Organizarea si dotarea unui laborator

-rolurile laboratorului: in primul rand este de a crea conditiile necesare izolarii si apoi
identificarii microorganismelor prezente pe un substrat in mai multe scopuri:

 Pentru diagnosticul bolilor infecto-contagioase

 In depistarea purtatorilor de germeni
 In punerea bazelor unui tratament corect si eficient
 In controlul microbiologic al apei, aerului, respectiv al alimentelor
 In controlul operatiunilor de sterilizare
 Supravegherea epidemiologica a populatiei utilizand metode serologice
 In cercetarea stiintifica

-laboratul de microbiologie medicala este locul unde se examineaza diferite produse

patologice recoltate in primul rand de la bolnavi, dar si de la convalescenti (persoanele
care au trecut prin boala si se afla in perioada de recuperare), contacti, suspecti,
purtatori cronici sau de pe diferite obiecte din mediul de spital in vederea izolarii si
apoi a identificarii agentului patogen (vorbim aici de diagnosticul direct – acele etape
ale unui diagnostic care ne duc la izolarea si apoi identificarea unui produs patologic)
sau pentru evidentierea raspunsului imun al organismului care este de doua tipuri:
Umoral si Celular (adica identificarea anticorpilor – concentratia acestora, titrul
anticorpilor), fata de agresiunea microbiana (in acest caz vorbim despre diagnosticul
serologic/indirect)

-microorganismele: bacterii, paraziti, virusuri; deci exista trei tipuri de diagnostice

-organizarea laboratorului:

 Aparate de sterilizare: autoclave (sterilizare prin caldura umeda), cuptoare

(sterilizarea prin caldura uscata)
 Microscoape
 Frigidere
 Mobilier redus
 Aparate de distilare a apei
 Centrifugi
 Sursa de apa si gaz
 Lampi de ultraviolete
 Galeata de infecte
 Becurile de gaz
1
  Sticlarie (eprubete etc)
 Diferite instrumente – ansele bacteriologice (cele mai importante) sunt de doua
tipuri (de unica folosinta sau metalica); sunt formate dintr-o tija metalica care se
continua cu un fir metalic (este un material termorezistent) , care se poate
termina drept – se numeste ansa ac, sau sa se termina cu o suprafata latita/bucla
– se numeste ansa bucla; cu ele putem preleva o cantitate de produs patologic,
dar cu cea bucla putem preleva un produs patologic lichid scufundantul in acest
produs lichid
 Coloranti
 Seruri, reactivi
 Daca este cazul animale de laborator

-normele de protectie ale muncii in laborator:

 Scopurile protectiei microbiologice: protectia personalului medical, protectia

mediului inconjurator, evitarea contaminarii probelor cu germeni din mediul
extern
 Principalul mijloc de protectie in laborator este halatul cu maneca lunga, boneta
sau parul prins pentru fete
 Spalarea cu solutie dezinfectanta inainte de parasirea laboratorului
 Nu avem voie sa mancam, bem, fumam in laborator

2
 Metode de sterilizare folosite in laborator
-investigatiile microbiologice se fac pentru stabilirea diagnosticului etiologic (cauzal)
al bolilor infectioase; pentru aceasta este necesar ca intr-o prima etapa a diagnosticului
agentul patogen sa fie izolat din produsul patologic recoltat, apoi sa fie obtinut intr-o
cultura pura (cultura monobacteriana), apoi sa fie identificata prin diverse tehnici de
laborator, iar in final (in ultima etapa a diagnosticului) sa-I fie testata sensibilitatea
fata de antibiotice (antibiograma –procedeu) pentru instituirea unui tratament eficace
si tintit

-trebuie folosite instrumente si materiale sterile (care sa fie lipsite de orice

microorganism), sa se lucreze in conditii de asepsie pentru a evita contaminarea
probelor cu germeni din mediul extern; rezultatul depinde de indeplinirea acestor
conditii

-sterilitatea=lipsa de pe/dintr-un substrat (indiferent de starea lui de agregare: solid,

lichid, gazos) a microorganismelor vii (bacterii, virusuri, fungi, paraziti) capabile de
multiplicare atat in forme vegetative cat si sporulate

-sterilizarea reprezinta ansamblul de metode si tehnici pentru a atinge stadiul de

sterilitate al unui strat; materiale supuse sterilizarii au proprietati fizico-chimice care
trebuie pastrate pe parcursul sterilizarilor, adica metoda de sterilizare nu trebuie sa
degradeze substratul

-parametrii de fiabilitate al unei sterilizari:

 Curatirea si ambalarea corecta a materialelor (pentru scaderea incarcaturii

microbiene si pentru indepartarea de pe substrat a unor substante chimice, a
unor toxine termostabile) –curatare mecanica

 Alegerea metodei de sterilizare – trebuie sa fie eficienta, ieftina si rapida

 Alegera tipului de aparat pe care il vom folosi (il alegem in functie de volumul
de lucru si de performantele lui)

 Alegerea agentului sterilizant (caldura –umeda sau uscata, substante chimice –

sub forma lichida sau sub forma de gaz, radiatiile ionizante, undele sonore)

 Controlul sterilizarii materialelor

3
  Pastrarea sterilitatii materialelor pentru un anumit interval de timp (24 h de
obicei); pastrarea in recipientele in care au fost sterilizate si se tin in dulapuri
uscate si curate

Sterilizarea prin caldura

Sterilzarea cu caldura uscata:
In general caldura este cel mai folosit agent fizic pentru sterilizare deoarece este
ieftina, este eficienta, este adaptabila naturii materialelor; caldura uscata distruge
microorganismele (bacterii, virusuri, fungi, paraziti) prin mai multe mecanisme:

 Prin accelerarea fenomenelor de oxidoreducere

 Prin asfixia celulei bacteriene

 Prin denaturarea macromoleculelor proteice urmata de coagularea proteinelor

 Prin carbonizare

-din acest grup de metode care folosesc caldura uscata, cea mai fregvent inalnita este
incalzirea la incandescenta si se foloseste cu precadere pentru ansele bacteriologice si
pentru instrumente metalice – adica pana la inrosire – se face acest lucru atat inainte
cat si dupa folosirea lor

-sterilizarea cu aer cald: se face in etube termoreglabile care se numesc cuptoare

Poupinet; aceste dispozitive au un perete dublu (cel extern din azbest, cel intern din
sticla) intre care circula agentul de sterilizare care este aerul cald; in partea inferioara a
aparatului se gaseste o sursa de caldura (o rezistenta electrica), iar in interior se gasesc
rafturi metalice pe care se aseaza materialele de sterilizat; doi parametri sunt
importanti pentru aceasta sterilizare: temperatura care este de 170 C si timpul care
este de 1 h; materialele care se pot steriliza pa Poupinet: sticlaria de laborator,
instrumentele metalice neascutite sau netaietoare, obiecte de laborator de portelan,
diverse pulberi anorganice – talc, sulfamida, unele substante uleioase – glicerina cu un
continut sub 20% apa, parafina, etc

-controlul sterilizarii la Poupinet: prin controlul celor doi parametri (timp si

temperatura), prin examinarea aspectului vatei si a hartiei de ambalaj (modificarea
aspectulului lor in galben indica o sterilizare corecta); la temperaturi de peste 175 C
se formeaza gudroane prin carbonizarea hartiei si respectiv a vatei care au efect

4
bactericid care pot inhiba dezvoltarea bacteriilor din produsul patologic (+sticlaria se
pateaza)

-flambarea=consta in treceri rapide si repetate prin flacara becului Bunsen (de gaz) a
unor obiecte mici cu suprafaza neteda din metal sau din sticla care au fost in prealabil
sterilizate (diverse lamele de sticla, pipete, gura eprubetelor); acest procedeu este doar
o tehnica de asepsie, este o precautie suplimentara si nu este o metoda de sterilizare
propriu zisa

Sterilizarea cu caldura umeda:

-caldura umeda este mai nociva pentru microorganisme decat cea uscata; timpul
necesar distrugerii unui microorganism la o temperatura data este cu atat mai scurt cu
cat cantitatea de apa din celula bacteriana este mai mare; cu alte cuvinte apa
favorizeaza patrunderea caldurii in celula bacteriana; aceasta caldura umeda distruge
microorganismele prin doua mecanisme importante si anume coagularea proteinelor si
respectiv prin alterarea lipidelor membranare (din peretele celulei bacteriene)

-sterilizarea cu vapori de apa sub presiune este principala tehnica de sterilizare prin
caldura umeda; ea se realizeaza in niste dispozitive numite autoclave iar agentul
sterilizant il reprezinta vaporii supraincalziti obtinuti prin fierberea apei distilate;
principiu de functionare: temperatura vaporilot este direc proportionala cu presiunea
lor (PV/T=constanta)

-parametrii de sterilizare la autoclave: temperatura este 120 grade Celsius,

presiunea este de o atmosfera si timpul este de 30 de min;

-materialele sterilizabile la autoclave: instrumentele metalice ascutite sau cele

taietoare, unele materiale textile (vata, tifon), campurile operatorii, unele lichide (apa
distilata, serul fiziologic, unele substante uleioase, glicerina cu continut de peste 20%
apa, obiecte de cauciuc (dopuri, tuburi), mediile de cultura (cele mai importante) –
adica substraturile folosite pentru a insamanta anumite substraturi patologice, galetile
de infecte

-controlul sterilizarii la autoclava:

 se face cel mai simplu prin controlul celor trei parametri (presiune, timp si
temperatura);

 controlul cu martori chimici (sunt substante sub forma de pulbere cu punctul de

topire cunoscut si apropiat temperaturii de sterilizare – de exemplu cel mai

5
 folosit este acidul benzoic care are punctul de topire in jur de 121 grade Celsius)
– acesti martori chimici se introduc in tuburi de sticla inchise la capete
impreuna cu un colorant (fuxina bazica, violet de gentiana) iar tuburile
respective se introduc in autoclav la diferite nivele si se examineaza la sfarsitul
sterilizarii; schimbarea culorilor si a starilor de agregare (inseamna ca
sterilizarea a fost corecta) – cu toate acestea nu este o metoda foarte eficienta
deoarece nu exista control asupra timpului

 controlul cu markeri biologici (sunt niste suspensii de spori bacterieni cu

temperatura si durata de distrugere cunoscute); cel mai utilizat dintre aceste
produse este STEAROTEST120, produs de institutul Canta-Cuzino; stearotestul
se prezinta ca o fiola ce contine un mediu de cultura lichid (un substrat nutritiv
pentru bacterii) de culoare violet si de aspect transparent care contine si spori ai
bacteriei: Bacillus Stearotermophyllus + un indicator de pH; despre acesti spori
se cunoaste faptul ca sunt distrusi la 120 grade celsius in 15 minute; fiolele de
stearotest printre obiectele de sterilizare in autoclave si se examineaza la finalul
sterilizarii dupa care se incubeaza la 56 grade Celsius (este temperatura de
germinare a sporilor – temperatura de multiplicare a sporilor) timp de un anumit
interval de timp (de obicei 24h); dupa acest interval fiolele se examineaza si
poate aparea fie varianta cu pastrarea culorii violet si a aspectului transparent –
sterilizare corecta, fie varianta cand lichidul devine galbui si de aspect tulbure –
sterilizare incorecta

Sterilizarea cu substante chimice:

-o folosim pentru materialele termolabile; se poate face cu:

 substante chimice gazoase (oxidul de etilena) folosit pentru sterilizarea unor

instrumente, pulberi sau chiar pentru medicamente injectabile (antibiotice)

 substante chimice lichide (sterilizare in imersie – prin scufundare) in diverse

lichide exemplu alcool etilic, propilic, compusi halogenati, compusi oxidanti,
baza sau compusi cuaternari de amoniu, compusi organici de mercur, etc. – nu
este foarte eficienta

Sterilizarea cu radiatii ionizante:

-aceste radiatii ionizante produs la propagarea printr-un mediu produc ionizarea
atomilor cu formare de radicali liberi si de molecule reactive cu efecte nocice pe
celulele vii

6
-efectele radiatiilor ionizante depind de trei lucruri: de dimensiunea sursei care le
emite, de lungimea lor de unda si de durata expunerii; efectul lor microbicid se face
prin dezorganizarea acizilor nucleici, alterarea sintezei proteice si prin oxidarea
lipoproteinelor membranare

-cele mai folosite radiatii ionizante sunt radiatiile gamma a doua elemente chimice: Co
si Cs (cesiu); sunt foarte bune deoarece sunt penetrante intr-un substrat si deoarece
sunt eficiente

-materiale sterilizate: obiectele sau instrumentele de plastic si de unica folosinta

(seringi, seturi de perfuzie, sonde, tuburi de plastic, catetere, branulele, diverse
proteze, implanturi, dializoare)

Metode de reducere a incarcaturii microbiene:

-aceste metode au diverse aplicatii: de la aplicatii medicale, la aplicatii industriale si
chiar casnice si de aceea le putem folosi acasa; acestea nu sunt tehnici propriu zise de
sterilizare pentru ca nu distrug sporii bacterieni; cateva dintre aceste metode:

 pasteurizarea – incalzirea unor alimte lichide la temperaturi sub 100 de grade

Celsius o perioada de timp urmata de o racire brusca (bere, lapte)

 ultrapasteurizarea – injectarea brusca de vapori supraincalziti la 150 de grade

Celsius intr-un lichid sub presiune, lichid care este supus unei curgeri turbulente
(U.H.T – ultra high temperature – lapte, frisca)

 tindalizarea – consta in incalziri repetate timp de o orala temperaturi intre 56 si

100 grade Celsius; ultima incalzire este urmata de o racire brusca; este metoda
de aplicatii casnice (muraturi)

 fieberea – se face cu apa distilata in care se introduc instrumente; timpul minim

este de 30 de minute cu adaos de carbon de sodiu pentru cresterea punctului de
crestere (adica peste 100 de grade) si de nitrit de sodiu care este folosit ca si
agent anticorozit

 lampile bactericide – folosesc radiatia ultravioleta cu lungime de unda intre

250 si 280 de nm emise printr-o descarcare electrica intre doi electrozi plasati in
atmosfera de vapori de mercur si in interiorul unui tub de cuart permeabil pentru
ea; actioneaza asupra ADN-ului bacterian si impiedica replicarea acestuia, dar
au efecte nocive asupra retinei umane, nu ajung in colturile incaperilor si nu
patrund prin praf

7
 Recoltarea de produse patologice
Recoltarea: este prima etapa a diagnosticului de laborator; ea conditioneaza
eficienta etapelor ulterioare; recoltarea este etapa diagnosticului in care pot sa apara
erori din mai multe cauze, uneori se pot face inafara laboratorului, sau se poate face de
catre un alt personal decat cel care si recolteaza

Modul de recoltare corecta a anumitor produse patologice:

Norme tehnice de recoltare generale:

o Cine recolteaza?

 pacientul instruit in prealabil

 medic

 alt personal medical

o Cand?

 Inaintea tratamentului antibiotic (indiferent daca este local sau general)

 La minimum trei zile dupa intreruperea acestui tratament

 In momentul optim pentru recoltare (in care probabilitatea evidentierii agentului

patogen din produsul patologic este cea mai mare

o De unde?

 Locul se stabileste in functie de patogenia infectiei dupa un examen clinic al

bolnavului

 De la poarta de intrare a agentului patogen in organism (caile respiratorii de

exemplu)

 De la nivelul cailor de diseminare in organism (sangele vascular)

 De la nivelul focarelor secundare dace ele exista

 De pe caile de eliminare (urina sau materiile fecale)

o Cum?

 In conditii de asepsie

8
  Folosind materiale si instrumente sterile inchise ermetic

 In cantitati suficiente

 Din zonele suspecte ale produsului patologic (zonele cu mucus, sange, puroi)

 In lipsa acestora din mai multe zone sau mai multe puncte ale produsului
patologic

-recoltarea trebuie sa aibe o semnificatie, se numeste clinico-etio-patogenica, adica

produsul patologic recoltat trebuie sa fie cel in care exista cu maxima probabilitate fie
agentul infectios ca atare (in intregimea lui/integral), fie componente structurale ale
acestuia (bucatele – antigene solubile), sau chiar metaboliti specifici

-produse care pot fi recoltate: sange, urina, materii fecale, exudat faringian, secretii,
puroiul, LCR, lichid pleural, lichid peritoneal, lichidul pericardic, lichidul sinovial,
sputa, lichidul duoden, bila,lichidul gastric, lichide din anumite eruptii epidermice,
par, piele, fragmente de unghii

Exudatul faringian:
-se recolteaza cu un tampon format dintr-o tija de lemn care la extremitatea rugoasa
are infasurat un tampon de vata hidrofila; cealalta extremitate este introdusa in capac

-persoana care recolteaza trebuie sa stea usor lateral pentru a nu I se tusi in fata; se
recolteaza din zonele purulente, din zonele cu ulceratii, din zonele cu false membrane;
momentul optim pentru recoltarea exudatului este dimineata pe nemancate fara toaleta
cavitatii bucale

-in mod corect se recolteaza minimum doua tampoane; primul se recolteaza pentru
realizarea unui frotiu iar cel de-al doilea se foloseste pentru insamantare pe medii de
cultura (adica pentru izolarea bacteriilor); tampoanele se prelucreaza imediat sau daca
acest lucru nu este posibil se introduc intr-un mediu de transport si conservare (de
exemplu mediul Stuart – denumit si mediu universal deoarece este folosit pentru
transportul produselor patologice recoltate IACRS – infectii acute ale cailor
respiratorii superioare; mediul Pike – este un mediu selectiv, numai de transport,
mediul streptococilor)

9
 Urina:
-se face dimineata la trezire din prima mictiune; se recolteaza 10-15 ml de catre
bolnavul instruit anterior – adica va trebui sa si faca toaleta regiunii perineale; nu se
recolteaza primele picaturi de urina deoarece acestea reprezinta flora de la nivelul
uretrei; sa-si recolteze din jetul urinar mijlociu intr-un recipient steril care se inchide
imediat

-o situatiile particulara este la femeile care prezinta leucoree (secretie vaginala

patologica); in aceste cazuri trebuie sa-si introduca un tampon intravaginal

-o alta situatie particulara este la bolnavii necooperanti adica paralizati sau in coma –
se recolteaza urina direct din vezica urinara prin punctie suprapubiana; recoltarea prin
sondaj vezical (pericolul transmiterii de infectii nozocomiale)

-recoltarea se face in doua scopuri:

 -recoltarea sumarului de urina si a sedimentului

 -pentru realizarea uroculturii (cantitativa si calitativa)

Recoltarea materiilor fecale:

-se face in recipiente de plastic sau sticla care se numeste coprorecoltoare;
coprorecoltorul poate contine uneori si un mediu de trasnport al materiilor fecale,
semisolid, numit Carry-Blair; cel mai frecvent se recolteaza din scaunul emis spontan;
recoltam mai ales din zonele suspecte ale acestuia: zonele cu muscu, puroi, sange,
zonele care contin asa numitele granulatii riziforme (care seamana cu bobul de orez),
sau in lipsa acestora din mai multe zone ale scaunului; ca si cantitate, suficiente sunt in
jur de 5 grame

-recoltarea se poate face si dupa administrarea unui asa numit purgativ, adica o
substanta care sa stimuleze procesul de defecare, salin (pe baza de sare); acest purgativ
este de fapt un amestec in parti egale de sulfat de sodiu si sulfat de magneziu in
cantitati egale (cate 15 grame) dizolvate in 250 ml de apa calduta – doza de
administrat la un adult

-la purtatorii bacteriei Salmonella Typhi, dupa purgativul salin se fac 3 recoltari
zilnice succesive; purgativul salin este contraindicat in formele acute de boala
deoarece poate produce perforatii intestinale

10
-o alta forma de recoltare este cea prin rectoscopie, care se face printr-un dispozitiv
numit rectospcop – este un tub flexibil care are la capat o sursa de lumina; se poate
recolta direct din leziunea de la nivelul colonului; este vorba mai ales de o afectiune
numita dizenterie cronica produsa de un parazit numit Entamoeba Histolytica

-se mai poate face si printr-o sonda de cauciuc numita Nelaton care se poate introduce
pe o distanta de 10-12 cm la copil, pana in colonul sigmoid, 15-20 de cm la adult

Recoltarea sangelui:
-se recolteaza in doua scopuri: pentru izolarea si apoi identificare agentului patogen
(operatiune denumita hemocultura), pentru evidentierea raspunsului imun al
organismului (pentru diagnosticul serologic sau indirect)

-pentru hemocultura se recolteaza cel mai frecvent sange venos de la nivelul plicii
cotului, sau de la venele satelite (care inconjoara) unui focar infectios, sau direct din
catetere; se poate recolta si sange arterial mai ales in suspiciunea unei boli grave
denumita endocardita bacteriana lenta sau subacuta; ca si cantitate care se recolteaza:
1-5 ml la copil, 10-30 ml la adult

-cand se recolteaza:

 Inaintea administratii de medicamente antibiotice

 In timpul unui frison – adica la maximul de ascensiune termica ( de obicei se

produc in primele 10 zile de la debutului unei boli infectioase grave)

-recoltarea se face de catre medic; se face dupa prealabila spalare cu apa calda si sapun
si apoi antiseptizarea regiunii pe care o vom punctiona cu alcool 70% si tinctura de
iod 1% dinspre centru inspre periferie

-sangele recoltat se introduce in niste flacoane speciale de sticla de hemocultura cu

volume intre 100-300 ml, flacoane in care se gaseste un mediu de cultura lichid,
nutritiv pentru bacterii, mediu numit Bulion nr. 1; pentru inactivarea actiunii
bactericide trebuie asigurat un raport de 1/10 intre sangele recoltat si mediu nutritiv

-se mai introduce in flaconul de hemocultura o substanta chimica numita SPAS

(polianetol sulfonat de sodiu) in concentratie de 0.025% care are mai multe roluri:
anticoagulant, anticomplement, antifagocitar; mai puntem introduce in anumite cazuri
si inhibitori ai unor medicamante cu care a fost tratat bolnavul, adica inhibitori de
antibiotice de cele mai multe ori

11
-recoltarea sangelui pentru hemocultura se repeta de 2-3 ori in 24 h in caz de
septicemie, respectiv tot de 2-3 ori pe un interval de 48 h in caz de bacteriemie

-cel de-al doilea scop pentru care se recolteaza sange este pentru diagnosticul
serologic indirect; pentru acest timp de diagnostic avem nevoie de 10 ml de sange
venos recoltat dimineata pe nemancate (pentru a evita hiperlipemia postprandiala care
influenteaza negativ reactiile serologice)

-pentru acest diagnostic se foloseste serul care se optine fie prin centrifugare sau
lasare la coagulare si decantare; sunt necesare 2-3 probe de ser: prima la debutul
infectiei (la internare) –este o proba precoce, cea de a doua este tardiva (in
convalescenta); se urmaresc anticorpii in dinamica adica in timp; cu ajutorul acestor
modificari reusit sa punem diagnosticul serologic intr-o anumita afectiune

Sputa:
-este produsul de secretie al glandelor bronsice de la nivelul cailor aeriene respiratorii
inferioare; aceasta recoltare este utila in diagnosticul afectiunilor cailor respiratorii
inferioare; sputa se recolteaza in recipiente sterile, de unica folosinta in cantitate de 5-
10 ml; cel mai frecvent se recolteaza sputa emisa spontan prin efortul de tuse; in alte
casuri se poate recolta asa numita sputa indusa prin mai multe metode:

 Prin aerosol

 Lavaj (spalatura)

 Aspiratie bronsica

-o situatie speciala este la copii mici unde sputa se va recolta prin sontaj gastric,
deoarecei ei si-o inghit nu o expectoreaza

-momentul de recoltarea este dimineata, deoarece noaptea se acumuleaza, deci

cantitatea de sputa dimineata este mai mare; se face pe nemancate si dupa toaleta
cavitatii bucale (deoarece nu ne intereseaza flora cavitatii bucale)

-la tusitorii cronici care tusesc pe tot parcursul zilei (de obicei la marii fumatori) sputa
se se secreta aproape continuu, deci se poate recolta in orice moment al zile; la
bolnavii cu TBC pulmonar (bacilul Koch=Mycobacterium Tuberculosis sau Hominis)
bacilul Koch se elimina inconstant prin sputa, si atunci la acestea sunt necesre 2 sau 3
probe la intervale de 1-2 zile

12
 LCR (lichidul cefalorahidian):
-se recolteaza de catre medic la patul bolnavului in conditii de asepsie inainte
tratamentului antibiotic; cel mai frecvent se recolteaza prin punctie lombara, mai putin
frecvent se poate recolta si prin punctie suboccipitala; ca si cantitate: 5 ml la copil, 10
ml la adult; se recolteaza in suspiciunea meningitei;

-bolnavul va fi asezat pe un scaun sau intr-un decubit lateral; dupa antiseptizarea

regiunii dorso-lombare cu alcool 70% si tinctura de iod 1%, se patrunde cu un ac de
punctie lombara de 6-10 cm care este prevazut cu un mandren, in spatiul dintre
apofizele spinoase ale vertebrelor spinale L3-4, sau L4-5

-LCR se recolteaza intr-o eprubeta sterila si se insamanteaza foarte rapid, chiar la patul
bolnavului; dupa punctie bolnavul este asezat in decubit ventral timp de doua ore fara
perna pentru a se evita cefaleea post-punctie

Puroiul:
-puroiul este un exudat care este format din: polimorfonucleare neutrofile (PMN),
mononuclare, celule, resturi celulare, mai contine fibrina si germeni; el se poate forma
prin doua procese:

 in urma unui proces supurativ care poate fi fie septic prin patrunderea unei
germene intr-un anumit sesut

 fie se poate forma in urma unui proces aseptic cand se formeaza prin actiunea
litanta a unei substante chimice; uneori este util datorita aspectul lui
macroscopit (ex: stagfilococul – este un germene piogen, adica care secreta
puroi, produce un puroi cremos si vascos; streptococul care este si el piogen si
produce un puroi clar, serofibrinos si mai putin vascos in comparatie; bacilul
piocianic care produce un puroi de culoare albastruie

-recoltarea se face inaintea andiministratii de antibiotice, si recoltarea se poate face

dintr-o leziune (o arsuna, o plaga, o escara) prin aspirarea cu acul si seringa, sau din
colectii inchise, care in functie de recoltarea lor pot fi superficiale (furuncul), sau ceva
mai profunda (abces); se recolteaza in cazul colectiilor inchise dupa antiseptizarea
regiunii prin punctionare, cu observatia ca nu se punctioneaza zonele cu inflamatie
acuta (care se identifica prin rubord-roseata, dolor-durere, calor-calda, tumor-umflata)

-o situatie particulara este in cazul abcesului rece tuberculos (nu are aceste semne de
inflamatie acuta) – este o colectie purulenta care se poate punctiona; se localizeaza

13
mai frecvent in tuberculoza osoara, si mai frecvent la nivelul T12; punctionarea acestei
colectii se face in zona ei superioara, strabatand 3-4 ml de tesut sanatos; mai putem
recolta puroi daca mai exista o fistula

Secretii vaginale si uretrale:

-secretia vaginala se recolteaza in primele 10 zile ale ciclului menstrual, inaintea
tratamentului antibiotic, fie cu ansa bucla, fie cu un tampon; se poate recolta de la
nivelul glandelor Bhartolini, de la nivelul orificiului colului uterin, respectiv de la
nivelul meatului urinar (orificiu urinar)

-secretia uretrala la femei se recolteaza simultan cu cea vulvo-vaginala, la barbati in

schimb recoltarea acestei secretii uretrale ajuta la identificarea diagnosticul
etiologic/cauzal al uretritelor, care pot fi acute, respectiv cronice

-se recolteaza dimineata, inainte de prima mictiune si se recolteaza prin expresia

postero-anterioara a uretrei, urmata de comprimarea glandului penian; in uretritele
acute ne intereseaza sa recoltam picatura de secretie de la nivelul meatului urinar,
picatura care se poate recolta cu un tampon sau cu ansa bucla

-in schimb in uretritele cronice secretia este mai redusa si nu este netpurulenta (mai
redusa cantitativ); recoltarea este mai dificila si de aceea este necesara stimularea
secretiei uretrale (proba cu alcool, prin masaj prostatic)

Recoltarea de exudate si transudate seroase:

-facem referire la lichidele din cavitati seroase si inchise: lichidul pericardic,
peritoneal, pleural, articular; recoltarea acestora se face prin punctia cavitatilor in
conditii de asepsie si inainte de administrarea antibioticelor; se recolteaza 10-20 ml

-se poate face un examen citobacteriologic, pentru insamantari pe medii de cultura, in

diverse reactii biochimice;

Recoltarea lichidului pleural:

-se recolteaza prin punctie pleurala, care se mai numeste si toracocenteza; inaintea
punctiei propriu-zise se administrea pacientului un antitusiv; dupa antiseptitazarea
regiunii se patrunde cu un ac de punctie de 5 pana la 8 cm pana in cavitatea pleurala;
locul de punctionare este pe linia axilara posterioara, sau pe linia care coboara din
mijlocul scapulei

14
-se patrunde cu acul de punctie in spatiul intercostal situat sub limita Matitatii
revarsatului/lichidului, dar nu se patrunde mai jos de spatiul intercostal 6, maxim 7; se
patrunde cu acul perpendicular pe piele si razant la marginea superioara a coastei
inferioare; se recolteaza 10-12 ml de lichid intr-o eprubeta sterila, se pot face diverse
dozari de proteine, de lipide, a glucozei, a amilazei, citologia lichidului, ii putem face
frotiuri colorate, insamantari pe medii de cultura, sau putem face analize mai speciale
(dozarea a diverse elemente: anticorpii antinucleari, factorul reumatoid, celulele lupice
(care apar in lupusul eritematos

Lichidul duodenal si bila:

-se face prin introducerea unei sonde numita Einhorn pana la nivelul duodenului; este
o sonda gradata si are la unul dintre capetele o limpa metalica cu mai multe orificii;
bolnavul va trebuie sa inchida progresiv aceasta sonda

-tubajul se face dimineata pe nemancate; in final ea trebuie sa ajunga la diviziunea de

45 cm masurata din dreptul arcadei dentare, cand se considera ca sonta a ajuns in
stomac; pacientul se aseaza in decupid laterla drept iar apoi pacientul va inghiti din
sonda pana la diviziunea de 65 cm cand se considera ca sonda a ajuns in duoden; se
aspira apoi 10 ml de lichid care se arunca (deoarece este amestec de lichid gastric si
duodenal); apoi pe sonda va incepe sa curga lichid galben duodenal care are aspect
siropos

-se introduc lent pe sonda o cantitate de 30-40 ml de sulfat de magneziu 40% incalzit
la 37 grade celsius; dupa 5-10 min va aparea pe sonda bila A de culoare portocalie;
dupa alte 20 de min bila B care este mai vascoasa si inchisa la culoare bruna-maronie;
la 30 de min bila C de culoare galbuie

-in mod similar, recoltarea lichidului gastric se face prin sondaj gastric, cu o sonda
ceva mai scurta numita Foucher

Recoltarea serozitatii din vezicule, ulceratii si sancrul dur:

-serozitatea din vezicule sau ulceratii se recolteaza cu pipeta sau ansa bacteriologice;
sancrul dur este leziunea primara genitala care apare in sifilis (produs de o bacterie
numita Treponema Pallidum); se face tualeta sancrului cu ser fiziologic, dupa care se
indeparteaza sau se desprinde crusta cu varful unei pipete de sticla evitand sangerarea;
se recolteaza prin capilaritate deci cu o pipeta 1 ml de lichid limpede uneori cu o
usoara presiune la baza sancrului pentru a obtine o serozitate din profunzime care este
mai bogata in Treponeme

15
 Transportul probelor la laborator:
-transportul este cea de a doua etapa a fiecarui diagnostic; trebuie sa se faca cat mai
rapid (1-2 h), in conditii de securitate microbiologica (adica in recipiente inchise etans
si cu ambalaje externe de protectie); daca prelucrarea rapida nu este posbilita trebuie
folosite medii de transport/de conservare care practic mentin viabilitatea
microorganismului respectiv

-trebuie asigurat identitatea probelor (unde s-a recoltat, ce s-a recoltat, de la cine); mai
trebuie sa existe o fisa insotitoare a produsului care mai poate sa contina diferite date
epidemiologice care pot stabili diagnosticul la un moment dat (ex: boli cronice,
ocupatia pacientului, alergii, daca a calatorit recent intr-o tara straina, medicamente pe
care le foloseste in alte afectiuni)

-in laborator se face un triaj la probelor, adica se folosesc doar cele care corespund
normelor de recoltare

16
 Etapele diagnosticului parazitologic:
-diagnosticarea se face prin intermediul:

 Anamneza pacientului/purtatorului

 Examen clinic (valoare limitata)

 Utilizarea reactiilor cutanate

 Examene de laborator

Anamneza: intodeauna necesara, poate aduce date pretioase in orientarea

metodologiei investigatiei de laborator; se noteaza de obicei: nume, varsta, sex,
profesie, acuze prezente si antecedente, date apidemiologice referitoare la mediul de
rezidenta, daca a calatorit in tari straine, contact cu persoane sau animale bolnave;
pacientii pot oferi, de asemenea, date despre cum arata anumiti paraziti intestinali sau
cutanati pe care i-au observat

Examenul clinic: nu trebuie niciodata omis, se bazeaza pe simtomatologia

subiectiva si examenul obiectiv al pacientului; laboratorul ramane sa confirme
suspiciunea medicului curant; nu de putine ori examenele parazitologice cerute fara
discernamant deosebit au pus in evidenta parazitii, care in alte imprejurari ar fi ramas
neelucidate (lambliaza mimeaza 35 de afectiuni, trichineloza peste 100)

Examenul de laborator: are un rol determinant; se bazeaza pe evidentierea

parazitului in produsele biologice ale bolnavului (helmint intreg, fragmente, oua,
larve, protozoare exo sau endocelulare); produse de examinat pot fi: sange, urina,
materii facale, biopsii de organe, secretii, lichid duodenal, etc.; este considerat un
examen de certitudine

Principalele indicatii ale investigatiilor parazitologice de laborator –

cateva exemple:

 Eozinofilia neprecizata etiologic – helimintiaza, de obicei extradigestiva

 Examenul coproparazitologic obligatoriu pentru persoanele internate

 Indicatii clinice

 Examen parazitologic la angajare sau periodic (pentru cei care lucreaza in

domeniul alimentar, turism)

17
  Examenul parazitologic pentru copii din colectivitati

 Ancheta de focar in jurul unor cazuri de parazitoze

 Examinarea cetatenilor care au calatorit in zone endemice de boli parazitare

Conditiile in care se primesc probele de laborator:

1. Recolta corecta (recoltata de personal calificat sau pacient instruit, recoltare
dupa anumite precautii de exemplu: inaintea examinarii radiologice cu sulfat cu
bariu, inainte de consumul unor alimente bogate in celuloza, samburi, fara
administrare recenta de pansamente digestive, carbune medical, purgative
uleioase)

2. Recoltarea se face in mod diferit – ex: urina in epubrete sterile, fecale in

coprorecoltoare, sangele in eprubete sterile, etc., probele uneori se pot prezerva
in formol 10%

3. Transportul probelor trebuie facut rapid

4. Asigurarea indentitatii probei + un bilet de trimitere

Rezultatul examinarilor parazitologice de laborator:

-se noteaza in registrul de analize al laboratorului si se emite un buletin de analize:

-exprimare calitativa – precizarea corecta a numelui parazitului (ex Trichinela-

gen spiralis-specie, Ascaris lumbricoides); niciodata nu se va scrie in buletin
denumirea populara a parazitului

-exprimare cantitativa – densitatea (adica frecventa unor paraziti vis a vis de

anumite cantitati dintr-un produs, de exemplu frecventa plasmodiilor la 100 de
hematii), intensitatea (frecventa unor produse parazitare fata de anumite cantitati al
unor produse ale organismului uman de exemplu numarul de oua de helmint dintr-un
gram de materii fecale), incarcarea parazitara (numarul de helminti intr-un organism;
se poate determina in valori absolute sau in valori relative)

Erori de diagnostic: datorit neglijentei, incompetentei in prelevare, conservare,

transport sau analiza probelor

18
Atitudinea medicului de laborator in fata unei parazitoze:
 Parazitoze cu declarare obligatorie, nominala, in primele ore de la depistare
(malaria)

 Parazitoze care pot evolua cu complicatii grave (trichineloza, dizenteria

amoebiana)

 Parazitoze contagioase (dizenteria amoebiana, oxiuroza)

 Parazitoze care nu constituie urgente (teniaza)

Examinarea macroscopica: la lumina naturala sau artificiala potrivita, se face cu

ochiul liber sau lupa; cu ajutorul unei baghete de sticla se controleaza piesa cu atentie
si eventual se pune diagnosticul sau suspiciunea

Examenul microscopic:
 se poate efectua direct pe probe recoltate obisnuit sau special; se efectueaza
intre lama si lamela cu sau fara adaos de ser fiziologic

o metoda NIH sau a baghetelor cu banda de celofan (pentru diagnosticarea

oxiurazei) – bagheta se introduce in anus 3-4 mm, dimineata inainte de
scaun, pentru ca ouala de oxiur sa se depuna pe banda de celofan, apoi se
examineaza

o bagheta Graham pentru recoltarea amprentei anale

 se poate efectua pe preparate colorate uzual sau special

o coloratii uzuale:

 metoda de colorare cu eozina (pentru chisturile de protozoare –

lamblii)

 metoda de colorare cu Lugol (pentru protozoare – forme chistice)

– cel mai utilizat de obicei

o Coloratii speciale:

 Metoda de colorare cu albastru de metilen (in identificarea

amibelor)

 Metoda de coloratie Giemsa (in diagnosticul amibiazei, malariei)

19
  Metoda de coloratie Gramm-Weigert (pentru identificare
parazitului Pneumocystis carinii)

 Metoda MIF (mertiolat-iod-formol) (aprecierea cantitativa a oualor

de helminti)

 Metoda Kato si Miura modificata (pt ouale de helminti)

 Metoda de coloratie Ziehl-Nielson (identificarea criptosporidiilor)

Metode larvascopice: in diagnosticul unor boli parazitare (strongiloidoza)

 Metoda Baerman – se bazeaza pe termotropismul si higrotropismul unor larve
de strongiloizi sau ankilostome

 Metoda Harada si Mori (pentru depistarea larvelor de strongiloizi sau

ankilostome) – este mai lenta si mai putin sensibila decat precedenta

Metode de concentrare/imbogatire: cand elementele parazitare din probele de

examinat sunt rare:

 Metoda prin flotare (formele de parazitare plutesc la suprafata)

 Metoda de sedimentare (formele parazitare sedimenteaza la fundul vasului)

 Metoda Willis-Hung (prin flotare) – pentru depistarea oualelor usoare de

ascarizi, oxiur, ankilostome, hymenolepis, tricocefal – IMPORTANTA!

 Metoda de sedimenare in formol-eter (Ritchie) – se face un amestec de un gram

de materii fecale cu 10 ml de solutie salina – se identifica ouale de trematode,
embriofori de cestode, chisti de protozoare – IMPORTANTA!

 Metoda Sibenic-Pasini (pentru identificarea crosetelor de Echinococcus

granulosus din lichidul de vomica sau expectoratie)

 Picatura groasa – pentru depistarea parizitilor din sange (malarie, spirochete)

Metode de cultura in laborator: sporesc sansele de diagnostic al unei parazitoze

 Metoda de cultura cu carbune (pentru identificarea larvelor de strongiloizi si
ankilostome)

 Metoda Simici si Petrovici (pentru evidentierea amibelor patogene dar si a altor

protozoare)
20
  Cultura pe mediu NNN (pentru diagnosticul de leishmanioza viscerala sau
cutanata) –se cultiveaza sange, maduva osoasa, ganglioni sau splina

Metode imuno-biologice: destul de utilizate in diagnosticul maladiilor parazitare:

 Metoda Outchtcerlony – dubla difuziune (pentru identificare anticorpilor
antichist hidatic, pentru proteine patologice)

 Contraimunoelectroforeza – utilizeaza in decelarea anticorpilor de chist hidatic

 Reactia de hemaglutinare indirecta (pasiva) – identificarea anticorpilor in

hidatidoza

 Imunoelectroforeza – diagnosticul hidatidozei

 Reactia de imunofluorescenta indirecta – diagnosticul de chist hidatic sau

toxoplasmoza

 Intradermoreactia Casoni – diagnosticul In hidatidoza

 ELISA – diagnosticarea multor parazitoze

Inocularea la animale de experienta: se utilizeaza in scop diagnostic pentru

protozoare; in amibiaza se foloseste sobolanul alb sau pisica, leishmanioza se
inoculeaza la hamster, caine sau popandau; in trichomoniaza vaginala se foloseste
hamsterul auriu sau soarecele; in toxoplasmoza se folosesc soareci, cobai, hamster
auriu

Examen bioptice: adica prin punctia diferitor organe:

 Punctia ganglionara (in leishmanioza sau toxoplasmoza)

 Punctia hepatica (in diagnosticul larvei migrans viscerale)

 Punctia medulara (leishmanioza viscerala, unele parazitoze cerebrale)

 Biopsia musculara (larvele inchistate in muschi, de obicei trichineloza)

Examen radiologic: se practica radioscopia gastrointestinala (in cazul ascaridioze

intestinale), colecistografia (ascarizii din caile biliare); se mai pot identifica chisturi
hidroaerice pe plaman, chistul hidatic cu localizare pulmonara, si cisticercoza
musculara sau cerebrala

21
Metode endoscopice: rectosigmoidoscopia (tricocefalilor, oxiuri, ascarizi),
colonoscopia asociata cu biopsi si citologia tintita (oxiuri, tricocefali, ascarizi adulti,
proglote de tenie, amibiaza, balantidioza, schistosomiaza rectal), gastroscopia (ascarizi
sau proglote de tenie)

Metode imagistice: nu au un teren prea larg de aplicare cu exceptia hidatidozeri cu

varii localizari:

 Scintigrafia (localizare in ficat)

 Ecografia combinata cu sistemul imagistic Doppler

 Tomografia computerizata (in plamani, ficat, localizare cerebrala sau splenica,

etc.)

Modificari ale constantelor sanguine in parazitoze:

 anemia (de exemplu in helmintiaza)

 poliglobulia (ankilostomiaza)

 leucopenia (leishmanioza viscerala sau malarie)

 leucocitoza (helminti: malarie, amibiaza hepatica, tripanosomiaza africana,

trichineloza, fascioloza)

 viteza de sedimentare a hematiilor (amibiaza metastatica, tripansomiaza

africana)

 eozinofilia parazitara (helmintiaza unde creste constant, in cazul protozoarelor

se modifica doar inconstant si cu intensitate mica)

*apare o curba de eozinofilie in cazul helmintiazelor – descrie o curba de forma

clopot; dupa patrunderea hemintului in organism urmeaza o perioada de latenta, apoi o
perioada de crestere rapida, apoi o perioada de stationare (variabila), apoi o perioada
de scadere (la inceput rapid, apoi din ce in ce mai lent), stabilizandu-se usor deasupra
normalului – se numeste curba lui Lavier, care urmeaza ciclul de viata al parazitului

*specia de helmint determina intindirea curbei:

o eozinofilii mai mari de 50%: trichineloza, fascioloza - infestatii masive,

sau larva migrans

22
 o intre 15-49%: Sindrum loeffler, teniozele incipiente, parazitoze in
infestatii moderate

o sub 15%: strongiloidoza cronica, helmintiazele discrete sau in fazele de

cliva ale curbei

o cu limite normale: oxiuriaza in faza avansata de refacere, triburiaza in

faza avansata a infestarii, ascariaza intestinala, teniozele in faza avansata
a infestarii

o procentul normal este 1-4%

Alte metode de diagnostic:

 metoda Staubli (larvele de Trichinella spiralis in perioada de descuamare
circulatorie)

 reactia de formol-leuco-gelificare (leishamanioza cutanta) dar este nespecifica

 imunofluorescenta (tripanosomiazele)

 reactia de precipitare circumlarvara (schistosomiazelor, trichinelozei)

23
 Schema diagnosticului de laborator in infectiile virale:
-dianosticul virusologic se face in doua scopuri:

 primul este diagnosticul direct – prin izolarea si identificare virusurilor sau a

componentelor sale in produse patologice recoltate in primul rand de la bolnavi
sau din elemente ale mediului extern, de exemplu apa, aer si sol, sau in diversi
vectori

 indirect sau serologic – bazat pe evidentierea raspunsului imun celular sau a

celui umoral fata de o agresiune virala

-etapele diagnosticului direct:

1. recoltarea unui produs patologic (o putem face de la bolnavi, de la

diverse produse patologice, de la vectori) – recoltarea trebuie sa se faca in
momentul optim, acest moment otim trebuie sa fie cat mai repede de la debutul
bolii deoarece virusul se gaseste intr-un titru (intr-o concentratie) maxim la
inceputul bolii, titru care scade apoi progresiv pana la disparitia lui, scazand in
consecinta si sansele de izolare si de identificare;

-pentru diagnosticul serologic sau indirect trebuie folosite doua probe de ser, prima
este recoltata la debutul bolii, iar cea de a doua in convalescenta bolii, si acest lucru se
face pentru a surprinde virarea imunoglobulinelor M spre imunoglobuline G, dar si
pentru a surprinde cresterea semnificativa a titrului anticorpilor de la debutul bolii spre
convalescenta ei; ambele probe se lucreaza in aceiasi zi;

-locul de unde putem sa recoltam se stabileste in functie de patogenia bolii virale

banuite, de exemplu:

 in afectiunile respiratorii virale virusurile se gasesc de obicei in

secretiile nazo-faringiene si atunci si produsele patologice recoltate
vor fi din aceasta zona: exudat nazo-faringian, lichidul de spalatura
nazo-faringian,

 in infectiile eructive se recolteaza loichidul din veziculele de la

nivelul pielii (in infectiile cu virusuri herpetice ca exemplu) sau
chiar secretia faringiana in rujeola si variola

 in infectii ale sistemului nervos central se recolteaza LCR

(meningita), sau se mai poate recolta material bioptic cerebral

24
  in infectiile cu enterovirusuri sau cu virusul urlian (care da
parotidita epidemica-inflamatia glandelor paratiroide) se pot recolta
materii fecale

 se recolteaza sangele in infectiile cu virusul variolic

 mai rar se recolteaza urina

-secretiile nazofaringiene le recoltam pentru izolarea virusurilor respiratorii

(virusurile gripale, adenovirusuri, rinovirusuri, virusul sincitial respirator VSR,
reovirusuri, coronavirusuri); secretiile nazofaringiene reprezinta atat poarta de intrare
dar si locul lor de multiplicare; tot secretiile nazofaringiene se pot folosi pentru
izolarea de enterovirusuri (cele mai importante sunt virusurile polio, precum si virusul
rujeolos); ca si mediu de transport pentru aceste produse patologice se foloseste
mediul Hanks; este atat un mediu de transport cat si de conservare

-materiile fecale se recolteaza pentru virusurile care se elimina si dezvolta la

nivelul tubului digestiv, cum ar fi: virusurile polio/enterovirusurile adica virusurile
Coxsackie (produc angine/faringite, conjunctivite, meningite, miocardite) si virusurile
Echo (cuprinde virusuri ARN – acest tip de virusuri produc foarte multe tipuri de
inbolnaviri-de la boli febrile la copii, pana la meningite; e-enteric, c-cytopathic, h-
human, o-orphan)

-lichidul cefalorahidian este recoltat in meningite si in meningo-encefalite de

natura virala, care sunt produse de diverse virusuri: virusul chorio meningitei
limfocitara benigne (adica meningitele date de virusul echo si coxsackie)

-produs patologic recoltat din leziunile cutanate sau mucoase (adica vezicule,
fustule, cruste), in diverse afectiuni (variola, varicela, herpes)

-sangele se recolteaza pentru izolarea virala si in acest caz se foloseste cheagul,

iar cel de-al doilea scop este diagnosticul serologic in care se identifica anticorpii din
corpul pacientului; se recolteaza in infectii cu rujeola, cu virusul urlian, si cu
arbovirusuri (virusurile transmise prin artropode care sunt hematofage) – de exemplu
infectarea cu virusul Westnile care se transmite prin tantari, sau virusul febrei Dengue

-destul de frecvent putem recolta produse necrotice, recoltate in primele 4-5 ore
de la deces, de exemplu: fragmente de plamani in infectiile respiratorii, de trahee in
infectiile cu virusul rabic, de ficat in hepatite, chiar si maduva osoasa in infectiile cu
virusuri polio

25
 2. transportul probelor recoltate – trebuie sa fie cat mai rapid, sau daca
acest lucru nu este posibil se pot folosi metode de conservare a produsului, de
exemplu:

a. congelarea la temperaturi intre -20 - -70 de grade celsius,

b. sau liofilizare care este de fapt o deshidratare in vid si la temperaturi

scazute; produsul patologic liofilizat se reface prin adaugarea in
momentul utilizarii a unei cantitati de apa distilata care este egala cu
volumui lui initial;

c. metoda cu glicerol (50%) folosit pentru diverse fragmente tisulare sau

fecale

-produsele patologice se trimit la laborator in termosul cu gheata sau zapada

carbonica, sau cel mai bine liofilizate

3. diagnosticul virusologic:

 Izolarea virala – se face la randul ei prin cultivarea virusurilor in condii de

laborator; la randul ei aceasta cultivare se face printr-un procedeu denumit
inoculare in asa numite sisteme biologice sensibile:

o Animalul de laborator

o Oul de gaina embrionat

o Culturile celulare

 Diagnosticul serologic – evidentiaza anticorpii serici specifici din corpul

bolnavului si va aprecia cresterea semnificativa a titrurilor pe parcursul bolii;
cresterea semnificativa inseamna cresterea anticorpilor in proba a doua, uneori
chiar si in proba a treia, raportat fata de proba 1 de minimum 4 ori; se recolteaza
2-3 probe de ser: prima la debutul bolii (precoce) in primele 3-4 zile de boala,
cea de a doua in convalescenta bolii dupa 7-14 zile de boala (tardiva), si uneori
poate fi necesara o a treia proba (intre zilele 30-40), aceasta proba fiind necesara
daca primele 2 probe sunt negative dar exista simptomatologie care sugereaza o

26
 viroza sau cand exista o infectie virala in care anticorpii apar foarte tarziu (ex:
VSR, infectiile cu virusurile paragripale); cateva exemple de reactii serologice:

o Reactia de fixare a complementului

o Reactia de hem-aglutino-inhibare

o Reactia de hemaglutinare

o Imunodifuzia radiala

o Reactia de seroneutralizare

o Diverse reactii imunoenzimatice: imunofluorescenta, elisa

Cultivarea virusurilor pe culturi celulare:

-virusurile sunt structuri acelulare, “parazite,” strict intracelular, fara enzime si ca
urmare inerte metabolic, si ca urmare incapabile de multiplicare in afara celulelor vii;
cultivarea virusurilor se poate face doar pe sisteme biologice, care sunt de fapt niste
substraturi din celule animale, care le confera celule vii; aceste surse e celule vii sunt
animalul de laborator, oul de gaina embrionat si cultura celulara – cele mai multe
virusuri se pot cultiva pe cel putin una din acestea (HIV de exemplu nu se poate
cultiva pe niciuna)

-culturile celulare reprezenta cel mai utilizat sistem biologic pentru cultivare; a fost
introdus pe la mijlocul anilor 1949 de catre Enders; sunt importante in diagnosticul
virozelor (mai ales a celor respiratorii), cunoasterea biologiei moleculare virale si la
prepararea sau obtinerea de vaccinuri virale

-culturile celulare sunt substraturi de celule eucariote obtinute dintr-un fragment de

tesut cu ajutorul unor enzime proteolitice; celule obtinute se introduc intr-un mediu
nutritiv care le poate asigura supravietuirea dar si proliferarea/multiplicarea; mediul
nutritiv este un mediu lichid/apos care contine diverse substante nutritive (aminoacizi,
vitamine, glucoza, saruri minerale), care mai contine si un sitem tampon cu un pH de
7,4, un indicator de pH (rosu fenol de exemplu), si in anumite cazuri pentru o
dezvoltare celulara mai buna se mai poate adauga ser animal (de obicei se foloseste
serul fetal de bou in anumite concentratii, 5-10%)

-obtinerea unei culturi celulare: ele se obtin dintr-un tesut sau dintr-un organ recoltat
aseptic, apoi sectionat, apoi tripsinizat si in final agitat mecanic; in acest fel se obtine o
suspensie celulara care se introduce in niste flacoane de sticla (flacoane Roux)

27
impreuna cu un mediu nutritiv de crestere; flacoanele acestea de sticla se introduc apoi
la termostat conditii de dezvoltare in care celulele adera de peretii de sticla, se
multiplica si in final conflueaza astfel inca dupa un interval de 7-10 zile celulele vor
ajunge sa formeze un monostrat (care se poate examina zilnic microscopic)

-exista trei tipuri de culturi celulare:

 Culturile celulare primare: ele se obtin din celule animale sau umane
prelevate dintr-un tesut sau organ viu si cultivate in vitro pana ajung la
confluenta si formeaza monostratul; celule obtinute din aceste fragmente
tisulare mai pastreaza unele caracteristici ale tesutului de provenienta; ele sunt
de doua subtipuri:

o Fibroblast like – sunt formate din celule alungite paralele si orientate

regulat

o Culturile epitelial like – format din celule poligonale dispuse sub forma
de plancarde

-din ele dupa desprindere cu tripsina (c 0.025%) se obtin suspensii celulare care se pot
subculiva de 5-6 ori dupa care celulele mor; ca si exemple de culturi celulare primare:
din tesutul renal de maimuta sau de iepuer

 Culturi de celule diploide – se obtin din tesut embrionar; ele pastreaza aspectul
morfologic dar si cariotipul celulelor de provenienta; ele se pot cultiva de 50-60
de ori, dupa care celulele imbatranesc si mor; se obtine: din plamanul embrionar
uman, sau din tegumentul nou-nascutului

 Linii celulare continue – acestea se obtin din tumori sau din celule diploide
care si-au pierdut inhibitia de contact si practic se multiplica nelimitat; celulele
obtinute din aceste tumori nu seamana cu cele de provenienta si nici informatia
genetica nu mai este aceiasi; cariotipul lor va fi unul de tip poliploid (nu vor
putea fi folosite la preparea de vaccinuri virale); exemple de linii celulare
continui: linia Hela (se obtine din carcinom de coluterin), linia celulara HEP2
(se obtine din carcinom de laringe)

-produsul patologic recoltat si prelucrat corespunzator, pentru fiecare proba se

inoculeaza cate 4 placi/flacoane cu o canitate de 0,1-0,3 ml de produs patologic; se
pastreaza ca marton o placa de inoculare; placile inoculate se introduc la termostat la
37 grade celsius, interval necesar pentru a se produce adsorbtia la suprafata celulelor;
se adauga apoi mediu de intretinere si se pastreaza flaconele la 37 de grade; culturile

28
se examineaza zilnic la microscop urmarind aparitia asa numitelor efecte ale replicarii
virale in celule si se compara cu culturile martor

-efectele replicarii virusurilor in culturile celulare:

 Efectul citopatic - el se refera la niste modificari morfologice caracteristice

aparute la inocularea virusului in culturi celulare susceptibile (sensibile),
consecutive multiplicarii virusurilor citopatogene; efectul se observa la
microscop si dovedesc atat prezenta cat si mutiplicarea virusului in cultura
respectiva

o Poate sa apara balonizarea celulelor din cultura

o Rotunjirea celulelor

o Refringenta lor

o Formarea de sincitii celulare

o Desprinderea monostratului celular

-ex de virusuri citopatice: virusurile echo, polio, citomegalovirusuri (CMV), virusurile

herpetice, virusul varicelo-zosterian

 Hemadsorbtia – consta in adsorbtia eritrocitelor pe suprafata celulelor care au

replicat virusurile; se pun in contact o cultura celulara infectata cu o suspensie
de eritrocite animale; aceste eritrocite se vor adsorbi pe celulele infectate si nu
se mai desprind la agitarea mediului de cultura; cauza acestui fenomen este
exista unor structuri virale care se numesc hemaglutinine (virusruiel gripale si
paragripale in mod special)

 Formarea de incluzii virale in celulele gazde – apar mai ales la virusurile

herpetice simple si la VSR, la virusul rabic; incluziile virale sunt niste
formatiuni din care se sintetizeaza componente virale, sau chiar virion; pot fi
situate aceste incluziuni inracelular (in celulele gazda) si se dezvolta in cursul
multiplicarii virale; au diverse culori si pot fi unice sau mutiple, de diverse
dimensiuni, fie rotunde fie mai neregulate, acidofile unele si bazofile altele, cu
diverse dispozitii (intranuclare – adenovirusurile, herpetice, altele
intracitoplasmtice – virusul rabic)

 Interferenta – este un fenomen in care consecutiv infectiei virale celulare cu

doua virusuri, multiplicarea unuia este inhibata (ex: virusul rubeolic); virusurile

29
 necitopatice (virusul rubeolic) pot fi detectate in acest fel indirect prin
incapacitatea celulelor infectate cu acest virus de a replica un virus sigur
citopatogen, de exemplu sa zicem virusul echo

 Hemaglutinarea – este asemanatoare cu hemadsobtia, proces in care

multiplicarea virala in culturi elibereaza in mediu particule virale care in
prezenta eritrocitelor animale proaspete se adsorb intr-o prima faza la suprafta
lor, dupa care vor produce aglutinarea eritrocitelor; fenomenul este caracteristic
virusurilor gripale, paragrilae, adenovirusuri, virusuri echo

-efectele acestea duc la o identificare prezumptiva a virusului, urmand ca identificare

finala sa se faca prin colorarea si examinare la MO sau ME, dar si prin diverse reactii
serologice

Cultivarea virusurilor pe oul de gaina embrionat:

-la exteriorul oul de gaina embrionat se gaseste coaja; sub si paralel cu ea se gaseste
membrana proprie; sub aceasta membrana proprie se gaseste o alta membrana
denumita chorio-alantoidiana care contine vasele sangvine; aceasta membrana chorio-
alantoidiana spre partea bombata a oului se desprinde si se pliaza in doua foite intre
care se gaseste cavitatea alantoidiana, cavitate ce contine lichidul alantoidian

-cavitatea si lichidul alantoidian au un dublu rol: in primul rand au rol de protectie a

embrionului fata de factori mecanici; ele reprezinta si locul de excretie pentru
embrion; central se gaseste dispus embrionul care este inchis la randul lui intr-o

30
cavitate denumita amniotica, plina si ea cu lichid amniotic, este un lichid clar si
cristalin si tot cu rol de protectie

-de embrion este legat o portiune denumita sac vitelin care are rol nutritiv; ultimul
element este camera de aer spre partea bombata ce se gaseste intre cele doua
membrane; inocularea oului cu virusuri se poate face in toate elementele componente;
inaintea inocularii ouale se examineaza la un dispozitiv denumit ovosco (procedeul se
numeste MIRARE – notandu-se pozitia embrionului si conturul camerei de aer) in
scopul vizualizarii embrionului; se va inocula o suspensie virala care este alcatuita din
produsul patologic recoltat de la bolnav si care este apoi prelucrat

-inocularea este introducerea unei anumite cantitati de germeni pentru un sistem

biologic cu celule vii; inoclul este o anumita cantitate dintr-o suspensie celulara (poate
fi fie bacteriana, virala, parazitara) care este introdusa fie intr-un mediu de cultura
artificial (cum este in cazul bacteriilor), fie intr-un sistem biologic in scopul cultivarii
acestor microorganisme

-scopurile cultivarii virale pe ou de gaina embrionat sunt doua: izolarea si apoi

identificarea virala, pentru preparare sau obtinere de vaccinuri virale (gripale), pentru
prepararea si obtinerea de antigene

-se folosesc ouale cu coaja alba ale gainilor din rasa Langhorn, crescute ferite de
contaminanti; se folosec ouale fertilizate (embrionate) care sunt mentinute la 37 grade
Celsius si umiditate de 70-80%, conditii care sunt necesare pentru o dezvoltare
normala a embrionului; ouale se intorc de 2-3 ori pe zi pentru a evita adeziunea la
coaja a membranelor embrionare; se inoculeaza dupa un intern de 10-20 de zile

-in primele 10 zile de incubatie embrionii de gaina au cel mai ridicat nivel metabolic
datorita proliferarii celulare intense; tesuturile oului de gaina embrionat sunt niste
tesuturi nediferentiate si ca urmare si susceptibilitatea la infectie este uniforma;
concomitent cu acest lucru si proliferarea virala pe acest tesut este maxima; oul de
gaina embrionat este deci un sistem biologic cu celule nediferentiate, este un mediu
steril, cu multiplicare activa si in acelasi timp este si lipsit de procese de aparare
antiinfectioase; in primele 3 zile de incubare se formeaza cele trei foite embrionare

-caile de inoculare ale oului de gaina embrionat:

 Pe membrana chorio-alantoidiana; pentru a realiza acest procedeu se fac doua

orificii in coaza oului, un orificiu se face lateral in dreptul embrionului, cel de-al
doilea orificiu se face la nivelul camerei de aer; la nivelul orificiului de la
camera de aer se pune fie o seringa sau para de cauciuc care sa aspire; in felul
31
 acesta membrana chorio-alantoidiana se va deplasa in portiunea mai inferioara,
si astfel va aparea o camera falsa de aer; prin orificiul lateral se va introduce
inoculul (o cantitate de 0,2-0,5 ml de inocul); dupa acest procedeul cele doua
orificii se acopera cu ceara topita

 Inocularea in cavitatea alantoidiana – pentru acest procedeu avem nevoie de

aceleasi doua orificii: cel de la nivelul camerei de aer si cel lateral; de aceasta
data se introduce acul si se strabat cele doua membrane si se va ajunge in
cavitatea alantoidiana;

 Inocularea in cavitatea amniotica – se face doar prin orificiul de la nivelul

camerei de aer; patrunzandu-se cu acul pana in dreptul embrionului

 Inocularea in sacul vitelin prin orificiul de la nivelul camerei de aer,

patrunzandu-se cu un ac la 45 de grade in directie opusa embrionului

-dupa inoculare pe oricare din aceste cai, ouale se incubeaza la 37 grade Celsius pentru
un anumit interval de timp (3-7 zile) cu examinare zilnica ovoscopica; moartea
embrionului in primele 24 h de la inoculare se datoreaza altor cauze, nu multiplicarii
virale si in consecinta aceste oua cu embrionul mort in primele 24 h se vor indeparta;
dupa acest interval de timp ouale se refrigereaza la 4 grade Celsius, dupa care se pot
face recoltari de lichide: alantoidiana, amniotic, fragmente de sac vitelin, sau de
membrana chorio-alantoidiana

-pe recoltarea de membranei chorio-alantoidiene apar asas numitele zone de necroza

denumite poxuri; lichidele recoltate le putem folosi pentru diverse reactii serologice
(hemaglutinare, hemaglutinoinhibare, etc) in scopul identificarii

-efectele replicarii virale in oul de gaina embrionar:

 Moartea embrionului (dupa mai mult de 24 h)

 Acumularea de hemaglutinine

 Formarea de poxuri pe membrana chorio-alantoidiana

-aceasta metoda cu oul de gaina embrionat se foloseste pentru izolarea si identificare

virusurilor gripale si paragripale, dar si pentru prepararea de vaccinuri; inocularea pe
membrana chorio-alantoidiana este mai utila pentru poxvirusuri (virusul variolic este
cel mai important, dar si pentru virusurile herpetice, pentru paramixovirusuri – New
Castle); in schimb inocularea in cavitate amniotica si embrionara se foloseste pentru
virusurile gripale, paragripale, rujeolic, urlian
32
 Cultivarea virusurilor pe animalul de laborator:
-scopurile in care se face aceasta cultivare:

 Pentru izolarea virusurilor care nu cresc pe culturi celulare

 Cercetarea sau studierea oncogenezei si a patogeniei bolilor virale

 Cercetarea mecanismelor imunitatii virale

 Mai ajuta si la producerea de seruri specifice de referinta (sunt niste seruri care
contin anticorpi cunoscuti)

 Controlul vaccinurilor virale

-pentru cultivare se prefera animalele mici care cresc si se inmultesc rapid si sunt usor
de intretinut; un alt avantaj al acestui tip de animal este faptul ca sunt usor de
manipulat; ele sunt sensibile fata de virusurile care produc boli umane; aceste
organisme animale permit reproducerea experimentala a bolilor (putem sa reproducem
in organismul lor ceea ce se poate produce in organismul uman); ex: iepurele, cobaiul,
hamster, sobolanul, soarecele alb

-animalele mari, de ex oaia, capra, calul, boul, se folosesc pentru obtinerea de seruri
imune diagnostice sau terapeutice; de la ele putem sa recoltam diverse produse, de la
sange integral, plasma, hematii

-iepurele si cobaiul se pot folosi pentru izolarea virusurilor: rabic, herpetice, precum si
pentru obtinerea de seruri imune; soarecele alb serveste pentru izolarea virusului rabic,
a virusurilor gripale, dar si virusurile Coxsackie; maimuta se foloseste pentru izolarea
virusurilor polio, a virusurilor encefalitice, precum si pentru obtinerea de culturi
celulare;

pentru inoculare se folosesc animale sanatoase si care sunt tinute sub observa un
interval de timp (5-10 zile) anterior inocularii; manipularea lor se poate face fie
manual (prinzandu-le de coada si de pielea cefei), fie cu diverse aparate; anestezia are
rolul de a suprima temporar sensibilitatea organismului animal sau a unei parti din
acesta; anestezia se poate face cu un tampon de vata imbibat cu eter sau cloroform
care se introduce sub un cristalizator sub care se gaseste si animalul

33
-caile de inoculare ale animalului (calea de inoculare se stabileste in functie de
tropismul virusului presupus a fi in produsul patologic respectiv):

 Calea cutanata – o folosim cu precadere la iepure; poate fi de doua tipuri:

o Epidermic – pe pielea fara par a animalului se intinde produsului

patologic cu un tampon, dupa care se lasa sa se usuce (badijonarea pielii)

o Intradermica – ea se face prin scarificarea (usoara zgariere) pielii sub

forma unor linii superficiale si paralele, urmata si aceasta de badijonarea
zonei cu tamponul incarcat cu produsul de inoculat

 Calea mucoaselor – dupa scarificarea superficiala a acestora (mucoasa corneana

in cazul iepurelui, mucoasa conjunctivala, sau chiar la nivelul camerei
anterioare a ochiului)

 Calea injectabila:

o Calea intramusculara (musculatura coapsei de preferat)

o Subcutanata

o Intravenoasa (avem nevoie de vene de calibru mai mare, de ex venele

cozii la soarece)

o Intraperitoneala – introducerea inoculului printr-un pliu al peretelui

abdominal

o Intracerebrala – mai ales pentru a diagnostica rabia si al infectiei cu

virusurile polio (amplicabila la soarece, chiar si la iepuri)

 Inoculare prin caile aeriene superioare – fie prin inhalarea produsului patologic
care este practic pulverizat la acest nivel, fie prin instilatii nazale (se pun
picaturi la nivelul cailor aeriene); se mai pot face inoculari intratraheale

 Inoculare pe care digestiva – prin inoculare produsului patologic intr-un

aliment, sau prin sondaj gastric

-dupa inoculare urmeaza asa zisa perioada de incubatie a bolii; temporal aceasta
perioada dureaza de la inoculare pana la aparitia manifestarii bolii; durata este
variabila in functie de virusul inoculat, de specia animala dar si de calea de inoculare

34
-dupa aceasta perioada de incubatie urmeaza perioada simptomatica a bolii cu
manifestarile specifice, urmata apoi de o posibila evolutie a animalului prin moartea
animalului daca virusul a fost suficient de patogen, fie vindecarea urmata de perioada
de convalescenta

-din organismul animal putem face recoltari de produse:

 Sange integral sau componente ale acestuia (plasma, ser, eritrocite, leucocite) –
il putem recolta prin punctie venoasa, chiar si cardiaca

 Exudat (de ex peritoneal)

 Lichide (de ex LCR)

-in final se face autopsierea animalului; sacrificarea organismului animal se poate face
prin mai multe metode:

 Introducerea unei cantitati mari de aer pe un vas – duce la embolie gazoasa

 Sangerare in alb – sectionarea unui vas important

 Asfixie

-in final, evidentierea virusurilor si antigenelor sale se face pe baza leziunilor macro si
microscopice din tesuturi si organe; se mai poate face prin reproducereaz leziunilor si
a simptomelor specifice prin inoculare de produse in alte sisteme biologice sensibile,
urmand ca in final sa se faca identificare directa virala sau indirecta (pe baza leziunilor
si simptomelor care apar in cadrum afectiunii respective)

Reactii serologice folosite in diagnosticul infectiilor virale:

-virusul cultivat si izolat pe sisteme biologice este identificat apoi prin reactii
serologice; in infectiile virale in serul bolnavului apar anticorpi specifici fata de
componente antigenice virale; ca urmare diagnosticul indirect/serologic se bazeaza pe
detectarea si cuantificarea acestor anticorpi specifici din serul bolnavului

-anticorpii apartin diverselor clase de imunoglobuline si au proprietati diferite, si

atunci se numesc ca de exemplu: anticorpi fixatori de complement, anticorpi
hemaglutinoinhibanti, anticorpi seroneutralizanti; in functie de raspunsul imun putem
vorbi despre anticorpi de tipul: IgM (raspunsul imun primar – sunt markeri de faza
acuta, certifica deci forma acuta a infectiei virale), IgG (raspunsul imun secundar –
35
acesti anticorpi se vor determina in dinamica/pe parcursul evolutiei bolilor); pentru
acest lucru este nevoie recoltarea a doua probe de ser, prima la debutul bolii si a doua
in convalescenta pacientului

-in general, prin reactiile serologice se cauta atingerea a doua obiective diferite:

 Ele ne sunt necesare pentru identificarea si apoi caracterizarea unui virus izolat
folosind seruri standard (adica seruri care contin anticorpi cunoscuti)
 Consta in detectia anticorpilor virali din serul bolnavului utilizand de aceasta
data antigene standard (care sunt cunoscute)

-dintre reactiile serologie, cele mai folosite sunt: cea de seroneutralizare, de

hemaglutinoinhibare (HAI), de imunofluorescenta, ELISA, de fixare a
complementului, de imunoprecipitare in gel (fie ca este vorba de dubla
imunodifuzie/de imunodifuzie radiala simpla)

Reactia de seroneutralizare:
-se mai numeste si reactie de virus-neutralizare; principiul se bazeaza ca la 2-3
saptamani de la o infectie sau de la o imunizare/vaccinare in organismul bolnavului
apar anticorpi specifici care pot neutraliza infectivitatea virusului; aceasta reactie este
de tip Ag-Ac care blocheaza activitatea biologica agresiva a virusului

-interpretarea ei se face in functie de un sistem indicator; are doua etape/timpi:

 Contactul intre cei doi imunoreactanti cu formarea la sfarsitul acestui timp a

unui complex Ag-Ac (se formeaza acest lucru daca exista anticorpul omolog)
 Adaugarea sistemului indicator: cultura celulara sau animalul de laborator

-se pun in contact dilutii binare ale serului de cercetat (cu anticorpi necunoscuti pe
care vrem sa-I determinam) cu un virus standard/cunoscut titrat/caruia I se determina
concentratia si diluat; dilutiile acestea se incubeaza la 37 grade Celsius dupa care in
timpul al doilea se realizeaza inocularea sistemului biologic fie pe culturi celulare fie
pe animalul de laborator

-interpretarea reactiei: daca exista corespondenta imuna intre Ag si Ac virusul va fi

neutralizat si ca urmare nu mai apar efectele virus specifice asupra acestui sistem
indicator (citopatic, hemadsorbtie, hemaglutinare, etc.); daca nu exista corespondenta
toate aceste efecte vor fi intalnite

36
-se foloseste in infectiile cu enterovirusuri (Echo, polio, Coksackie), VRS, cu virusuri
herpetice, rujeolic, rabic

Reactia de hemaglutino-inhibare:
-se foloseste pentru identificare virusurilor hemaglutinante, si cele mai importante sunt
virusurile gripale; o mai putem folosi si pentru detectia anticorpilor
hemaglutinoinhibanti aparuti in serul bolnavului fie prin infectie, fie prin
vaccinare/imunizare; ca sa realizam aceasta reactie se pune in contact:

 Dilutii binare ale serului de testat

 Antigen viral standard
 O suspensie de eritrocite animale

-adaugarea de anticorpi inainte de punerea in contact a virusului cu eritrocitele va

impiedica adsorbtia virionilor (particulele virale) pe eritrocite; titrul inhibitor al
hemaglutinarii (adica concentratia anticorpilor hemaglutinoinhibanti) va fi data de
dilutia cea mai mare ca va inhiba hemaglutinarea de cater antigenul viral standard

-reactia este importanta in diagnosticul gripei, rujeolei, infectii cu arbovirusuri (cele

transmise prin artropode)

Reactia de imunofluorescenta:
-reactanti se leaga covalent de moleculele globulinice pe care le fac vizibile in lumina
fluorescenta; avem:

 metoda directa care ne serveste la identificarea de antigene virale tehnica in

care se va cauta antigenul intr-un frotiu din produsul patologic prin adaugarea
unui conjugat care este format din ser imun specific cuplat cu un fluorocrom,
de exemplu fluoresceina; In final examinare la microscopul cu fluorescenta
 metoda indirecta ne serveste pentru detectarea anticorpilor serici – se pune in
contact antigenul cunoscut, care este fixat de aceasta data pe lama, cu serul de
cercetare; daca acesta contine anticorpi specifici se va forma complexul Ag-Ac;
apoi se adauga conjugatul format din ser antiimunoglobulina G cuplat cu un
fluorocrom; acest conjugat se va fixa de complexul format anterior, si va

37
 rezulta un complex cuplat cu acest fluorocrom; se examineaza tot la
microscopul cu fluorescenta

-tehnica se poate folosi in infectiile cu herpes virusuri, dar si cu virusul rabic

ELISA:
-in care complexele Ag-Ac se evidentiaza cu un conjugat cu o enzima (fie peroxidata,
fie fosfataza alcalina); se interpreteaza printr-o reactie de culoare citita
spectofotometric; cantitatea de enzima este cea fixata pe sistem si va reprezenta de
fapt cantitatea de Ag sau Ac care va fi determinata

Reactia de fixare a complementului:

-se bazeaza pe capacitatea complementului de a se fixa pe complexele Ag-Ac; in vivo
(in organismul uman) complexele Ag-Ac duce la activarea complementului pe calea
clasica urmata de reactii in cascada care vor duce in final la liza complexului

-in vitro (in mediu de laborator) se vor pune in contact:

 serul de cercetat care contine anticorpi necunoscuti

 antigen viral standard/cunoscut
 complementul

-daca exista anticorpi in serul bolnavului se vor fixa pe antigen si vor forma complexul
Ag-Ac; pe acest complex se va fixa apoi complementul; ca sa vizualizam aceasta
reactie mai trebuie introdus un sistem indicator care este de fapt un al doilea complex
Ag-Ac si care se numeste sistem hemolitic (este capabil sa produca hemoliza) ce este
forma din eritrocite si anticorpi specifici antieritrocite

-interpretarea reactiei: reactia pozitiva consta in absenta hemolizei iar reactia negativa
(deci daca nu exista anticorpi specifici – neformandu-se deci un complex) va produce
hemoliza

Reactiile de imunoprecipitare in gel:

-adica dubla imunodifuzie in care intr-un strat de gel de agar se sapa godeuri sub
forma de rozeta; in godeul central se introduce un antigen cunoscut, iar in cele laterale
se introduc probe din gelul de cercetat; cei doi imunoreactanti vor difuza radial in gel
38
si acolo unde exista analogie intre ei, la locul lor de intalnire, va aparea o linie de
precipitare

-dar si imunodifuzia radiala simpla (metoda Mancini) in care antigenul cunoscut este
inglobat in gel, iar in godeuri se vor pune probe din serul se cercetare; daca exista
anticorpi specifici si migreaza radial in gel va aparea un disc vizibil de precipitare in
jurul godeului; diamentrul acestui disc este proportional cu cantitatea de anticopri din
serul de cercetat; aceasta reactie ne mai ajuta la identificarea diverselor clase de
imunoglobuline

Diagnosticul de laborator in infectiile cu virusurile gripale:

Virusul este format din genom (care contine fie ARN ori AND) care ii va conferi
infectivitatea virusului respectiv, genom care este protejat de invelisuri proteice, si
anume: capsida virala si anvelopa virala. Ambele structuri vor determina antigenitatea
virusului. Pana acum se cunosc aprox 61 de familii virale din care 21 sunt patogene
pentru om.

 Specia este formata din mai multe tulpini virale.

 Genul cuprinde grupe de specii virale cu caractere comune si cu ancestor
comun. Denumirea genului viral se scrie din limba latina iar terminatia este
virus (ex: G. Morbili Virus).
 Familia virala cuprinde grupe de genuri cu caractere comune. Terminatia unei
familii in limba latina este viridae (ex: F. Orthomyxoviridae)
 Ordinul cuprinde mai multe familii care au replicarea asemanatoare.
Terminatia unui ordin este in limba latina virales

Familia Orthomyxoviradae, Genul Influenzae virus, Speciile importante sunt

Myxovirusuri influenzae

-adica virusurile gripale; contine Myxovirusuri influenzae (din limba greaca myxo-
mucus – au tropism pentru mucusul din caile respiratorii; au fost izolate la 1930

-sunt virusuri de tip ARN, si sunt de trei tipuri: A, B, C (cele de tip C nu sunt foarte
importante); invelisul sau anvelopa are structura proteica si este reprezentata de 2
structuri glicoproteice:

 spicul de hemaglutinine (H) – exista 16 subtipuri de hemaglutinine, dar primele

3 sunt specifice omului: H1, H2, H3

39
  Bastonase de neuraminidaza (N) – de mai multe subtipuri, de la N1 la N9;
specifice omului sunt N1 si N2

-hemaglutinina este responsabila de atasarea virusului gripal de suprafata celulei

gazda; de asemenea, ea are rol de antigen in sensul ca ea va declansa productia de
anticorpi

-virusurile gripale adera prin spicul membranei de membrana celulelor epiteliale

respiratorii, apoi patrund in celulele gazda unde se inmultesc/se replica, produc
necroza epiteliala iar apoi vor determina eliberarea de particule virale noi (adica de
virioni) care vor infecta alte celule (au o perioda de incubatie scurta de pana la 6 ore
pana vor determina aparitia simptomatologieie specifice omului)

-virusul gripal de tip B este specific uman, in schimb cel de tip A poate infecta si
pasarile, respectiv alte animale (porci, cai); pasarile salbatice acvatice de tip rata,
gasca, pescarus reprezinta rezervorul natural asimptomatic al acestor virusuri; la om
cele mai frecvente infectii sunt cele cu virusul gripal de tip A, sunt cele produse de
tulpinile H1N1, H3N2, H2N2

-din punct de vedere structural virusul gripal prezinta 2 antigene: un antigen de

suprafata (S) care ii confera asa numita specificitate de tip (permite clasificarea in
tipurile A, B si C), antigenul de invelis (V) care ii confera specificitatea de subtip (cele
doua formatiuni glicoproteice, H si N)

-urmatoarele 4 sunt componenta unui vaccin gripal din acest sezon (2018-2019) pentru
emisfera nordica:

 A/MICHIGAN/45/2015 (H1N1)
 A/SINGAPORE/16-0019/2016 (H3N2)
 B/MARYLAND/15/2016
 B/PHUKET/3073/2013

-denumirea unei tulpini de virus gripal se face dupa:

 tipul antigenic de ribonucleoproteina (A, B, C)

 denumirea geografica care reprezinta locul primei izolari al tulpinei respective
 un numar de ordine al tulpinei
 anul primei izolari
 in paranteza sunt simbolurile identitatii antigenice ale subtipului de
hemaglutinina si neuraminidaza

40
-virusul gripal de tip A si B difera prin structura lor proteica interna, dar cele 2
proteine de suprafata sunt similare si acestea se modifica foarte frecvent prin procesul
de alunecare (antigenic-drift); secundar acestora apar modificari sezoniere/minore in
structura virusurilor gripale, deci apar subtipuri noi de virusuri; declanseaza asa
numite epidemii

-in alte cazuri exista comutari antigenice majore si acestea apar cu precatere la nivelul
virusurilor de tip A, si se numeste antigenic-shift, care duc la aparitia de tulpini
complet noi fata de care nu exista imunitate; aceste modificari sunt cele care vor
genera asa numite pandemii (imbolnaviri numeroase pe un areal extins) – ex:
pandemia de gripa spaniola

Diagnosticul de laborator in gripa:

-vorbim despre un diagnostic direct dar si indirect; diagnosticul direct are ca si etape:
recoltarea unui produs patologic, transportul, izolarea virusurilor gripale (prin
cultivarea pe oul de gaina embrionat si pe culturi celulare), si identificarea care este
ultima etapa (prin reactii serologice: hemaglutinare, fixarea complementului, dubla
imunodifuzie, sa); exista si un diagnostic rapid in gripa care se face pe baza reactiilor
serologice tipul imunofluorescentei, PCR, ELISA

-diagnosticul indirect/serologic se bazeaza pe reactii serologice, dintre care cea mai

importanta este cea de hemaglutinoinhibare(HAI)

Diagnosticul direct/virusologic:
-recoltarea se face in primele 3 zile de la debutul bolii: secretii nazofaringiene, secretii
traheobronhice; la copii se pot recolta si materii fecal, iar la decedati se pot recolta
trahee, tesut necroptic

-mediul de transport este mediul Hanks; transportul se face fie la 4 grade Celsius in
termon cu ghiata, fie la minus 70 de grade in zapada carbonica; o caracteristica a
virusurilor gripale este aceea ca isi pierd infectivitatea in intervalul -10 - -20 de grade
celsius, adica daca este congelat

-izolarea: produsul patologic este centrifugat iar supernatantul va reprezenta de fapt

inoculul; izolarea se va face prin cultivarea:

 pe oul de gaina embrionat – fie in cavitatea alantoidiana pentru tipurile A si B,

fie in cavitatea amniotice pentru virusurile de tip C; se inoculeaza 0,2 ml de
inocul per ou, folosind 3-4 oua per proba; ouale se introduc la 37 de grade

41
 Celsius 2-3 zile, interval dupa care se fac recoltari de lichid
amniotic/alantoidian; in final se produce o infectie generalizata dar fara
moartea embrionului; lichidele recoltate se pot folosi pentru reactiile serologice
de tipul celei de hemaglutinare (adica pentru evidentierea hemaglutininelor
virale)
 cultivarea pe culturi celulare - MDCK este cea mai folosita, este o cultura
primara din rinichi de caine, sau se mai pot folosit culturi primare din rinichiul
de maimuta; tipul A gripal se cultiva mai bine pe oul de gaina embrionat, tipul
B pe culturi celulare; aceiasi cantitate de inocul, 0.2 ml, pe fiecare eprubeta
care contine aceasta cultura, cate doua tuburi pe proba; aceste culturi se
incubeaza la 34-35 grade Celsius timp de 7 zile cu control zilnic; se constata:
o efecte citopatice: celule balonizate, marite, celule hipertrofiate, pana la
desprinderea monostratului
o hemadsorbtia – folosind eritrocite animale (efect observabil in primele 2
zile); daca exista eritrocite adsorbite acestea nu se mai deplaseaza la
agitarea mecanica a tubului

-reactia de hamaglutinare se foloseste pentru evidentierea virusului care a fost izolat

pe unul din sistemele biologice amintite anterior; ca si principiu, se bazeaza pe
aglutinarea eritrocitelor animale de catre virusurile gripale datorita hemaglutininelor;
exista 3 grupe de hemaglutinine:

 unitati structurale ale virionului – aceste hemaglutinine produc distrugerea

receptorilor mucoproteici ai eritrocitelor sub actiunea neuraminidazei; dupa
spalarea virusului de pe eritrocite ele nu mai pot fi aglutinate cu acelasi virus;
acest tip de hemaglutinine apar la virusurile gripale dar si la cel urlian
 hemaglutininele de grupa II sunt cele care nu distrug receptori eritrocitare si
apar la arbovirusuri
 cei de tip III nu fac parte din structura virionului ci se sintetizeaza in cursul
multiplicarii virale

-reactia se face prin folosirea unui antigen hemaglutinant in cantitate de 0.2 ml; acest
antigen este de fapt suspensia virala obtinuta de pe culturi celulare sau poate fi
reprezentata de lichidul amniotic, respectiv cel alantoidian daca s-a cultivat pe oul de
gaina embrionat; se mai adauga 0.2 ml de tampon fosfat salin+o suspensie de eritrocite
animale 0.5%+ser fiziologic; din acest antigen se fac dilutii binare: ½, ¼, 1/8, 1/16 etc

-ca si interpretarea reactiei de hemaglutinare: reactia pozitiva inseamna ca hematiile se

vor depunde la fundul tubului sau godeului (deci depune neregulata, granulara, sub

42
forma de rozeta cu margini crenelate), reactia negativa consta in depunerea
eritrocitelor in centrul tubului sau al godeului sub forma de disc cu margini regulate

-titrul hemaglutinant (concentratia de hemaglutinine) poate fi calculata prin

intermediul ultimei dilutiei de antigen care determina hemaglutinare totala; acest titru
il vom nota cu 1UHA (o unitate hemaglutinanta); aplicatiile acestei reactii de
hemaglutinare este: determinarea titrului hemaglutinilelor virale si evidentierea
proprietatilor lor;

-identificarea virusului gripal in cadrul diagnosticului direct se face prin reactii

serologice (fixarea completementului, dubla imunodifuzie, etc); reactia de fixare a
complementului este utila pentru a determina tipul antigenic de virus, adica A, B sau
C; in aceasta reactie antigenul este reprezentat de ribonucleoproteinile din lichidele
recoltate din oul de giana embrionat sau din culturile celulare, iar serurile cunoscute
sunt serurile omologe (sunt seruri antinucleoproteina de tip A, B, C obtinute pe
animale de laborator)

Diagnosticul indirect/serologic:
-vom cauta sa evidentiem anticorpii specifici pe seruri pereche (adica 2 probe recoltate
de la bolnav, prima in primele zile de boala, cea de a doua in convalescenta); se
urmareste practic cresterea titrului de anticorpi de minimum patru ori

-reactia de HAI este cea mai importanta, anticorpi specifici hemaglutinoinhibanti din
serul bolnavului (adica cei care inhiba hemaglutinarea virala) vor fi evidentiati
folosind ser de cercetat, respectiv serul martor; are doi timpi aceasta etapa:

titrarea antigenului – pentru a stabili unitatea hemaglutinanta (UHA) – este de

fapt o reactie de hemaglutinare si efectuarea dilutiei de antigen care va contine 4
UHA
contactul dintre dilutiile serului de cercetat cu aceasta suspensie de antigen care
contine 4 unitati hemaglutinante; si serul bolnavului trebuie diluat in prealabil:
1/10,1/20,1/40 etc; se mai introduce o suspensie de eritrocite 0.2 ml+ser
fiziolofic+tampon fosfat

-reactia pozitiva – depunerea eritrocitelor la fundul eprubetei, inhibarea HAI; titrul

hemaglutinant al serului/tritrul anticorpilor hemaglutinoinhibanti se calculeaza cu
ajurul ultimei dilutiei a serului in care concentratia de hemaglutinare inhibata este
maxima

43
-aplicatiile acestei reactii sunt 2: identificare antigenului/al virusului cu seruri imune
de referinta (adica cele care contin anticorpi cunoscuti), pentru diagnosticul serologic
in care anticorpi hemaglutinoinhibanti din serul bolnavului sunt identificati cu
antigene cunoscute/standard; ca si valoare diagnostica certa o are cresterea anticorpilor
serici in dinamica de minimum 4 ori; diagnosticul final se bazeaza pe izolarea si
identificare virusului corelata cu aceasta crestere a anticorpilor serici

Diagnosticul de laborator in hepatite:

-hepatita virala este inflamatia ficatului caracterizata prin necroza difuza sau parcelara
(pe anumite teritorii mai mici) produsa de asa numitele virusuri hepato-trope; aceste
virusuri au fost denumite cu literele alfabetului: A, B, C, D, E, F, G, dar si TT
(identificat in Japonia); afectare hepatica mai pot da si alte virusuri: virusul Epstein-
Barr, citomegalovirusuri, virusurile herpetice (herpes simplex mai ales),
adenovirusurile, s.a.

-virusul hepatitic A este cel mai benign dintre ele (da infectiile cele mai usoare); spre
deosebire de celelalte nu produce cronicizarea bolii si nici complicatii; virusul
hepatitic B poate da in 15-20% din cazuri complicatii, pana la cronicizari; virusul
hepatitic C se croniciseaza pana la 85% din cazuri, si cu complicatii

-evolutia unei hepatite se poate face fie sub forma de hepatita acuta, care apoi se poate
croniciza in timp, altele cazuri se pot complica; complicatii mai importante ar fi ciroza
hepatica si carcinomul hepatic celular

-virusul hepatitic C, similar cu virusul HIV, are un grad inalt de diversitate genetica
(are foarte multe tulpini); el poate scapa de sub supravegherea imunologica a gazdelor;
desi a fost descoperit de mult inca nu s-a putut pune la punct un vaccin eficient pentru
a combate virusului hepatitic C; pentru hepatita A si B exista vaccinuri eficiente

-virusul hepatitic A este un virus de tip ARN care apartine familiei Picornaviridae,
genul enterovirus (adica calea lui de transmitere este pe cale orala)

-virusul hepatitic B este un virus de tip AND, din familia Hepadnaviridae, genul
hepadnavirus; are mai multe cai de transmitere:

 parenteral – pe cai injectabile

 sexual
 percutac

44
  cale de transmitere materno-fetala care se poate realiza:
o antepartum adica transplacentar
o se poate realiza intrapartum prin contactul cu secretiile mamei infectate la
nastere
o postpartum mai rar prin alaptare;
 calea iatrogena – acte medicale invazive de obicei care implica folosirea de
seringi nesterile, refolosirea unor seringi, chiar si transfuziile cu sange
contaminat

-virusul hepatitei C este de tip ARN care face parte din familia Flaviviridae, cu
aceleasi cai de transmitere ca si B-ul; virusul hepatitei D este de tip ARN cu aceleasi
cai de transmitere; virusul hepatitic E este un virus de tip ARN cu aceiasi cale de
transmitere ca si A, de asemenea, este un calicivirus; virusul hepatitei F este de tip
AND si cu transmitere digestiva; virusul hepatitei G este de tip ARN si cu transmitere
parenterala

Hepatita B
-genul Ortohepadnavirus; la exterior acest virus prezinta o anvelopa glico-lipo-
proteica; principalul marker de specificitate este antigenul HBs (AgHBs) – este asa
numit antigen de suprafata

-in serul bolnavului exista doua forme ale acestui antigen, se poate gasi:

 fie sub forma de particule omogene, sferice, cu diametru de pana la 42 nm –

poarta numele de virion complet (particula DANE)
 fie sub forma de particule neomogene, tot sferice sau filamentoase, cu
diamentru ceva ma mic (20-22 nm), lipsite de AND viral si in consecinta
neinfectioase

-mai prezinta si o nucleocapsida, cu dimensiuni de 28 nm, si care prezinta la suprafata

ei o alta structura antigenica denumita AgHBc; in interiorul nucleocapsidei se gaseste
AND-ul viral; genomul cuprinde AND-ul care este partial dublu catenar

-vaccinul pentru hepatita B previne cancerul hepatic (foarte rar, mai exista si HPV
impotriva cancerului de coluterin)

Diagnostic de laborator:

-ca si produse patologice: sangele, tesutul hepatic recoltat prin biopsie hepatica sau
necropsie

45
1. examenul direct nu se utilizeaza curent, dar atunci cand se utilizeaza poate
evidentia fie prezenta antigenelor virusului hepatitic B pe preparate pe tesut hepatic; se
poate evidentia antigenul HBc care este strucutura evidentiata in nucleii hepatocitelor
dar si antigenul HBs evidentiat in citoplasma fie prin imunofluorescenta, fie prin
ELISA

-se poate evidentia in unele cazuri si virionul complet sub forma de particule sferice
evidentiabile din ser prin microscopie electronica

2. diagnosticul imunologic (imunodiagnostic) – este mult mai folosit, deoarece

virusul hepatitei B nu se poate cultiva pe culturi celulare si reproducerea
experimentala a bolii are aplicatii restranse; de aceea diagnosticul de hepatita B se face
prin demonstrarea unor anumiti markeri de imbolnavire in serul bolnavului

-markerii sunt de doua tipuri:

o structuri antigenice sau componente virale – in ordinea lor de aparitie sunt:

o AgHBs –primul care apare in incubatia bolii
o AND polimeraza virala
o AgHBe – apare in perioada de stare a bolii
o AgHBc – apare exceptional in ser
o AND-ul viral – ultimul care apare
o Structurile anticorpice sau anticorpi serici specifici:
o AcHBc (adica anticorpi antiHBc): IgM, IgG
o AcHBe
o AcHBs

-pentru a evidentia toti acesti markeri se pot folosi diferite tehnici de laborator:

o Imunodifuzia
o Contraimunoelectroforeza
o Reactia de fixare a complementelui
o ELISA
o Latex-aglutinare

-practic in cadrul acestui diagnostic se urmareste dinamica markerilor pe probe duble

de ser pentru a confirma in primul rand diagnosticul, pentru a afla forma de boala si
prognosticul bolii

-ce ne mai ajuta in diagnotic sunt o serie de investigatii biochimice:

46
  Cele care se refera la tulburarile metabolismului pigmentilor biliari
o Cresterea bilirubinei serice peste valorile normale (peste 1 mg, daca se
ajunge la 5mg apare coloratia tegumentara – icter)
o Prezenta urobilinogenului in urina
 Teste de hepatocitoliza prin cresterea:
o ASAT = TGO
o ALAT = TGP
 Tulburarile metabolismului proteinelor serice:
o Scaderea albuminelor
o Cresterea fractiilor globulinelor
o Inversarea raportului intre albumine si globuline (care in mod normal
trebuie sa fie supraunitar)

Dinamica markerilor virali:

-antigenul HBs apare in sangele infectatilor in primele 2 saptamani de la infectie si se
poate mentine pana la 3 luni ( in mod normal ar trebui sa dispara dupa 3 luni);
decelarea lui reprezinta un diagnostic pozitic de hepatita B; persistenta lui peste 3 luni
reprezinta trecerea lui spre o posibila cronicizare

-anticorpii anti HBs apar in convalescenta bolii si semnifica imunitatea post

infectioasa si vintecarea; sunt singurii anticorpi cu actiune protectiva; apar dupa un
interval de timp de la negativarea antigenului HBs, rezultand in acest fel o asa numita
“fereastra serologica;”

-antigenul HBc (cel de capsida) se deceleaza in hepatocite prin imunofluorescenta;

foarte rar apar in sange; organismul sintetizeaza anticorpi anti HBc si cei de tip IgM
sunt markeri an unei infectii acute si recenta; cand dispar semnifica vintecarea iar
persistenta lor reprezinta inca prezenta bolii (semnigica multiplicarea)

-antigenul HBe il intalnim tot in capsida virala dar este decelabil in sange; apare destul
de timpuriu, cam in acelasi timp cu HBs si cu AND polimeraza; reprezinta si el un
indicator de replicare virala; este tot un marker de infectiozitate a sangelui

-anticorpii HBe apar ceva mai tarziu (4 saptamani de la aparitia icterului daca acesta
exista); diparitia lor este indicator de vindecare si persistenta lor indica evolutie spre
cronicizare

-produse umane care contin antigen HBs, adica virus hepatitic B: sangele si derivate
(mase eritrocitare, leucocitara, trombocitara, plasma umana, fibrinogenul, trombina,

47
serul de convalescent), chiar si sangele menstrual, diverse secretii (secretia biliara,
secretia spermatica, vaginala, chiar si laptele matern in foarte putine cazuri), saliva

-hepatita B este considerata cea de-a treia boala cu transmitere sexuala dupa sifilis si
gonoree

-nu contin virus hepatitic B: albumina umana, imunoglobulinele fibrina,

plasminogenul; in urina apare inconstant virusul hepatitic B si nu apare in scaun

-pentru diagnosticul hepatitei B in mod uzual se cerceteaza prezenta urmatorilor

markeri de infectie:

 Antigenul HBs (cel mai sensibil test de determinare a lui este cu ELISA) – daca
testul este negativ acest lucru nu infirma diagnosticul
 Anticorpii anti HBc de tip IgM (markeri de infectie acuta si ei) din ser
 Antigenul HBe din sange
 Cel mai bun marker de infectie este determinarea AND-ului viral si se poate
decela din ser, saliva, genomul hepatocitelor, diferite secretii (se numeste
determinarea incarcaturii virale – viremia); dezavantajul este ca este mult mai
scump

-tehnicile de laborator prin care pot fi evidentiati acesti markeri:

 Imunodifuzia – se bazeaza pe obtinerea unui precipitat imun Ag-Ac sub forma

unei linii opace intr-un suport de gel transparent; se preparata godeuri in strat de
agaroza, iar in godeul central vom introduce un ser de referinta cu anticorpi HBs
cunoscuti (obtinuti de la un animal) iar in godeurile laterale se vor introduce
serurile de testat; se incubeaza la temperatura camerei iar daca va aparea o linie
de precipitare intre godeul central si cel in care se afla serul inseamna ca exista
prezenta antigenelor HBs
 Electroimunodifuzia (contraimunelectroforeza) – este o tehnica mai sensibila
si mai rapida decat prima si este de fapt o dubla difuzie a antigenului si a
anticorpilor aflati in godeuri in strat de agaroza si sub actiunea unui camp
electric; se stie ca antigenele, albumina, alfa si beta globulinele migreaza spre
electrodul pozitiv; anticorpii, respectiv gama globulinele vor migra spre
electroduc negativ, iar cei doi imunoreactanti vor forma la locul lor de unire o
linie de precipitare; se fac diferite dilutii ale serului de testat (1/10, 1/20, 1/40,
1/80, 1/160) spre polul negatic, iar spre cel pozitiv se introduc in godeuri seruri
standard cu anticorpi anti HBs; se conecteaza apoi la un camp electric pentru o
ora aproximativ si se citeste dupa 24 h; prezenta antigenului HBs se marcheaza

48
 prin linia de precipitare; se poate afla si titrul de antigen (este data de ultima
dilutie); ca sa fie semnificativ acest titru trebuie sa fie de minim 1/10
 ELISA (varianta directa pentru evidentierea antigenului HBs) – aceasta tehnica
foloseste anticorpi care sunt conjugati cu enzime (peroxidaza sau fosfataza
alcalina) pentru a evidentia complexele imune; fixarea acestui conjugat pe
complexele imune Ag-Ac se evidentiaza printr-o reactie de culoare rezultata in
urma actiunii peroxidazeri asupra unui substrat (asupra peroxidului de uree care
se introduce in aceasta reactie); intensitatea reactiei de culoare este direct
proportionala cu cantitatea de complexe imune specifice; se citeste
spectofotometric; se folosesc lame cu godeuri care sunt captusite anticorpi anti
HBs de captare; se adauga apoi serul/proba de cercetat cu antigen HBs ce se
doreste a fi evidentiat; daca ele exista se formeaza complecul Ag-Ac; se
incubeaza si se spala apoi dupa care se adauga anticorpi de detectare conjugati
cu peroxidaza; acest conjugat se ataseaza de complexul imun format anterior si
rezulta un complex imun cuplat cu enzima; se incubeaza si se spala din nou si
apoi se adauga substratul specific pentru enzima din conjugatul respectiv (adica
se adauga peroxid de ure), impreuna cu un cromogen (de exemplu ortofenilen
diamina); se incubeaza la intuneric 24 de h, stopare cu acid sulfuric, si in final
citire spectofotometrica cu o reactie de culoare portocalie

Diagnosticul de laborator in infectiile cu HIV:

-virusurile HIV (1 si 2) au fost descoperite la inceput anilor ’80 (1983) si produc o
imbolnavire denumite sindromul de imunodeficienta dobandita (SIDA sau AIDS),
caracterizat prin prabusirea sistemului imunitar si mai ales printr-un deficiti imunitar
exprimat la nivel celular; secundar acestui deficit imunitar apar mai frecvent o serie de
infectii care se numesc oportuniste (infectii care apar mai frecvent pe un sistem
imunitar deficient neaparand intr-un organism cu un sistem imunitar
norma/competent); neoplaziile (diverse forme de cancer), tulburari neurologice pot
aparea in urma unei astfel de infectii

-HIV 1 este mai virulent decat HIV 2 si prezinta mai multe subtipuri (11) notate cu
literele alfabetului de la A la J+un grup principal M; in Romania si Republica
Moldova subtipurile mai frecvent circulante sunt B, C, F si H

-virusurile HIV fac parte din familia Retroviridae, subfamilie Lentivirinae (sunt
virusuri lente – infectia poate dura un timp foarte indelungat), sunt virusuri de tip

49
ARN; au in componenta o enzima – reverstranscriptaza – care asigura un flux retur al
informatiei genetice de la ARN la AND, invers decat directia normala

-virusul HIV 1 este un virus limfotrop (are tropism pentru limfocite) si neurotrop
(prefera sistemul nervos); afecteaza limfocitele T4/TH care au la suprafata lor
receptorul CD4; mai ataca si monocitele si macrofagele si sistemul nervos
favorizand tumorogeneza (de exemplu limfoame si sarcoame)

-pentru transmiterea virusurilor HIV este necesar contactul cu diverse secretii care
contin plasma sau limfocite: sangele, lichidul seminal, exudat de la nivelul plagilor;
cele trei cai importante de transmitere sunt: sexuala, parenterala (sange si derivate),
verticala (de la mama sla fat); teoretic exista si posibilitatea infectarii prin saliva sau
aerosol, dar foarte rar; virusul nu se transmite prin contact interuman nesexual sau prin
vectori

Diagnostic de laborator:
-se bazeaza pe evidentierea a 3 componente: anticorpii antiHIV, antigene virale,
determinarea ARN-ului viral; uzual sau cel mai frecvent se determina anticorpii
antiHIV; cel mai utilizat test este ELISA (varianta indirecta)

-anticorpii sunt decelabili dupa 1 pana la 4 luni dupa infectie; testul ELISA este un test
sensibil, specific si este ieftin; dezavantajul este faptul ca poate da rezultate fals
pozitive (pot sa apara in cadrul unor boli autoimune – lupus eritomatos de exemplu, la
alcoolici si intr-o serie de boli limfoploriferative, adica neoplazii de cancer); se vor
accepta rezultatele pozitive ale acestei determinari numai dupa repetarea testului si
apoi efectuarea unui test de confirmare – de regula Western Blot

-testul ELISA poate fi insa si fals negativ, intre momentul infectant si pana la un
interval de 6-12 saptamani, moment in care apar anticorpii (fereastra serologice); in
acest interval bolnavul este contagios chiar daca din punct de vedere serologic este
negativ

-alte teste sau examene de laborator care ne ajuta in diagnosticul acestei infectii sunt
testele care exploreaza functia imunitara afectata (deficitul imunitar cu alte
cuvinte):

 leucopenia (scaderea numarului de leucocite sub 4000 pe mmc)

 limfopenie (sub 1500)
 trombocitopenie (sub 100 de mii)

50
  scaderea limfocitelor T4 (sub 400 de mmc/valori normale 500-1500); in urma
scaderii T4 apare un raport subunitar intre T4 si T8
 o serie de teste cutanate pentru imunitatea celulara care vor fi negative la
pacientii cu HIV; de exemplu intradermoreactia (IDR) la tuberculina este
negativa
 cresterea gamma globulinelor (este parametrul care exploreaza imunitatea
umorala
 mai este crescuta beta2 microglobulina serica (peste 3mg%/L) din cauza
distructiei limfocitelor

-diagnosticul direct in infectia cu HIV este putin utilizat deoarece izolarea virusului
pe culturi celulare nu este posibila, in schimb se poate utiliza PCR ca reactie de
amplificare in vitro a segventelor de ARN virale

 determinarea ARN-ului plasmatic viral/incarcatura virala – se poate face

prin reverse transcription PCR (RT-PCR) – este cea mai buna tehnica de
decelare a virusului

-diagnosticul indirect este cel mai frecvent utilizat si se bazeaza pe depistarea

anticorpilor antiHIV din serul bolnavului prin tehnici imunoenzimatice (ELISA si
Western Bloth);

 tehnica ELISA indirect pentru depistarea anticorpilor antiHIV – se poate

folosi ca test screening/depistare in masa (depistarea pe o masa populationara
mai mare); lamelele cu godeuri sunt captusite de aceasta data cu antigen de
captare artificial preparat obtinut din glicoproteina 41 (este o glicoproteina
transmembranara) si din proteina 24; apoi se adauga serul de cercetat (al
bolnavului) in care se vor cauta anticorpii omologi (antiglicoproteina 41,
antiproteina 24); daca sunt gasiti se va forma complexul imun Ag-Ac; are loc
incubarea si apoi spalarea dupa care se adauga conjugatul format din anticorpi
antiimunoglobulina umana si enzima (peroxidaza) care se vor fixa pe complexul
format anterior, formand in final un complex imun cu o enzima; apoi se adauga
substratul specific pentru enzima (peroxidul de uree) impreuna cu un cromogen;
are loc iarasi incubare la intuneric si spalare si in final citire la spectofotometru;
rezultatele sunt calitative
 aceste teste de depistare de tipul ELISA sunt de generatia I si a II – cel de
generatia I foloseste antigene proprii invelisului viral, cele din generatia a II a
antigene din miezi obtinute prin inginerie genetica

51
 tehnica Western Bloth – se bazeaza pe faptul ca numeroase membrane
sintetice pot lega proteine suficient de puternic astfel incat ele devin suport
pentru o serie de reactii imunologice in faza solida; proteinele legate in acest fel
de aceste structuri sintetice membranare isi pastreaza reactivitatea antigenica si
sunt accesibile anticorpilor din proba de testat; o serie de proteine virale sunt
transferate dintr-un gel de electroforeza pe o membrana suport (benzi de hartie
de nitroceluloza) si ulterior reactioneaza cu anticorpii din proba; aceasta tehnica
combina 2 lucruri: selectivitatea electroforezei cu gel cu specificitatea testelor
imunologice si ca urmare va permite depistarea si analizarea proteinelor aflate
in acest amestec; rezultatele sunt tot calitative; ceea ce se pune in contact in
aceasta tehnica sunt: serul de cercetat/al bolnavului cu antigene HIV purificate
separate prin electroforeza apoi transferate pe hartie de nitroceluloza si apoi
incubare; anticorpii care se fixeaza de aceaste polipeptide virale se evidentiaza
printr-o noua incubare cu anticorpi umani conjugati cu o enzima marker si un
substrat enzimatic; principala indicatie a acestui test este confirmarea testelor
reactive in ELISA; avem nevoie: ser sangvin, teste cu benzi de nitroceluloza
care contin antigene virale fixate si un sistem de spalare a benzilor; ca si
interpretare testul pozitiv presupune aparitia unor linii cenusii-negre in dreptul
antigenelor fata de care exista anticorpi in proba testata

52