Lp.

PRINCIPII GENERALE DE CONDUITĂ ÎN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

NORME DE PROTECŢIE A MUNCII IN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE
APARATURĂ/ ECHIPAMENTE, MATERIALE UTILIZATE ÎN LABORATOR

1. OBIECTIVELE – ţinta ale Laboratorului de Microbiologie:

- stabilirea prezenţei sau absenţei unor microorganisme într-un prelevat, pe un substrat etc,
- studierea în vederea identificării microorganismului: apartenenţa la gen, specie, subspecie, tip
etc, pe baza unor proprietăţi ale acestuia: caractere morfotinctoriale, caractere de cultură, caractere
biochimice (pigmentogeneza, sinteza de vitamine, aminoacizi, enzime, capacitatea de a fermenta un
anumit substrat etc), caractere antigenice, caractere de patogenitate, sensibilitate faţă de bacteriofagi,
caractere genetice,
- demonstrarea faptului ca bacteria izolată este sau nu implicată în procesul infecţios,
- testarea rezistenţei la antibiotice şi chimioterapice,
- monitorizarea evoluţiei sub tratament (eficienţa tratamentului antibacterian),
- identificarea contaminării de laborator,
- depistarea purtătorilor sănătoşi de germeni patogeni, în activitatea de prevenţie, profilaxie.
- existenţa grupurilor distincte de agenţi infecţioşi: bacterii, virusuri, fungi, protozoare.

Domenii, ramuri diferite ale activităţii umane unde sunt implicate astfel de microorganisme:
- medicina umană şi veterinară,
- epidemiologie,
- igienă,
- farmacie,
- industria alimentară,
- industria farmaceutică etc.

2. ORGANIZAREA ŞI FUNCŢIONAREA LABORATORULUI DE MICROBIOLOGIE:

- amplasarea clădirii (curenţi, lumină, incidenţa UV etc)
- planul laboratorului astfel întocmit, încât să respecte “circuitele” obligatorii: sens unic,
prevenirea contaminărilor încrucişate,
- compartimente distincte, cu destinatţe bine stabilită, corespunzătoare fiecărei activităţi:
 încăpere pentru recoltare probe,
 încăpere pentru recepţionarea, înregistrare, prelevatelor recoltate în afara laboratorului,
 încăpere pentru prelucrarea, însămânţarea prelevatelor,
 mai multe încăperi unde se efectuează tehnici specifice diferitelor etape de diagnostic
bacteriologic (microscopie, identificare pe baza reacţiilor exoenzimatice, reacţii imunologice etc).

LABORATORUL TREBUIE SĂ FUNCŢIONEZE CA UN TOT UNITAR, PENTRU

ASIGURAREA OBIECTIVELOR PRINCIPALE:
- Izolarea, identificarea şi testarea rezistenţei la antibiotice, a bacteriilor patogene cu rol etiologic,
- Prevenirea contaminării prelevatelor biologice,
- Prevenirea răspândirii germenilor patogeni în mediu,
- Prevenirea îmbolnăvirilor profesionale, a infecţiilor de laborator.

1
 3. NORME DE PROTECŢIE A MUNCII ÎN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

În Laboratorul de Microbiologie se lucrează cu:

- produse patologice (sânge, LCR (lichid cefalorahidian), materii fecale, urină, spută, colecţii
purulente etc),
- bacterii patogene, condiţionat patogene, levuri, fungi filamentoşi, izolaţi în culturi,
- microorganisme multidrog - rezistente, izolate de pacienţi,

Reguli impuse în activitatea de laborator, pentru eliminarea riscului de contaminare:

1. Strict interzis accesul persoanelor străine în laborator,
2. Toate prelevatele biologice trebuie considerate a fi cu potenţial infecţios,
3. Obligatorie purtarea echipamentului de protecţie (echipamentul de laborator să fie păstrat
separate de cel utilizat în exteriorul laboratorului),
4. Purtarea corectă a mănuşilor de latex (flacăra becului Bunsen),
5. Interzis a se mânca, consuma băuturi sau a se fuma în incinta laboratorului (în orice
încăpere din instituţia medicală),
6. Nu se recomandă purtarea unghiilor false, lentilelor de contact de către personalul care
manipulează tulpini bacteriene,
7. Interzisă pipetarea cu gura,
8. Nu se depun pe masă de lucru obiecte de uz personal (genţi, serviete, caiete, haine etc),
se depozitează în vestiar,
9. Manipularea produsului patologic se face “la flacara” becului Bunsen: orice manevră
implica flambarea gâtului recipientelor din sticlă, atât la deschidere, cât şi la închidere, a pipetelor etc,
şi sterilizarea prin încălzire la incandescenţă (“la roşu”) a ansei bacteriologice (bucla şi firul; portansa se
flambează pe 1/3 din lungimea sa),
10. Bucla ansei încărcată cu produs patologic sau cultură bacteriană, se introduce la “baza
flacărei” pentru a fi arsă, unde temperatura este mai scăzută (la vârful flacării există riscul improşcării
cu bacterii încă nedistruse termic şi contaminarea executantului şi mediului),
11. În momentul manipulării ansei bacteriologice încărcate cu produs biologic sau cultură
bacteriană nu se fac gesture ample, necontrolate, nu se lasă ansa din mână atâta timp cât este încarcată
cu produs contaminant. Este recomandat că aceste manevre să se execute în interiorul hotelor de
biosiguranţă,
12. Inainte de efectuarea unor tehnici de diagnostic bacteriologic, se pregăteşte protocolul de
lucru, se însuşesc etapele, se pregăteste tot materialul necesar, se controlează mental evoluţia paşilor,
pentru a nu exista niciun pericol de răspândire a germenilor sau a contaminărilor încrucişate,
13. Nu se aleargă, nu se fac mişcări bruşte în laborator, pentru a nu creea curenţi de aer ce ar
putea antrena bacterii cu transmitere aerogenă, cu potenţial infecţios,
14. Pipetele gradate, pipetele Pasteur, lamele, lamelele contaminate, după folosirea lor, se
imersează în soluţii dezinfectante proaspete, în cilindrii sau cristalizoare, care sa le acopere în proporţie
de peste ¾ din lungimea lor sau în întregime,
15. Toate obiectele utilizate în procesul de prelucrare a prelevatelor clinice, în scop
diagnostic, contaminate, se introduc în saci autoclavabili, apoi în găleţi cu capac (etichetate: “Sticlărie”
sau “Plastice”) şi transportate în Compartimentul Sterilizare, pentru a fi autoclavate,
16. Obiectele ascuţite, tăietoare, înţepătoare (ace de seringă, lame de bisturiu - unică
folosinţă) se elimină fără a fi atinse, în recipiente de plastic galbene (etichetate corect, cu sigla de
biosiguranţă) închise etanş şi eliminate la Deşeuri infecţioase, pentru a fi incinerate,
17. Se respectă codul culorilor în laborator: culoarea galbenă înseamnă material infecţios
(saci plietilenă de diverse capacităţi, cutii carton de transport deşeuri infecţioase, cutii plastic cu capac
pentru obiecte tăietoare, înţepătoare etc) şi culoarea neagră care înseamnă deşeuri menajere,
neinfecţioase,

2
 18. În cazul unei contaminări accidentale a unei suprafeţe de lucru cu produs infecţios, se
anunţa imediat persoană ierarhic superioară, se acoperă suprafaţa cu tifon, pânză, peste care se toarnă
soluţie dezinfectantă, proaspată, se menţine cel puţin 30 min, după care se trece la curăţarea suprafeţei
respective,
19. Se recomandă manipularea cu maxim de atenţie a substanţelor chimice caustice, toxice
(acizi, baze, aldehide, cetone, alcooli) folosind echipament adecvat: mănuşi, măşti, ochelari de protecţie
etc.
20. Manevrarea gazelor, a diferitelor aparate elctrice (autoclav, centrifugă, pompă de vid etc),
a sticlăriei de laborator, pentru evitarea oricărui tip de accident de laborator: explozii, incendii,
traumatisme.
21. Spălarea cu apă caldă şi săpun lichid dezinfectant a mâinilor, ori de câte ori se încheie o
etapă de lucru; se recomandă soluţii protectoare ale pielii după spălare şi ştergere cu prosop de hârtie de
unică folosinţă.
Respectarea cu stricteţe a Normelor de protecţie a muncii în Laboratorul de Microbiologie, evită
apariţia riscurilor de contaminare, accidentare a personalului, dar şi garantează lipsa contaminării cu
germeni externi ai probei biologice ce urmează a fi prelucrată, deci un diagnostic bacteriologic corect.

4. ECHIPAMENTE, APARATURĂ:
- microscoape, lupe,
- hote de siguranţă biologică (CLS. I, II, III),
- termostate, incubatoare: 28 ºC, 35 ºC, 37 ºC, 42 ºC, 56ºC,
- centrifugi (1000, 2500, 3000, 5000, 10 000- 20 000 tot/min, cu şi fără răcire),
- balanţe,
- aparat pentru demineralizare, distilare apă,
- aparat automat de preparare şi distribuire medii de cultură,
- pH- metru, psiho- higrometru,
- frigidere, congelatoare (- 20, - 80ºC),
- sisteme automate de izolare bacteriană
- sisteme automate de identificare bacteriană şi antibiograme rapide
- aparatură pentru sterilizare: etuve/pupinele, autoclave,
- lămpi UV,
- pompă de vid pentru sterilizare prin filtrare etc,
 Pentru materialul contaminat:
- găleţi de inox cu capac,
- saci autoclavabili,
- cilindri, cristalizoare cu soluţii dezinfectante (preparate zilnic),
 Instrumentar divers: foarfeci, bisturie, pense, seringi, anse bacteriologice,
 Truse de coloranţi,
 Diverse dispozitive: becuri Bunsen, trepiede, stative metalice, coşuri sârmă, cutii cu
capac pentru transportul probelor, casolete cu capac şi orificii,
 Termometre cameră, frigidere, tehnice (congelatoare, etuva),
 Inventar sticlărie de laborator: eprubete, tuburi de centrifugă, pipete gradate, pipete
Pasteur, baghete de sticlă, baloane, pahare, exicatoare, cristalizoare, cilindrii gradaţi, lame şi lamele
pentru ex. microscopic, camere de numărat,
 Plăci Petri 90mm diametru,
 Recoltoare sterile pentru diverse prelevate patologice: tampoane de exudat, recipiente
sterile, de unică utilizare, pentru urină, coprorecoltoare

3
Incubator Centrifugă

Distilator apă

4
pH metru laborator Hârtie indcatoare pH

5
 Etuva

Autoclav

6
Lampa sterilizare cu ultraviolete

Sticlărie laborator

7
 STERILIZAREA

Sterilizarea constă în distrugerea sau îndepărtarea microorganismelor dintr-un spaţiu sau de pe o

suprafaţă dată şi se realizează cu ajutorul agenţilor fizici sau chimici.

1. Sterilizarea prin agenţi fizici

a) Sterilizarea prin căldură uscată
Sterilizarea prin flambare.
- este cea mai simplă metodă de sterilizare
- constă în trecerea obiectivului prin flacără timp de câteva secunde, o dată sau de mai multe
ori, la intervale de 3-4 secunde
- se foloseşte pentru sterilizarea pipetelor Pasteur, a gurii tuburilor şi diferitelor flacoane şi
sticle în care urmează să se însămânţeze sau din care să se recolteze material microbian
Sterilizarea prin încălzire la roşu
- constă în ţinerea la flacără a unui obiect metalic până în momentul înroşirii
- este folosită pentru sterilizarea firului ansei de însămânţare, spatule, eprubete, cutii Petri,
pipete, mojare, etc.

b) Sterilizarea prin căldură umedă

Sterilizarea prin fierbere
- în acest scop sunt folosite sterilizatoarele electrice sau încălzite cu bec de gaz ori cu lampă de
spirt
- este folosită la sterilizarea instrumentelor metalice (pense, foarfece, bisturie), seringi
- se recomandă fierberea în apă distilată, deoarece împiedică ruginirea
- obiectele sterilizate prin fierbere nu pot fi folosite decât imediat după sterilizare
Sterilizarea prin vapori de apă sub presiune (autoclavarea)
- pentru a efectua acest tip de sterilizare se foloseşte autoclavul
- sterilizarea eficientă care asigură distrugerea celulelor vegetative şi a sporilor se realizează în
intervale care sunt în funcţie de următoarele presiuni şi temperaturi: - la 0,5 atmosfere
8
 (112ºC) – 90 minute; la 0,1 atmosfere (120ºC) – 30 minute; la 2,0 atmosfere (134ºC) – 10
minute.
- Obişnuit se practică sterilizarea prin autoclavare la o atmosferă (120ºC) timp de 30 de minute
- acest tip de sterilizare se foloseşte pentru sterilizarea mediilor de cultură, a obiectelor sau
aparatelor prevăzute cu garnituri de cauciuc (ex. baloane pentru recoltat sânge, filtre
bacteriologice), a culturilor vechi care nu mai sunt necesare.
Sterilizarea prin încălzire fracţionată sau tindalizare
- se utilizează când substanţele de sterilizat au un grad de termolabilitate, denaturându-se
printr-o încălzire la 120ºC
- mediile cu zaharuri se tindalizează la 100ºC, serul coagulat sau mediile cu ou: 70-80ºC
- acest tip de sterilizare constă în încălzirea la temperatură respectivă a materialelor de
sterilizat timp de 30-60 minute, la interval de 24 de ore, de trei ori consecutiv. În prima zi se
distrug formele vegetative, rezistând sporii, care se transformă după 24 de ore de incubaţie la
37ºC în forme vegetative, urmând a fi distruse prin încălzire a doua zi. A treia zi se distrug
ultimele forme vegetative rezultate din germinarea sporilor rămaşi de la a doua încălzire. În
intervale dintre încălziri mediile se ţin la termostat (37ºC) sau la temperatura camerei (18-
25ºC)
Pasteurizarea
- constă în încălzirea lichidelor la temperaturi între 55-95ºC, timp variabil (65ºC – timp de 30
minute, 90ºC – timp de câteva secunde)
- acest tip de sterilizare distruge numai formele vegetative şi nu este propriu-zis o sterilizare
- se foloseşte în special la sterilizarea laptelui

c) Sterilizarea prin raze ultraviolete

- radiaţiile ultraviolete sunt emise de lămpi bactericide cu lungimea de undă de 3537Å
- prin această metodă sunt distruse bacteriile, virusurile, ciupercile în câteva minute şi sporii
bacterieni în câteva ore
- aceste radiaţii sterilizează aerul şi suprafeţele netede şi curate
- sunt utilizate pentru sterilizarea aerului în laboratoare de microbiologie, în institute de
cercetare, boxe pentru nou-născuţi, săli chirurgicale.

2. Sterilizarea prin agenţi chimici

- pentru sterilizarea prin agenţi chimic se foloseşte termenul de dezinfecţie, care se practică în
laboratoarele de microbiologie pentru sterilizarea materialelor şi obiectelor întrebuinţate sau
infectate accidental
- niciodată această metodă nu este folosită pentru sterilizarea materialelor (instrumente, medii)
destinate cultivării sau manipulării microbilor.

FILTRAREA

- filtrarea se foloseşte pentru sterilizarea substanţelor ce se modifică sub acţiunea căldurii (este
o metodă mecanică de sterilizare)
- constă în trecerea unu lichid prin pereţii poroşi a unui filtru
- nu este o metodă perfectă deoarece microbii de dimensiuni foarte mici (virusurile şi unele
bacterii) pot traversa prin pereţii filtrelor
- tipuri de filtre: filtrele Chamberland, filtrele Berkefeld, plăcile filtrante din azbest pentru
filtrele Seitz, filtrele de sticlă, membrane filtrante