------------------------------> Piruvat + NADH+H+ L-Lactatdehidrogenaz + D(-)lactat + NAD <------------------------------> Piruvat + NADH+H+.
+

n fermentaia homolactic forma predominant a acidului lactic este dependent de stereospecificitatea lactatdehidrogenazei [lactococii formeaz L (+)-lactat i lactobacilii D (-) lactat], dar i de prezena lactat racemazei, care, atunci cnd este activ n celula microbian rezult prin fermentaie, amestecul racemic (D, L-lactat), conform reaciei: L(+)lactat <------------------------------> D(-)lactat Ecuaia global a fermentaiei homolactice este urmtoarea: C5H12O6 + 2 ADP + 2Pi 2 CH3-CHOH-COOH + 2 ATP + 75 kj Pentru a fi fermentate, glucoza, galactoza i lactoza pot fi transportate ca atare n celul, printr-un sistem activ de permeaze prezent la Streptococcus salivarius subspecia thermophillus i lactobacilii termofili, sau prin transport activ catalizat de sistemul fosfotransferaz - fosfoenolpiruvat (PT-PEP) prezent la bacterii ale genului Lactococcus i Lactobacillus sp., cu formarea esterilor fosforici. Lactoza sau lactozo-P n celula bacterian sub aciunea -galactozidazei (lactazei) este transformat n glucidele componente: -Galactozidaz Lactoza------------------------->Glucoz + galactoz 12

Microbiologie general Note de curs, CEPA II

Conf. univ. dr. Marian JELEA

n timp ce glucoza este metabolizat direct pe calea EMP, galactoza este transformat pe urmtoarele ci metabolice: a) calea D-tagatozei 6P (genul Leuconostoc); b) calea Leloir (SST, LDB, Leuconostoc); c) calea glicolitic (Embden Mayerhof Parnas) de fermentaie a glucozei. n fermentaia homolactic se pot forma, n cantiti mici, substane de arom, diacetil i aceton, fie prin metabolizarea glucidelor, fie a citrailor care asigur o surs suplimentar de acid piruvic. Bacteriile lactice heterofermentative produc fermentaia anaerob a glucidelor (pentoze, hexoze) pe calea pentozo-fosfatului (6P-gluconatului). n funcie de specie difer i natura produselor de fermentaie: - Lactobacillus brevis produce acid lactic, acid acetic i CO2; - Leuconostoc mesenteroides produce acid lactic, etanol i CO2; - Lactobacillus bifidus produce fermentare heterolitic pe calea fructozo 6P, fr formare de CO2. Bifidobacteriile, care reprezint 95% din microflora intestinal a sugarilor, pot fi folosite pentru obinerea unor produse lactate cu efect terapeutic (produse probiotice). Aplicaii practice ale fermentaiei lactice. Acidul lactic are multiple ntrebuinri: - n industria alimentar pentru acidifierea sucurilor i esenelor de fructe, limonadelor, bomboanelor; - n medicin, sub form de lactai de Ca i Fe, substane uor asimilabile de ctre organismul uman; - n industria chimic mordant la colorarea i imprimarea mtsii i a diferitelor textile; - n industria pielriei; - n industria panificaiei, paralel cu fermentaia alcoolic produs de drojdia de panificaie n aluat are loc activitatea fermentativ a bacteriilor lactice din microbiota finii sau a culturilor selecionate, contribuind la formarea aromei i la creterea n volum a pinii; - n industria extractiv, la fabricarea amidonului, n timpul operaiei de nmuiere a porumbului, prin adugarea de SO2 este inhibat dezvoltarea bacteriilor butirice i este favorizat dezvoltarea unei fermentaii lactice; lichidul obinut de la nmuierea porumbului se folosete n form concentrat ca adaos la obinerea mediilor de cultur a microorganismelor n industriile fermentative; - n industria laptelui bacteriile lactice, n special cele homofermentative, sub form de culturi pure selecionate, sunt folosite la obinerea produselor lactate acide: lapte acru, sana, chefir, lapte acidofil, iaurt, smntn fermentat, a untului i la fabricarea brnzeturilor; - prin fermentaia lactic spontan determinat de bacteriile lactice din microflora epifit a plantelor, se pot conserva prin murare varza, castraveii, tomatele, mslinele i poate avea loc nsilozarea furajelor verzi; - n vinificaie bacteriile lactice pot avea un efect pozitiv, reducnd aciditatea vinurilor prin transformarea acidului malic n acid lactic; - fermentaia lactic spontan nedirijat poate avea i un efect negativ, ducnd la alterarea unor produse (acrirea berii, borirea vinului) sau pierderi de zaharoz la difuziune, n industria zahrului. 13

Microbiologie general Note de curs, CEPA II

Conf. univ. dr. Marian JELEA

Calea Leloir de metabolizare a galactozei 14

Microbiologie general Note de curs, CEPA II

Conf. univ. dr. Marian JELEA

15

Microbiologie general Note de curs, CEPA II

Conf. univ. dr. Marian JELEA

PROCESE METABOLICE AEROBE (FERMENTAII OXIDATIVE)

Spre deosebire de fermentaiile propriu-zise anaerobe, fermentaiile acetic, gluconic, citric .a. sunt procese oxidative simple, care se desfoar n condiii aerobe i se difereniaz de metabolismul oxidativ (respiraie) prin aceea c oxidarea este limitat, rezultnd n condiii industriale acizi organici cu mare valoare economic. Fermentaia acetic Fermentaia acetic este un proces aerob prin care substratul (alcoolul etilic) este oxidat n prezena oxigenului din aer, sub aciunea echipamentului enzimatic al bacteriilor acetice, n acid acetic ca produs principal al fermentaiei. Caracterele morfologice i fiziologice ale bacteriilor acetice. Bacteriile acetice sunt bacterii strict aerobe, sub form de bastonae, gram-negative, grupate n perechi sau lanuri, cu dimensiuni variabile (0,5-0,8)x(80,9-4,2) m. Pot fi imobile sau mobile, cu cili polari sau peritrichi. n mediu acid, n timp, pot aprea forme de involuie, ramificate, care i pierd capacitatea de reproducere. n medii lichide (staionar) se dezvolt sub forma unui voal fragil care, cu creterea n dimensiuni, ascensioneaz pe pereii vasului (Acetobacter ascendens, A. aceti). Alte specii, A.xylinum, A. xilinoides formeaz, n vin oeit sau n oet, un strat gelatinos de natur -glucanic (coloidal i fibros). Bacteriile acetice sunt mezofile (temperatura optim 30 oC) i produc fermentaia acetic ntr-un domeniu larg de temperaturi, 0...35 oC. Au o termorezisten sczut n mediu lichid cu pH acid, inactivitatea lor avnd loc la 60 oC ntr-un minut, n timp ce bacteriile reinute pe suporturi solide (doage de lemn) sunt inactivate la temperaturi mai ridicate (100 oC). Bacteriile acetice tolerante la acid i concentraii de pn la 2o acetice activeaz creterea celular. Rezistena la acid acetic se poate explica prin aceea c membrana acestor bacterii are un coninut ridicat de acizi grai saturai, fiind relativ impermeabil la acid acetic. Valoarea optim de pH pentru cretere este 5,5 i pH-ul limit 2,5. Echipamentul enzimatic, deosebit de complex (printre care dehidrogenaze localizate n sisteme membranare cuplate cu lanul citocromic, enzime ale ciclului Krebs .a.), permite oxidarea a aproximativ 80 de compui (alcooli, glucide, acizi organici). Dintre sursele de carbon utilizate preferenial, alcoolul etilic este oxidat la acid acetic, iar glucoza la acid gluconic, acid 5-cetogluconic, acid 2,5-cetogluconic. Bacteriile din genul Acetobacter pot s oxideze i acetaii cnd alcoolul etilic a fost consumat din mediu, deoarece alcoolul etilic inhib activitatea enzimelor de oxidare a acetatului la CO2 i H2O. Acidul acetic inhib propria sa oxidare la concentraii mai mari de 8o acetice, la pH = 3. Ca surse de azot, bacteriile acetice, pot s foloseasc srurile de amoniu, aminoacizii i peptidele. De aceea ele se pot dezvolta n medii minerale numai dac se adaug extract de drojdie. Bacteriile acetice necesit pentru cretere vitaminele: acid paraaminobenzioc, niacin, tiamin i acid pantotenic. Bacteriile sunt rspndite n natur pe produse vegetale (fructe, frunze, flori) i transportul lor este favorizat de insecte (Drosophilla melanogaster musculia de oet) i nematode (Anqvilula aceti). Clasificarea tehnologic a bacteriilor acetice, propus de W. Hennerberg n patru grupe, n funcie de cantitatea de acid acetic produs, concentraia de alcool din mediu i biotop, este urmtoarea: bacterii acetice din plmad: Gluconobacter suboxidans i Acetobacter industrium; 16

Microbiologie general Note de curs, CEPA II

Conf. univ. dr. Marian JELEA

bacterii acetice din bere: A. aceti suport 11 % alcool i poate produce 6,6% acid acetic i A.pasteurianum suport 9,5% alcool i produce 6,2% acid acetic. Alte specii: A.ktzingianum, A. rancens; bacterii acetice din vin: A. orleans poate produce 9,3% acid acetic; A. xilinum suport 7% alcool i produce 4,5o acid acetic i ali produi secundari; bacterii acetice de fermentaie rapid, izolate din acetatoare: au o mare capacitate de acidifiere, cu speciile A. schtzenbachii (11-14o acetice), A. acetigenum, A. curvum. Fermentaia acetic se desfoar dup reacia global: CH3-CH2-OH + O2 CH3+COOH + H2O Din punct de vedere energetic, prin oxidarea alcoolului etilic rezult o energie de 455 kJ/mol (6 moli ATP). Alcoolul etilic este oxidat n aldehid acetic n prezena alcooldehidrogenazei. Are loc legarea chimic a unui mol de ap i se formeaz acetaldehida hidratat, care, n prezena aldehid-dehidrogenazei, cedeaz 2H+ care este transferat de ctre enzimele catenei respiratorii celulare pe oxigenul molecular, acumulndu-se acid acetic produsul principal al fermentaiei. Importana practic a fermentaiei acetice. Fermentaia acetic este utilizat industrial la fabricarea oetului, cnd se pot folosi ca materii prime soluii alcoolice, vin, cidru sau materii prime amidonoase (n prealabil zaharificate i fermentate alcoolic cu drojdii). Fermentaia acetic are loc n aparate numite acetatoare. Un acetator simplu este format dintrun vas tronconic nalt, umplut cu rondele de stejar, prevzut cu sistem de aerare i recirculare a mediului de cultur, pn la atingerea concentraiei de 9-10 grade acetice. La pornirea fermentaiei se face sterilizarea rondelelor i pulverizarea suspensiei de bacterii acetice, care rmn fixate n fibrele lemnoase i, n prezena mediului rspndit uniform i a aerului, produc oetul. n acest procedeu randamentul de conversie a alcoolului la acid acetic este de 75-80%. Performane superioare se obin cu generatorul de oet Frings i cu alte sisteme n care randamentul de conversie este de 95%. Dup obinere, oetul i mbuntete calitile senzoriale, ca urmare a reaciilor de esterificare i de formare a compuilor de arom. Fermentaia acetic spontan, ntlnit la fermentarea boabelor de cacao, are un rol pozitiv n formarea compuilor de arom i la obinerea unor boabe de calitate superioar. Bacteriile acetice A. xylinum pot fi folosite pentru obinerea de -glucani, utilizai la fabricarea de membrane filtrante din acetat de celuloz. Gluconobacter suboxidans poate fi folosit pentru oxidarea manitolului n fructoz i a glicerolului n dihidroxilaceton, utilizat n cosmetic. Fermentaia acetic a vinului i berii pstrate cu gol de aer conduce la deprecierea calitii acestor buturi. Dei bacteriile acetice aerobe se dezvolt la suprafa, acrirea are loc n ntregul volum. Acidul acetic format sub voal are o densitate mai mare dect a alcoolului, ceea ce conduce la o circulaie a compuilor reactani care conduce la acrirea total a produsului. Fermentaia gluconic Fermentaia gluconic este un proces oxidativ simplu prin care glucoza, n prezena oxigenului din aer i a sistemului enzimatic al microorganismelor selecionate, este transformat n acid gluconic ca produs principal. Agenii tipici ai fermentaiei gluconice sunt bacteriile din genurile Gluconobacter (Acetomonas) i Moraxella i mucegaiurile din genurile Aspergillus (A. niger, A. phoenicis, A.Wentii) i Penicillium (P. chrysogenum, P. luteum). Importana practic a fermentaiei gluconice. Acidul gluconic se obine pe cale fermentativ prin culturi de suprafa, folosind ca substrat melasa diluat cu 10-20% 17

Microbiologie general Note de curs, CEPA II

Conf. univ. dr. Marian JELEA

zaharoz, repartizat n tvi cu suprafa mare. Procesul este lent, de aceea a fost nlocuit cu metode submerse cu aerare, n bioreactoare n care procesul este accelerat i randamentul de conversie al glucozei la acid gluconic este de 80-90%, n timp de 18 ore, la 25-30oC i la pH=3. Prin adugare de carbonat de calciu se formeaz gluconatul de calciu, din care, prin procedee chimice, se purific acidul gluconic. Principalele aplicaii ale acidului gluconic sunt urmtoarele: folosirea gluconailor de Ca, Fe, n terapeutic; obinerea prafului de copt; folosirea glucono-lactonei, produs intermediar al fermentaiei, n industria preparatelor de carne, crora le confer un gust acrior, mpiedicnd, n acelai timp, activitatea bacteriilor de putrefacie i meninnd culoarea roie natural a compoziiei salamurilor (tip Tivoli); folosirea n amestec a acidului gluconic cu soda caustic pentru ndeprtarea rapid a srurilor insolubile de magneziu; folosirea acidului 2 ceto-gluconic la obinerea acidului D-araboascorbic, substan cu efect antioxidant, care previne rncezirea alimentelor cu coninut ridicat de lipide. Fermentaia citric Fermentaia citric este un proces oxidativ complex prin care substratul glucidic (zaharoza) este metabolizat la compui intermediari de oxidare, cu acumulare n mediu a acidului citric ca produs principal. Ageni tipici ai fermentaiei citrice sunt tulpinile selecionate ale speciei Aspergillus niger care produc activ citrat sintetaz. Acidul citric se poate obine cu un bun randament (52 g/dm3) i prin cultivarea tulpinilor de drojdii din specia Candida oleophilla pe medii cu parafine. Producerea industrial a acidului citric. Producerea acidului citric cu ajutorul mucegaiurilor din genul Aspergillusi este cunoscut din 1913 (patent Zahoski) i aplicarea industrial n 1923 se datoreaz cercetrilor efectuate de Currie. n 1928 s-a construit o fabric la Praga. n ara noastr exist fabrica de acid citric de la Giurgiu, care, prin procedeul de culturi de suprafa, asigur necesarul de acid citric pentru industria alimentar. Mediile cu melas diluat, tratate cu ferocianur de potasiu, dup sterilizare i rcire n tav, se inoculeaz cu spori de A. niger (3-4 g spori/100 m2 suprafa mediu) i fermentarea are loc la 30-35oC. La suprafa se dezvolt o derm cutat prin creterea aerob a miceliului vegetativ i reproductor. Fermentaia dureaz 6-8 zile, cu un randament de conversie a zaharozei n acid citric de 70-72% (1 m suprafa miceliu poate s produc 500-800 g acid citric n 24 h). Dup separare, biomasa poate fi valorificat ca surs de enzime/proteine, iar din mediul fermentat se separ, prin metode fizico-chimice, acidul citric cristalizat. Acidul citric se poate obine i prin metode submerse n bioreactoare cu aerare dirijat, prin procedee discontinue sau continue, cu reducerea perioadei de fermentaie i creterea randamentului la valori de 80-85% n acid citric. Importana fermentaiei citrice. Acidul citric este principalul acid folosit n industria alimentar pentru fabricarea buturilor rcoritoare i a produselor zaharoase, n calitate de stabilizant al culorii produselor pstrate n stare congelat i de anticoagulant al sngelui. n industria farmaceutic intr n componena pulberilor efervescente. Citratul de sodiu este recomandat n compoziia detergenilor, ca nlocuitor al fosfailor. Acidul citric sub form cristalizat, prin nclzire la 170oC, se transform n acid itaconic utilizat la fabricarea rinilor schimbtoare de ioni. Prin fermentaii oxidative se mai pot obine i ali acizi de exemplu acidul fumaric - cu culturi din genul Aspergillus i Penicillium, important pentru obinerea aldehidei maleice, materie prim pentru obinerea rinilor sintetice; acidul kojic - obinut prin cultivarea lui A.oryzae, folosit ca reactiv n chimia analitic i care intr n compoziia unor insecticide; 18

Microbiologie general Note de curs, CEPA II

Conf. univ. dr. Marian JELEA

acidul ustilagic - obinut cu culturi de micromicete ale genului Ustilago, folosit n industria parfumurilor. Aceste fermentaii, care au loc n mod spontan n condiii naturale, favorizeaz transformarea compuilor organici din materia nevi n compui mai simpli, accesibili pentru alte grupe de microorganisme, transformri ce permit un circuit natural al carbonului. TRANSFORMRI MICROBIENE ALE COMPUILOR ORGANICI MACROMOLECULARI Se apreciaz c prin fotosintez, energia radiaiilor solare care cad anual pe pmnt (echivalen cu 3x1024 J) este convertit n energia chimic a combinaiilor organice, cu acumularea a 2x1011 tone C/an. Din aceast biomas vegetal, cea mai mare parte o constituie celuloza, substanele pectice, amidonul i n cantiti mai reduse, lipidele, acizii nucleici .a. n condiii naturale dup moartea vieuitoarelor vegetale i animale, n diferitele habitaturi (sol, ap) se produc degradri microbiene specifice, cu formare de: produi intermediari (condiii de anaerobioz); produi finali, ca CO2 i H2O (condiii de aerobioz). n afar de substraturile direct fermentescibile (glucoz, zaharoz, lactoz, acizi organici) microorganismele pot aciona i asupra altor compui organici, fie n condiii dirijate, cnd se obin produse cu valoare economic, fie n condiii naturale, cnd au loc procese complexe cu rol vital n circuitul natural al elementelor (C, N, O, S, P) i meninerea vieii pe Pmnt. Descompunerea amidonului i a glicogenului Descompunerea acestor polioze au loc datorit unor microorganisme ce produc enzime extracelulare, care produc hidroliza acestor compui macromoleculari la molecule simple (glucoz, maltoz) transportabile prin membran i folosite n nutriie. Dintre enzimele microbiene care hidrolizeaz amidonul fac parte: -amilaza, amilaza i glucoamilaza, enzime extracelulare elaborate de bacterii, mucegaiuri i drojdii. Bacteriile genului Bacillus (B.subtilis, B.subtilis var. amyloliquefaciens, B.licheniformis, B.macerans, B.sthearothermophillus sunt productoare de -amilaz, enzim zaharogen care, prin hidroliza legturilor 1-4 glucozidice, elibereaz molecule de maltoz. Mucegaiurile Aspergillus, Mucor, Rhizopus produc mai ales -amilaz i glucoamilaz. Aspergillus niger i A oryzae produc -amilaze. Mucegaiurile A.awamori, A.usami, A.niger i Rhizopus delemar produc glucoamilaz. Se cunosc peste 100 de specii de drojdii care produc -amilaz i glucoamilaz, dintre care mai importante sunt cele din genurile Saccharomycopsis (S.bispora, S.fibuligera), Schwanniomyces, Trichosporon i Candida. Hidroliza enzimatic a amidonului cu enzime vegetale (din mal) sau cu enzime microbiene, cu formare de glucide fermentescibile, este folosit n biotehnologia spirtului, a berii, a panificaiei sau pentru obinerea siropurilor dulci, a dextrinelor, a maltozei, a glucozei cristalizate .a. Descompunerea celulozei i hemicelulozei Celuloza este un poliglucid rspndit n materiile prime de origine vegetal (aproximativ 1/3) i n structura pereilor celulari ai fungilor. Celuloza ajuns n sol i n ape este transformat n timp, sub aciunea microorganismelor care produc enzime celulozolitice: micromicete-ageni ai putrezirii, bacterii aerobe i anaerobe. 19

Microbiologie general Note de curs, CEPA II

Conf. univ. dr. Marian JELEA

Produii intermedieari de hidroliz sunt metabolizai n mod difereniat, n funcie de natura microorganismelor i de prezena/absena oxigenului din aer. Degradarea aerob a celulozei se caracterizeaz prin formarea din celobioz sau glucoz, n prima etap, a hidroxiacizilordin care, prin oxidare, se elibereaz CO2 i H2O. Dintre bacteriile aerobe care asimileaz celuloza fac parte bacterii cu forme spiralate aparinnd genurilor: Cytofaga, Cellvibrio, Cellulomonas. Importan industrial o au bacteriile din genul Cellulomonas, care pot fi cultivate aerob pe deeuri vegetale, pe hrtie .a., iar biomasa rezultat prin nmulire este valoroas prin coninutul ridicat n proteine (46,2%). Dintre micromicete au activitate celulozolitic superioar specii ale genurilor: Botryotinia, Fusarium, Mucor, Rhizopus, Trichoderma i Tricothecium. Tulpini selecionate de micromicete ale genurilor Trichoderma i Aspergillus sunt bune productoare de celulaze i sunt folosite industrial ca surse de enzime. Degradarea anaerob a celulozei are loc permanent n sedimente i n mlul apelor, la fermentarea compostului, n rumenul erbivorelor, n profunzimea solului, n soluri inundate, lacuri termale. n transformarea celulozei se pot distinge trei etape, n funcie de natura produselor de fermentaie. Dup hidroliza celulozei la compui simpli, sub aciunea unei microbiote heterogene alctuite din bacterii anaerobe i facultativ anaerobe din familiile Enterobacteriaceae, Bacillaceae (genul Clostridium), se acumuleaz alcooli, acizi, CO2 i H2. Produsele rezultate n acest stadiu sunt folosite de bacteriile acetogene productoare de acid acetic pe cale anaerob, n a doua etap. n etapa a treia, denumit metanogen, sunt active bacteriile metanogene strict anaerobe din genul Methanobacterium cu speciile M.ruminantium, M.formicicum, M.mobilis, M.farkeri .a. Bacteriile anaerobe pot folosi acidul acetic ca surs energetic i produc metan. Se apreciaz c 73% din metan rezult din acidul acetic format n faza acetogen:
Methanosar CH3-COOH cina CH4 + CO2 bar ker i

Methanobacteriile pot forma metan prin reacia: 4CO + 2H2O Methanosarcina CH4 + 3CO2 thermoautotrophicum n afara acestor procese naturale, care explic formarea zcmintelor de metan, n ultimele decenii a luat amploare metanogeneza dirijat n scopul obinerii de biogaz, prin prelucrarea microbiologic a dejeciilor animale, cnd se realizeaz concomitent protecia mediului i valorificarea energetic a metanului i a hidrogenului.

20