Lucrare Practică 2

Decontaminarea microbiană în laboratorul de microbiologie și practica

medicală
OBIECTIVE:
După această lucrare practică studenţii vor putea:
1. Să definească noţiunile: steril, sterilizare, septic/aseptic, dezinfecţie, antiseptizare,
prezervare.
2. Să aleagă corespunzător metodele de decontaminare în funcţie de condiţiile de risc şi
nivelul de eficienţa al acestora
3. Să discute despre decontaminarea mecanică
4. Să discute despre decontaminarea prin metode fizice
5. Să discute despre decontaminarea prin metode chimice

1. Definiţii

Contaminare prezenţa microorganismelor pe o suprafaţă

Colonizare prezenţa şi multiplicarea unui microorganism pe suprafaţa gazdei, farǎ reacţie din
partea acesteia
Septic contaminat cu microbi patogeni sau infectat (în cazul plăgilor)
Aseptic lipsit de microbi patogeni
Asepsie ansamblul metodelor prin care evităm contaminarea unui substrat sau a unor
elemente de mediu, a căror condiţie microbiologicǎ trebuie respectatǎ.
Antisepsie distrugerea sau îndepărtarea formelor vegetative ale microorganismelor, dar nu în
mod necesar şi a sporilor bacterieni, de pe suprafeţe vii.
Antiseptic substanţǎ antimicrobianǎ pentru aplicǎri pe suprafeţe vii (tegumente, mucoase,
plăgi).
Dezinfecţie distrugerea sau îndepărtarea formelor vegetative ale microorganismelor, dar nu
obligatoriu a sporilor bacterieni, de pe suprafeţe inerte
Dezinfectant substanţǎ antimicrobianǎ pentru aplicǎri pe suprafeţe inerte
Steril lipsit total de microorganisme viabile
Sterilizarea distrugerea sau îndepărtarea tuturor microorganismelor, de pe o suprafaţă sau
dintr-un obiect, inclusiv a sporilor bacterieni
Prezervare prevenirea multiplicării unor microorganisme în produse farmaceutice, alimentare.
2. Alegerea metodei de decontaminare se realizează în funcţie de riscul la care este expus
pacientul, risc de apariţie a unei infecţii în urma contaminării.

Conditie de Exemple: Nivel de Metoda

risc de eficienta al decontaminare
apariţie a decontaminarii
unei infecţii
Critice - obiecte ce realizează contact direct cu Înalt -  Sterilizare
(risc înalt de mediul intern: ace, intrumentar chirurgical, obligatoriu
apariţie a unei materiale de sutură, seringi, catetere
infecţii) venoase/arteriale, soluţii injectabile și
perfuzabile.
- medii de cultură, recipiente şi
instrumentar de laborator
Semicritice - obiecte ce realizează contact direct cu Înalt - ideal  Sterilizare
(risc mediu de mucoasa intactă: endoscop, laringoscop,
apariţie a unei cistoscop, aparatura pentru respirație Mediu  Dezinfecţie
infecţii) asistată, termometre, apăsătoare de limbă eficientă (de nivel
- obiecte care au venit în contact cu înalt)
sânge sau alte produse biologice
Necritice - obiecte care vin în contact cu tegumentul Jos  Dezinfecţie de
(risc minim de intact: electrozi, stetoscop, termometru, nivel mediu sau
apariţie a unei manșeta tensiometrului redus,
infecţii) - mainile personalului medical  Antiseptizare,
 Decontaminare
mecanică

Factori ce influenţează eficienţa decontaminării

 Intensitatea şi timpul de acţiune al agentului decontaminant – timpul de omorâre variază
invers proporţional cu intensitatea agenţilor antimicribieni
 Mediul în care acţionează (substanţele organice, turbiditatea mediului, duritatea apei, pH-ul
pot diminua acţiunea decontaminantului)
 Concentraţia microorganismelor (pentru aceeaşi intensitate a unui agent antimicrobian,
timpul de omorâre creşte proporţional cu concentraţia microbiană)
 Rezistenţa microorganismelor (bacteriile metabolic active sunt mai sensibile decât cele în
stare dormandă) – în ordinea descrescătoare a rezistenței: sporii bacterieni > micobacterii >
virusuri nude > bacterii gram-negative > fungi > bacterii gram pozitive > virusuri învelite

AGENŢI DE DECONTAMINARE
 Mecanici: spălare cu apă, săpun şi frecare;
 Fizici: căldura uscată/umedă; șocul rece; radiaţiile (neionizante/ionizante); ultrasunetele;
filtrarea;
 Chimici: substanţe antimicrobiene.

3. Decontaminarea mecanică – spălarea mâinilor – tipurile de spălare a mâinilor și etapele

spălării medicale
4. Decontaminarea prin metode fizice
A. CĂLDURA
I. CĂLDURA USCATĂ – realizează întotdeauna sterilizare
 Sterilizarea prin ardere în flacără
o Încălzirea la roşu – ansa de insămînțare (bucla), firul de platină, spatula
o Flambarea – gura eprubetelor şi flacoanelor, tija ansei de însămânţare
o Incinerarea – materiale de unică utilizare contaminate, reziduuri organice
 Sterilizarea prin aer cald (etuvă/ pupinel)
Etuva = cutie metalică cu pereţi dubli termoizolaţi, prevăzută cu rezistenţe electrice pentru
încălzirea aerului, un termostat ce permite menţinerea constantă a temperaturii la valoarea
programată şi un ventilator ce asigură uniformizarea temperaturii aerului în incintă
o Principiu: căldura uscată omoară microorganismele printr-un proces de oxidare a
proteinelor.
o Indicaţii:
 obiecte din sticlǎ (eprubete, pipete, baloane);
 obiecte din porţelan (mojar);
 uleiuri minerale
(se precizează că în prezent, instrumentarul metalic NU se mai sterilizează la pupinel).
o Contraindicaţii:
 soluţii apoase;
 obiecte din cauciuc sau cu garnituri din cauciuc;
 materiale din bumbac;
 materiale contaminate din laborator.
o Parametri:
 temperatura = 180 ° C;
 timpul de sterilizare = t egalizare a temperaturii + t omorâre a microbilor.
≈ forma, volumul, = constant
densitatea materialelor
o Etape de lucru:
 pregătirea lotului pentru sterilizare (dezinfecție, spălare, uscare, ambalare)
 aşezarea obiectelor ambalate şi a martorilor pe rafturile etuvei (cu spații pentru circulația
aerului)
 conectarea la sursa de curent şi programarea parametrilor sterilizării
 sterilizarea efectivă (timpul de sterilizare se măsoară din momentul atingerii temperaturii de
sterilizare)
 răcirea materialelor
 controlul martorilor
 etichetarea, sigilarea şi stocarea materialelor (24 h- materiale ambalate în cutii metalice
perforate sau în casolete cu colier; 2 luni - materiale ambalate în pungi hârtie—plastic
sudate).
o Controlul de calitate:
 martori fizici: termometrul, cronometrul
 martori chimici: substanțe chimice (impregnate pe benzi adezive) a căror culoare virează
când sunt respectaţi cei doi parametri ai sterilizării.
 martori biologici: spori de Bacillus atrophaeus (benzi de hârtie de filtru); după incheierea
ciclului de sterilizare, benzile sunt aseptic transferate în eprubete cu mediu de cultură si
incubate la 37oC, 48 h; mediul de cultură clar = sterilizare eficientă.
 Martorii fizici şi chimici trebuie utilizaţi la fiecare ciclu al sterilizării, iar martorii biologici
trebuie utilizaţi zilnic.
 II. CĂLDURA UMEDĂ – în funcție de temperatura utilizată, poate realiza sterilizare
sau dezinfecție.
 Sterilizarea cu vapori de apă sub presiune (autoclav)
Autoclavul = incintă cu ax vertical sau orizontal, cu pereţi metalici rezistenţi şi un sistem de
închidere ermetică, în care vaporii de apă se comprimă la presiunea necesară sterilizării.
o Principiu: căldura umedă omoară microorganismele prin coagularea proteinelor; căldura umedă
este mai nocivă decât cea uscată.
o Indicaţii:
 soluţii apoase (medii de cultură);
 sticlărie de laborator cu destinaţii speciale (pentru culturi de celule);
 bioreziduuri (culturi microbiene, produse biologice);
 material din bumbac;
 obiecte şi instrumente din cauciuc;
 instrumentar metalic chirurgical.
o Parametri:
 presiune 0,5 atm 1 atm 2 atm
 temperatură 115ºC 121ºC 134ºC
 timp de sterilizare = t egalizare a temperaturii + t omorâre a microbilor.
≈ natura, forma, = constant
volumul materialelor
o Etape de lucru:
 pregătirea lotului pentru sterilizare,
 verificarea nivelului apei din interiorul autoclavului,
 introducerea materialelor ambalate şi a martorilor,
 închiderea autoclavului, conectarea la sursa de curent și setarea parametrilor,
 evacuarea aerului din interiorul autoclavului va fi urmata de cresterea presiunii,
 sterilizarea propriu-zisă (timpul de sterilizare se măsoară din momentul atingerii
temperaturii și presiunii de sterilizare)
 deschiderea robinetului de evacuare a vaporilor va fi urmată de scăderea presiunii,
 deschiderea aparatului (imediat ce presiunea a ajuns la 0)
 uscarea materialelor (în autoclav, cu capacul deschis – vaporii de apă vor împiedica
depunerea pulberilor),
 verificarea martorilor,
 etichetarea, sigilarea şi stocarea materialelor (24 h- materiale ambalate în cutii metalice
perforate sau în casolete cu colier; 2 luni - materiale ambalate în pungi hârtie—plastic
sudate).
o Controlul de calitate:
 martori fizici: termometru, manometru, cronometru
 martori chimici: substante chimice (impregnate pe benzi adezive) a căror culoare virează
când sunt respectaţi cei trei parametri ai sterilizării. Testul Bowie-Dick evidențiază
eliminarea aerului rezidual și penetrarea eficientă a vaporilor în materialul sterilizat.
 martori biologici: spori de Geobacillus stearothermophilus în fiole cu medii de cultură și
indicator de pH; după încheierea ciclului de sterilizare, fiolele sunt incubate la 56oC, 48 h;
mediul de cultură clar = sterilizare eficientă.
 martorii fizici şi chimici (benzi adezive) trebuie utilizaţi la fiecare ciclu al sterilizării, iar
testul Bowie-Dick și martorii biologici trebuie utilizaţi zilnic.
 Tyndallizarea (sterilizarea fracţionată)
 Indicaţii: substanţe termolabile – alimente, medii de cultură suplimentate cu ser (mediul
Loeffler) sau cu ou (mediul Lowenstein-Jensen).
 Parametri: 30-60 min., 3-8 zile consecutiv, la 56-100ºC
  Principiu: în intervalul dintre expuneri, produsele sunt menţinute la temperatura camerei,
ceea ce permite germinarea sporilor, formele vegetative care rezultă fiind distruse la al
următoarele tratamente termice.
 Fierberea – este o metodă de dezinfecție
 omoară formele vegetative ale bacteriilor, aproape toate virusurile şi fungii în cca. 10
minute, virusul hepatitei B în cca. 30 minute
 Indicaţii: decontaminarea apei de băut, lenjeriei; fierul de călcat cu aburi distruge formele
vegetative bacteriene în 5-10 secunde.
 Parametri: 30 min., 100ºC
 Pasteurizarea – metodă de conservare a produselor alimentare lichide care folosește
acţiunea combinată a căldurii umede (60 oC - 135 oC) şi a frigului (4oC). Șocul termic
distruge formele vegetative dar nu și sporii bacterieni.

B. FRIGUL
- Refrigerarea (0oC – 7oC) - efect bacteriostatic - modalitate de conservare a culturilor
microbiene, produse biologice, alimente, medicamente
- Congelarea - la -20 oC are efect –cid (formarea de cristale de gheață și hiperconcentrare
salină)
- rapidă la -80oC într-un mediu protector (bulion glicerinat) poate asigura timp
îndelungat menţinerea viabilă a microorganismelor.
- șocul rece – efect –cid.

C. RADIAŢIILE
Radiaţiile neionizante (UV)
 Afectează replicarea ADN-ului celular
 Slabă penetrabilitate – reducerea încărcăturii microbiene din aer și dezinfecția suprafețelor
plane
 Lămpi UV- săli de operaţie, boxe pentru lucru aseptic, suprafeţe de lucru în laborator
Radiaţiile ionizante (razele X şi gamma)
 Importantă penetrabilitate – sterilizarea în condiţii industriale a seringilor de unică
folosinţă, mănuşilor chirurgicale, materialelor de sutură, medicamente.
 Control sterilizare – spori de Bacillus pumilus

D. ULTRASUNETELE - efect – cid – dezinfecția instrumentarului stomatologic și

chirurgical

E. FILTRAREA
 este o metodă de sterilizare a aerului și a unor substanțe termolabile (medii de
cultură, medicamente)
 utilizează membrane din acetat de celuloză (pori de 0,025 µm)
 Filtrele HEPA (High Efficiency Particulate Air Filters) – folosite pentru sterilizarea
aerului în boxele de siguranţă antiepidemică, sălile de operaţie, în saloanele
pacienţilor cu boli cu transmitere aerogenă, pacienţi imunocompromişi, arşi.

5. Agenţi chimici – pot realiza sterilizare, dezinfecție sau antiseptizare

Clasificarea agentilor chimici in functie de mecanismul de actiune:
- Agenţi de denaturare a stării coloidale a proteinelor (acizi, alcali, alcooli)
- Agenţi blocanţi ai grupărilor chimice libere ale enzimelor (peroxizi, metale grele, aldehide,
oxid de etilen, halogeni)
- Agenţi care lezează membranele celulare (fenoli, detergenţi)
- Agenţi care alterează acizii nucleici (derivaţi de anilină, acridină)

Există diferenţe în ce priveşte eficienţa antimicrobiană, activitatea în prezenţa substanţelor organice

(curat/murdar) și toxicitatea.
a. Oxidul de etilenă
 Utilizare: sterilizare - componente ale aparatelor de respiraţie asistată, obiecte din plastic,
valve cardiace, catetere, echipamente electronice
b. Aldehidele (formaldehida, glutaraldehida)
 Utilizare: dezinfecție, sterilizare (sporicid la concentrații mari)
c. Agenţii oxidanţi (peroxid de hidrogen, ozon, permanganat de potasiu, acid peracetic)
 Utilizare: dezinfectant, antiseptic, sterilizarea echipamentului medical
d. Săruri ale unor metale grele
 Azotat de argint (1%) – antiseptic - unguent oftalmic pentru nou-născuţi (Neisseria
gonorrhoeae); creme pentru arsuri.
 Săruri de mercur – bacteriostatic
e. Halogenii
 Utilizare: dezinfectanți, antiseptice – distrug formele bacteriene vegetative, fungii, unii
endospori bacterieni şi numeroase virusuri
Clorul - este utilizat pentru tratarea apei potabile.
Compuşii pe baza de clor (cloramina) – dezinfecția excretelor, instalații sanitare.
Iodul – soluție alcoolică, tinctură, iodofori - antiseptic
Bromul - agent antimicrobian utilizat pentru dezinfecţia eficientă a căzilor cu
hidromasaj, deoarece se evaporă mai încet decât clorul la temperaturi ridicate.
Fluor (fluorura) - agent antibacterian utilizat în dezinfecţia apei de băut şi ca antiseptic
în pasta de dinţi.
f. Fenolul şi derivatii fenolici (clorhexidina)
 Utilizare: dezinfectant – nu distrug virusurile și sporii
g. Alcoolii - soluţii de alcool: etanol 70%, propanol 60%, izopropanol 70%
 Utilizare: antiseptic - bactericid (inclusiv micobacterii), fungicid, virulicid (virusuri
învelite); NU sunt eficienți împotriva endosporilor bacterieni
 ! Alcoolul pur nu este un agent antimicrobian eficient, deoarece denaturarea proteinelor
necesită prezența apei.
h. Agenţi tensioactivi (săpunurile şi detergenţii)
 Utilizare: antiseptice și dezinfectante – distrug bacterii, fungi, virusuri învelite. Nu sunt
eficiente împotriva virusurilor nude sau a endosporilor bacterieni.

Reguli privind utilizarea corectă a antisepticelor şi a dezinfectantelor:

1. Soluţiile de lucru se prepară în momentul folosirii, în recipiente sterile.
2. În alegerea concentraţiilor se va ţine seama de condiţia curat/murdar a obiectelor supuse
acţiunii dezinfectantelor.
3. Pentru decontaminarea mâinilor, întotdeauna soluţia antiseptică se toarnă pe mâini
(introducerea mâinilor în soluţie conduce la inactivarea rapidă a efectului antimicrobian).
4. Nu se vor supraîncărca recipientele cu soluții dezinfectante, pentru a evita scurgerile
contaminante la mobilizarea lor.
5. Obiecte care plutesc vor fi umplute şi imersate complet în soluție sau se va folosi un
recipient care are capac şi poate fi înclinat repetat.
6. Materiale cu conţinut proteic mare nu se introduc în soluții dezinfectante, ci se colectează
separat pentru autoclavare directă.
 7. Nu se va dilua dezinfectantul prin scurgeri de lichide. Pentru supernatantul din tuburile de
centrifugă se foloseşte un container separat cu soluţie mai concentrată şi prevăzut cu pâlnie
pentru reţinerea aerosolilor contaminanţi.
8. Materialele nu se lăsa mai mult de 24 de ore în soluţia dezinfectantă.
9. Soluţia de lucru nu se refolosește pentru că se pot selecta şi înmulţi bacterii de contaminare
rezistente.
10. Soluţiile de lucru nefolosite 24 de ore se aruncă.

Bibliografie : Cap 7.2. pag 120-129