Carte 2023

LUCRAREA PRACTICĂ 1
1.1. Organizarea și funcționarea laboratorului de microbiologie.

Laboratorul de microbiologie esteorganizat pentru a primi și prelucra
produsele patologice recoltate de la pacienti, cu scopul de a izola și identifica
microorganismele patogene.
Organizarea și dotarea laboratorului trebuie să satisfacă următoarele cerințe:
- Să usureze investigațiilenecesare recunoașteriimicroorganismului

considerat agent etiologic, cu obținerea de culturipure și identificarea
patogenului prin examen microscopic;
- Împiedicarea suprainfecției probelor recoltate și mediilor însămânțate;
- Asigurarea după diagnostic a sterilizării materialelor;
- Protecția personalului față de infecțiile produse și manipulate în
laborator;
- Pregătirea materialului necesar recoltării probelor pentru efectuarea
examenului bacteriologic, pregătirea mediilor de cultură pentru
însămânțarea produselor.
Laboratorul trebuie sădispună de o serie de încăperi luminate natural,
ferite de curenții de aer, situate în locuri fără praf. Aceste spații au
următoarele destinațiipentru: pregătirea materialului, primirea produselor
patologice, însămânțarea pe mediii de cultură, incubarea mediilor eventual
efectuarea reacțiilor serologice, un spațiu pentru examenul microscopic,
sterilizarea ustensilelor și o boxă. Este impotantă evitarea contactului
materialelor sterile cu cele infectate.
Mobilierul aflate in laborator:
- mese de lucru din metal coperite cu plăci de faianță. Pe mesele cu faianță

albă este necesară o placă neagră.
- dulapuri din metal;

- frigidere și congelatoare pentru: conservarea mediilor de cultură, păstrarea
tulpinilor isolate și cele de referință;
- scaune rotative;
-becuri Bunsen, sursă de apăși de gaze;
Aparatura și instrumente:
-ansa bacteriologică pentru însământare, repicarea culturilor, prepararea

frotiurilor;
-găleți de metal cu capac pentru colectarea materialului infecțios;
- autoclav, etuvă termoreglabilă –pupinel, centrifugă, termostat reglabil,

baie-marie;
- truse de reactivi necesar colorațiilor Gram, Ziehl-Neelsen, May-Grümwald-

Giemsa;
- microscoape, balanțe, pompe de vid, stelaje, coșulețe metalice, trepiede cu

plasă de azbest;
-aparat de preparat apa distilată;
Sticlăria de laborator: eprubete, tuburi, plăcii Petri de diametre

diferite, țeavă de sticlă pentru pipete Pasteur, cilindrii gradați, pahare
conice, borcane, cristalizoare, perle de sticlă, lame și lamele, sticle de ceas
pentru cântărire la balanța analitică, markere, leucoplast, foarfeci,
instrumente metalice (pense, bisturie, clești, etc).
1.2. Normele de protecție a muncii în laboratorul de microbiologie.
- echipament de protecție (halat din material textil);

- sunt interzise fumatul și mâncatul în laborator;
- nu se pun obiecte personale pe masa de lucru;
- obiectele contaminate sunt manipulate cu grijă;
- se sterilizează ansa înainte și după fiecare manevră de lucru;
- după utilizarea lamelorși a pipetelor sunt introduse în amestec
sulfocromic;
- resturile sunt aruncate la galeata de infecte;
- dacă s-a produs contaminarea suprafețelor se toarnă sublimat 10/00,
fenol 5%, clorofom 30/00, timp de 20 minute. După care se curăță
corespunzător cu apăși apoi cu alcool.
1.3. Metode de sterilizare.

Sterilizarea reprezintă ansamblul de metode prin care se distrug toate
microorganismele patogene şi nepatogene fie în forma vegetativă, mai puțin
rezistente, cât și în formărezistentă sporulată de pe un obiect, suprafaţă sau
mediu,aceasta fiind o sterilizare completă sau totală.
În sterilizarea incompletă sau decontaminarea sunt omorâte numai

formele vegetative nu si cele sporulate.Un material este steril când este lipsit
total de microorganisme vii.
Rolul sterilizarii este de protecție atât a probelor câtși a personalului de

laborator.
Moartea celulelor bacteriene reprezintă pierderea ireversibilă a

capacității de a genera o culturăși se datorează denaturării sau dezintegrării
structurilor microbiene sub acțiunea agenților sterilizanți.
Clasificarea metodelor de sterilizare:A. Sterilizarea prin Agenți Fizici:

I. Căldură a. Uscată: 1.
Încălzirea la roșu
2. Flambarea
3. Incinerarea
4. Sterilizarea prin aer cald
b. Umedă: 1. Fierberea
2. Pasteurizarea
3. Tindalizarea
4. Autoclavarea
II. Filtrarea
III. Prin radiații 1. ionizante- radiații α,β,γ
2. neionizante – radiații UV
IV.Prin ultrasunete
B. Sterilizarea prin Agenți

Chimici:
I. steilizare gazoasă
II. sterilizare prin soluții -
dezinfectante
-antiseptice
Etapele sterilizării:
• Pregătirea materialului pentru sterilizat;
• Sterilizarea propriu-zisă;
• Controlul sterilizării;
După sterilizare obiectele sunt sigilate, iar pe sigiliuse notează data
sterilizăriiși numărul lotului de sterilizare.
• Pregatirea materialului pentru sterilizat :

1. Decontaminarea; sticlaria de laborator (plăci Petrii, baloane, filtre,
etc.) se adunăîngăleți de infecte prevăzute cu capac și se
sterilizează prin autoclavare 1 ora la 1340C. Pipetele de orice tip,
lamele, lamelele, baghetele de sticlă se mențin timp de 24 de ore
în amestec sulfocromic.
2. Curațarea mecanică: periaj în soluție 1-2% detergent cationic în
apă caldă. Urmat de spălare în jet puternic de apă, clatire perfectă,
apoi e efectuează ”tragere” prin soluție de alcool 900.
3. Uscare în stative speciale la temperatura camerei.
4. Ambalarea se face de așa manierăîncât, după sterilizare să nu mai
poată venii în contact cu mediul interior în timpul depozitării
(Fig.1.1).
• Sterilizarea propriu-zisa
A. Prin Agenți Fizici
I.a. Căldură Uscată.Prin acest mecanism microorganismelesunt oxidate

sau carbonizate.
1. Încălzirea la roșu (aducerea la incandescență)- este folosită pentru
Ansa Bacteriologică, manevra se efectueazăînainte și după fiecare
întrebuințare, este contraindicatăpentru sterilizarea
instrumentarului metalic din laborator deoarece în timp acesta se

degradează(Fig. 1.2).
Fig. 1.1. Fig. 1.2. Fig. 1.3.
Fig. 1.4. Materiale ambalate
Încalzire la roșu Flambarea Pupinel (foto C. Defta)
2. Flambarea –constăîn trecerea materialului prin flacară de câteva

ori, timp de câteva secunde, nu este o metodă de sterilizare ci mai
degraba de protecție împotriva contaminării cu germeni din
aer(sterilizare de suprafață). Se flambează capilarul pipetei Pasteur,
pipete gradate, gâtul eprubetelorsau baloanelor de sticlă(Fig. 1.3.).
3. Sterilizarea cu aer cald la Pupinel (etuva termoreglabilă) (Fig. 1.4.),
metoda este folosită pentru obiectele din sticlă, obiectele din
porțelan, instrumente metalice neascuțite, unele uleiuri, pulberi
(talc). Contraindicată soluțiilor apoase, obiectelor de cauciuc,
țesăturilor etc.Condițiile pentru sterilizare sunt de 170-1800C, timp
de o oră de când s-a atins această temperatură. Pupinelul este o
cutie paralepipedică cu pereții dublii prevăzută cu un sistem de
ventilație care permite circulația aerului cald în interiorși un sistem
digital pentru setarea condițiilor și timpului de sterilizare.
4. Incinerarea folosită pentru eliminarea reziduurilor contaminate
(comprese septice, pansamente, tampoane, medii de cultură,
instrumente de unică folosințăși eventual animale moarte de
laborator etc).
I.b. CaldurăUmedă. Este cea mai eficientă metodă de sterlizare.

Mecanismul prin care sunt omorâte microor-ganismele este de coagulare
și degradare a proteinelor şi enzimelor.
1. Fierberea constăîn încălzirea la 1000C timp de 30 de minute din

momentul în care apa a dat în clocot,în recipientele
corespunzătoare. Temperatura poate fi crescută până la 105-1060C
prin adăugarea în apă a carbonatului de sodiu. Prin fierbere se
distrug formele vegetative bacteriene, fungi și unele virusuri, dar nu
sporii. Metoda este indicată pentru: seringi, instrumente de mică
chirurgie în urgente (când nu există posibilitatea autoclavării),
lenjerie, sonde etc.
2. Pasteurizarea – este o metodă de sterilizare parțială blândă prin
care se distrug doar formele vegetative. Se folosește pasteurizarea
joasă (la 55 – 650C timp de 30 min), pasteurizarea medie (la 65 –
750C timp de 15 min) şi pasteurizare înaltă (85 – 900C timp de 5
min) urmate de scăderea bruscă la 40C, aceasta completează
efectul antimicrobian prin soc termic. Folosităîn industria
alimentară, la conservarea de scurtă durată fară a distruge
proteinele, enzimele, vitaminele, unele medii.
3. Tindalizarea – este o pasteurizare repetată cu termostatări între
pasteurizări, este o metodă blândă. Se efectueazăfie într-un tip
special de autoclav cu vapori fluenți, sau în baie de apă. Metoda
constăîn încălzirea la 60-75 0C timp de o oră, pe parcursul a 3 zile
succesive a materialului ce trebuie sterilizat. Prin tindalizare de
distrug formele vegetative și indirect sporii prin transformarea lor în
forme vegetative pe parcursul termostatării și distrugerea ulterioară
la următoarea încălzire. Indicatăîn sterilizarea mediilor ce conțin
substanțe organice ce ar putea fi degradate la temperaturi mai mari
ex. medii de cultura, produse biologice.
4. Autoclavarea – cea mai eficientă şi mai folosită metodă de
sterilizarece constăîn sterilizarea cu vapori de apă sub presiune care
sunt extrem de penetranți distrugând atât formele vegetative cât și
cele sporulate. Se realizează în autoclavce se prezintăca un un
aparat format dintr-un cazan cilindric cu pereţi metalici rezistenţi,
prevăzut cu un capac metalic masiv ce se va închide etanş.
Autoclavul este de asemenea prevăzut cu un manometru ce indică
presiunea interioară şi indirect prin echivalenţă temperatura: la
1atm corespund 1200C; un robinet pentru eliminarea aerului din
interior şi o supapă de siguranţă. Temperatura și presiunea vor fi
după caz: la 1210Cși 1 atmosferă; la 1340C şi 2 atmosfere. Metoda
este utilizată pentru decontaminarea obiectelor de laborator,
instrumentarului metalic tăios, materiale din bumbac, obiecte din
cauciuc, uleiuri sau substanțe cu conținut mai mare de 20% apă,
filtre, medii de cultură, etc. Contraindicată substanțelor
higroscopice (conținut mai mic de 20% apă), substanțelor
termodegradabile (Fig. 1.5)
Fig. 1.5. Autoclav Fig. 1.6. Hota flux laminar cu UV
(foto C. Defta)
II. Filtrare. Metoda constăîn trecerea lichidului printr-o substanță poroasăîn

vederea îndepărtării microorganismelor de tipul virusurilor, bacteriilor,
protozoarelor, lăsând să treacă lichidul,în careacestea au fost suspendate
pentru cultivare sau în urma cultivării, prin aspirația cu ajutorul unei pompe
de vid. Indicatăîn obținerea de seruri, soluții injectabile, lichid de ascită
folosit la prepararea unor medii. Filtrele ce se foloseau în trecut erau
confecţionate din porţelan, azbest, sticlă poroasă. În prezent se folosesc
filtre din acetat de celuloză.
III. Radiații.Acest tip de sterilizare este indicat materialelor care prin natura
lor nu pot fi sterilizate prin alte metode
1. ionizante– radiații α,β,γ necesită instalații speciale împotriva radiațiilor, au

acțiune bactericidă puternică, folosite în sterilizările industriale,
instrumentele medicale, alimente, medicamente.
2. neionizante – radiații UV acestea sunt absorbite de acizii nucleici și

proteine determinând modificarea structurii chimice prin ruperea unor
legături chimice sau formarea unora noi. Are efect bactericid la lungimi de
undă de 280-250nm. Se folosesc lămpi de UV fixate la 40 cm de suprafața
ce urmează să fie sterilizată, în boxele de lucru, sălile de operație sau hotele
cu flux laminar (Fig. 1.6.)
3. sterilizarile cu fascicole de neutroni, necesită instalații speciale, folosite în

industrie.
IV. Ultrasunetele acestea sunt bactericide prin efectul lor de cavitație pe

care o produce unda sonoră la trecerea prin apa intra sau extracelulară
ducând la dezintegrarea structurilor microbiene. Se folosesc ultrasonări în
băi cu soluții de detergenți în cutii metalice cu tijă centrală prin centru.
Aceasta metodă este utilizată la sterilizarea și curațarea instrumentarului
stomatologic și chirurgical.
Bactericid –agenți sau substanțe care omoară bacteriile.
Bacteriostatic –agenți sau substanțe care pot oprii dezvoltarea bacteriilor.
B. Sterilizarea prin Agenți Chimici:
I. gazoasăcu *etilenoxidul distruge bacteriile în formă vegetativă și unii

sporiacţionând la nivelul acizilor nucleici. Este o metodă de sterilizare folosită
pentru materiale care nu rezistă la căldură (materiale plastice, din cauciuc,
echipamente electronice, etc).
*clorul gazos dezinfectează apa potabilă,
* vapori de azot, β-propiolactona, aldehida formică sub forma

de aerosoli, sterilizarea se face cu aparate speciale, la o anumita
temperatură, umiditate, într-o anumită perioadă de timp.
II. prin soluții
–dezinfectantesunt substanțele care în concentrațiile lor active sunt iritante

și toxice pentru țesuturile vii, bactericide omoarând formele vegetative de pe
suprafețe sau produse patologice în funcție de timpul de contact (15-20
minute). Exemplu: amestecul sulfocromic, biclorura de mercur,
permanganatul de potasiu în concentrații de 10/00, varul cloros, fenolul,
hidroxidul de sodiu, formolul, bromocetul 1%.
-antisepticesubstanțele chimice care în doze active nu sunt toxice pentru

organism, ele distrugformele vegetative ale microorganismelor de pe
tegumente mucoase sau plăgi. Exemplu: apa oxigenata, permanganatul de
potasiu în concentrații de 1/5000 și 1/10000, tinctura de iod, cloramina,
alcoolul de 900, 700, boraxul, săpunurile, bromocetul 10/00,mertiolatu de
sodiu, nitratul de argint.
Controlul sterilizării:Se face prin indicatori fizici, chimici şi biologici.
Indicatorii fizici: termometre, manometre,ce se vor aşeza în interiorul

aparatului.
Indicatorii chimici: se folosesc substanţe cu punct de topire cunoscut:

benzofenolul 1100C, sulful 1150C, antipirina 1130C, acidul bezoic 1200C
folosite pentru autoclav, iar tioureea 1800Cpentru pupinel. La aceste
substanţe se adaugă colorant (albastru de metilen sau fuxină) care atunci
când se ajunge la punctul topire vor colora substanţa în albastru sau roşu.
Indicatorii fizici și chimici ne ajută să verificăm dacă temperatura de

sterilizare s-a realizat în interiorul apartului de sterilizare. Dezavantajul
major este ca aceste teste nu ne indică şi timpul de acţiune.
Indicatorii biologici: se folosesc sporii ce rezistă la temperaturi ridicate (spori

de bacil antracis, bacil mezenteric sau bacil stearotemophilus) sterilizarea va
fi eficientă dacăînsămînţarea sporilor după sterilizare nu duce la apariția de
colonii. În laborator aceşti spori sunt îmbibaţi în fire de mătase ce sunt
închise în tuburi de sticlă. Astfel, la sfârșitul sterilizării firele se suspendă în
mediu lichid și se termostatează la 370C timp de 24 de ore. După incubare
dacă mediul ramâne limpede sterilizarea a fost efectuată corect dacă mediul
se tulbură sterilizarea nu a fost corectă și se repetă sterilizarea. În cazul
stearotestului acesta conține mediu de cultură spori de stearo termophilus și
indicator de culoare astfel că după sterilizare și incubare mediul rămâne
violet sterilizarea a fost executată corect dacă devine galben acest lucru
dovedește că sporii au germinat iar produșii de metabolism au modificat pH-
ul mediului ducând la virarea indicatorului de pH în galben. Testele biologice
se dovedesc a fieficiente deoarece arată atât timpul de acţiune cît şi
temperatura (Fig. 1.7.).
Fig. 1.7. Fiole de stearotest la sfârșitul sterilizării și

două fiole cu uree înaintea sterilizării(foto C. Defta)
2.1.Norme privind recoltarea și transportul produselor patologice în

vederea efectuării
diagnosticului de laborator în infecțiile bacteriene.
Produs patologic :materialul biologic în care suspectăm existenţa unor

germeni (agenți patogeni).
Exemple de produse patologice: sânge, urină, materii fecale,exsudat naso-

faringian, LCR, etc.
Examenul microbiologic va oferi un rezultat corect doar in condiţiile

respectării unor reguli de bază privind:
• recoltarea produsului patologic (p.p.)
• transportul p.p.
• conservarea p.p.
Reguli privind recoltarea produsului patologic:
• recoltarea se face înaintea instituirii tratamentului cu antibiotic sau

chimioterapice;
• obligatoriu se folosesc recipiente şi metode sterile pentru prevenirea

contaminării probelor şi a pacienţilor;
• recoltarea trebuie efectuată cât mai aproape de debutul bolii, sau în

momentul, în care probabilitatea de a găsi agentul etiologic este
maximă (ex. în frison - pentru hemocultură);
• produsul patologic trebuie recoltat într-o cantitate suficientă şi din

zone reprezentative;
• în unele cazuri trebuie folosite medii de transport;
• produsul să fie însoţit de un bilet de trimitere completat corect;
• probele să fie etichetate şi transportate la laborator în cel mai scurt

timp posibil;
Reguli privind transportul produsului patologic:
• produsele patologice se transportă în cel mai scurt timp – max. 1-2 h

de la recoltare;
• la temperatură adecvată în funcţie de produsul patologic;
• se previne contaminarea atât a probei, cât si a personalului care o

transportă şi a mediului extern;
• în situaţia întârzierii probelor se folosesc: medii de transport

(Stuart, Amies, Cary-Blair), recipiente izoterme 0-4ºC (nu
transportăm bacterii termosensibile care nu rezistă la aceste
temperaturi: Neisseria meningitides, Neisseria gonorrhoeae,
Haemophilus influenzae), pentru izolarea anaerobilor se foloseşte
transportul în seringă cu eliminarea aerului etc.
EXEMPLE DE PRODUSE PATOLOGICE (Metode de recoltare şi transport)
EXSUDATUL FARINGIAN:
Când recoltăm:
- dimineaţa, înainte de spălatul pe dinţi, înainte de masă sau la minimum 4

ore după toaleta gurii, alimentaţie.
Ce recoltăm:
- exsudat din zonele eritematoase, purulente, inflamate, ulcerate situate pe

amigdale şi orofaringe.
Cum recoltăm:
- pacientul așezat pe scaun, lângă o sursă de lumină, cu gâtul în uşoară

extensie, deschide gura, spune “A”;
- persoana care recoltează deprimă limba cu apăsătorul steril şi printr-o

mişcare fermă şterge cu tamponul zonele
modificate .
ATENŢIE: NU se atinge limba!!
Ce folosim pentru a recolta:
-2 / 3tampoane cu vată obişnuită uşor umectate în ser fiziologic (pentru

efectuarea frotiului, însămânţare,
numărul tampoanelor diferă în funcţie de boala pe care o suspectăm)(Fig.

2.1.)
Fig.2.1. Tampoane sterile în tub cu mediu
Transport:
- imediat sauîn maximum1-3 ore de la recoltare;
- daca nu se respectă condiţiile de mai sus se recomandă utilizarea mediului

de transport (ex. Amies).
EXSUDATUL NAZAL:
Când recoltăm:
- când există simptomatologie clinică.
Ce recoltăm:
- exsudat.
Cum recoltăm:
- pacientul stăaşezat, cu capul în extensie pe spate, orientat spre o sursă de

lumina;
- persoana care recoltează introduce tamponul printr-o nară, până la

peretele posterior al nazofaringelui, lasă
câteva secunde, retrage puţin, apoi reinseră, roteşte uşor, retrage definitiv
tamponul.
ATENŢIE: NU se atinge tegumentul din jurul nărilor!!
-2 / 3tampoane cu vată obişnuită uşor umectate în ser fiziologic (pentru

efectuarea frotiului, însămânţare,
numărul tampoanelor diferă în funcţie de boala pe care o suspectăm)(Fig.

2.2.)
Fig.2.2. Tampoane sterile
Transport:
- dacă nu se respectă condiţiile de mai sus se recomandă utilizarea mediului

de transport (ex. Amies).
SPUTA:
Când recoltăm:
- dimineaţa, după toaletarea cavităţii bucale (periajul dinţilor, clătirea

energică a gurii cu apă de gură sau soluţie
salină fiziologică)
Ce recoltăm:
- secreţie expectorată, mucopurulentă.
Cum recoltăm:
- pacientul tuşeşte spontan, intens, supravegheat de o persoană calificată;
- stimularea tusei și a expectoraţiei prin inhalarea de aerosoli cu soluţie

salină 3% - frotiul oferă informaţii
necorespunzătoare din punct de vedere citologic.
- secreţia expectorată în mod fiziologic de către pacient;
- aspirat bronhoscopic, transtraheal, transtoracic recoltat cu dispozitive

adecvate;
Se foloseşte sputa de la expectoraţia matinală sau expectorată în interval

de 1 – 2 ore, recoltatăîn dispozitive sterile.
Este suficientă o cantitate de 2-3 ml spută.
În suspiciunea de TBC se recomandă recoltarea a 3 produse patologice în 3

zile consecutive.
ATENŢIE : NU se examinează probele de spută adunate în 24 de ore!!
Transport:
- în recipiente sterile, la 4ºC există riscul de a pierde neisseriile și

haemophilii;
- dacă nu se respectă condiţiile de mai sus se recomandă utilizarea mediului

de transport. (ex. Amies, Stuart)
LCR
Când recoltăm:
- în orice moment se suspectează un sindrom meningeal.
Ce recoltăm:
-LCR.
Cum recoltăm:
- în condiţii de asepsie, la patul bolnavului prin puncţie lombară;
- la nou născuţi se recoltează din fontanela anterioară.
- seringă cu ac special;
- se recoltează o cantitate de 5- 10 ml, în 2-3 tuburi pentru investigaţii

microbiologice, biochimice, etc.
Transport:
- se recomandă recoltarea la patul bolnavului
- dacă nu, se transportă în cel mai scurt timp la o temperatură apropiată de

cea umană.
ATENŢIE: NU se refrigerează!!! Neisseriile și Haemophilus termolabili – mor

prin refrigerare.
URINA:
Când recoltăm:
- când se suspectează o infecţie de tract urinar se recomandă recoltarea

primei urini de dimineaţă sau o recoltare
după cel puţin 3 ore de la prima micţiune.
-în cazul infecției cu BK cu localizare renală se recoltează urină timp de 24

de ore într-un recipient steril cu
păstarea lui în frigider între micțiuni.
Ce recoltăm:
- urina.
Cum recoltăm:
- micţiune fiziologică: după toaletarea riguroasă a organelor genitale

externe, din jetul mijlociu (bacteriile
saprofite din uretra terminală sunt antrenate o dată cu jetul primar,

evitându-se astfel contaminarea);
- puncţie şi aspiraţie suprapubiană;
- cateterizare uretrală;
- pentru nou-născuţi se folosesc pungi sterile din material plastic.
Ce folosim pentru a recoltare:
- recipiente sterile numite urocultoare (Fig. 2.3.);
- este suficientă cantitatea de 20-50 ml urina.
Fig.2.3. Urocultor
Transport:
- imediat sauîn maximum 30 minute;
- dacă nu se respectă condiţiile de mai sus se recomandă menţinerea şi

transportul la 4ºC.
- în 2 ore după recoltare, la temperatura camerei, numărul bacteriilor poate

atinge o valoare sugestivă pentru o
infecţie de tract urinar (peste 100.000 ufc/ml)(ufc-unități formatoare de

colonii)
SÂNGE:
Când recoltăm:
- înaintea instituirii unui tratament cu antibiotice;
- în momente diferite pe parcursul a 24 de ore, minimum 2 probe (pentru

flora aerobă și flora anaerobă), dar cel
mai frecvent se recoltează 3 probe.
- în funcţie de patologia clinică a pacientului se recomandă recoltarea

probelor de sânge în diferite momente (ex.:
sepsis - se recoltează 3 hemoculturi diferite în momentul, în care pacientul

semnalează apariţia frisonului,
endocardită acuta – 3 hemoculturi într-un interval de 1-2 ore, etc.).
- pentru un diagnostic serologic se recoltează sânge la recomandarea

medicului clinician.
- Ce recoltăm:
- sânge.
Cum recoltăm:
- se recoltează în vacutainere fără anticoagulant sau cu seringă şi ac prin

puncţie venoasă la plica cotului fie
pentru diagnosticul serologic, fie pentru efectuarea hemoculturii;
- se antiseptizează tegumentul cu iod, apoi cu alcool sanitar;
- se decontaminează dopul flacoanelor de hemocultură înainte de a fi

transferat sângele din seringă în acestea, iar
în cazul diagnosticului serologic serul este separate în laborator.
- seringă, ac și flacoane speciale pentru hemocultură (Fig. 2.4.).
- vacutainere fără anticoagulant pentru diagnostic serologic (Fig. 2.5.).
- se recomandă recoltarea a 10 ml sânge pentru adulţi și 1-3 ml sânge

pentru copiii mici, dar aceste valori pot
fluctua uşor în funcţie de flacoanele de hemocultură folosite.
Fig.2.4. Flacon hemocultură

Fig. 2.5. Vacutainer
Transport:
- probele de sânge nu se refrigerează şi trebuie transportate cât mai repede

în laborator.
MATERII FECALE:
Când recoltăm:
- înaintea instituirii unui tratament cu antibiotic şi cât mai aproape de

debutul unui sindrom diareic;
- în orice moment în care se suspicionează o infecţie parazitară.
Ce recoltăm:
- materii fecale.
Cum recoltăm:
- din scaunul emis spontan – este metoda cea mai indicată atât pentru
examenul de coprocultură, cât şi pentru
examenul coproparazitologic.
- prelevare rectală recomandată în shigellozele cronice şi investigarea

purtătorilor de Salmonella și Shigella
• cu ajutorul tamponului rectal (tamponul steril umectat în ser fiziologic

se introduce la nivel rectal aproximativ 15 cm și prin mişcări de rotire
se prelevează secreţiile de la nivelul mucoasei rectale);
• cu ajutorul sondei Nelaton (se procedează identic doar că se adaptează

o seringă cu ajutorul căreia se fac 1-2 aspiraţii);
• în ambele situaţii se recomandă introducerea produsului patologic în

mediul de transport.
- recipiente sterile numite coprocultoare (Fig. 2.6.);
- coprocultoare cu mediul de transport (în situaţia unui sindrom diareic) şi

fără mediu de transport (pentru
examenul coproparazitologic);
- se recoltează zonele modificate macroscopic (sânge, puroi, mucus).
Fig. 2.6. Coprocultor(foto A. Topolniski)
Transport:
- coprocultoare fără mediu de transport – proba trebuie lucrată în maximum

2 ore.
- coprocultoare cu mediu de transport (Cary Blair) – probele pot fi păstrate

24 de ore la temperatura camerei.
- excepţie de la aceste reguli fac Shigella ce trebuie însămânţată imediat pe
mediu de cultură şi V. cholerae ce se
transportă într-un mediu ce are şi rolul de îmbogăţire: apa peptonată
SECREŢII GENITALE – LA FEMEI:
Când recoltăm:
- preferabil după primele 10 zile ale ciclului menstrual – pentru

diagnosticul infecţiilor bacteriene;
- la mijlocul ciclului menstrual, în afara perioadei menstruale, după

tratarea unor posibile infecţii – pentru
efectuarea unui frotiu cervico-vaginal ( citologie cervico-vaginală

Babeş - Papanicolau);
- pentru ambele situaţii se recomandă ca înainte cu 24-48 de ore să se

evite contactul sexual, lavajul vaginal,
diverse tratamente sau manopere intravaginale.
Ce recoltăm:
- secreţie vaginală;
- celule ale zonei endocervicale, exocervicale şi de tranziţie dintre

acestea.
Cum recoltăm:
- recoltarea este efectuată de către medicul ginecolog, pe masa de

ginecologie.
• în vaginite: se recoltează secreţie vaginală din fundul de sac, cu

tampon steril;
• în cervicite:se recoltează de la nivelul canalului cervical prin

introducerea şi rotirea unui tampon steril;
• la fetiţe: fie se tamponează secreţia din zona vaginală, fie se

colectează lichidul de spălătură introdus
în vagin cu ajutorul unui cateter (se introduc 10 ml de ser
fiziologic);
• pentru frotiul cervico-vaginal: se recoltează cu ajutorul unei

periuţe astfel încât prin rotire să se
recolteze celule atât din zona exocervicală, cât şi din zona

endocervicală.
- 3 tampoane sterile – două tampoane le folosim pentru frotiuri Gram şi

Giemsa și al treilea îl folosim pentru
însămânţare pe medii de cultură
- periuţe cervicale (citobrush)(Fig. 2.7.)
Fig. 2.7. Citobrush(foto A. Topolniski)
Transport:
- imediat în suspiciunea de gonoree (gonococul nu rezistă la transport şi

refrigerare), eventual după
recoltare se recomandă însămânţarea pe medii de cultură încălzite la

37ºC.
- se pot folosii medii de transport conservându-se astfel secreţia

vaginală pentru o perioadă de maximum 24
de ore.
SECREŢII GENITALE – LA BĂRBAŢI:
Când recoltăm:
- dimineaţa, înainte de prima micţiune sau la 2 ore după aceasta.
Ce recoltăm:
- secreţie uretrală.
Cum recoltăm:
- secreţia spontană matinală: se recoltează prin ştergerea secreţiei cu

ajutorul tamponului de vată;
- secreţie exprimată prin compresia uretrei;
- secreţie intrauretrală cu ajutorul ansei microbiologice sau a tamponului

steril: se inseră în interiorul uretrei
2 cm, apoi se roteşte.
- tampoane sterile de vată, anse sterile de unică folosinţă sau platină şi

tampoane speciale, mici pentru
recoltarea intrauretrală (Fig. 2.8.)
Fig. 2.8. Anse sterile de unică folosinţă(foto A.

Topolniski)
Transport:
- imediat în suspiciunea de gonoree (gonococul nu rezistă la transport și

refrigerare), se pot folosii medii de
transport conservându-se astfel secreţia uretrală pentru o perioadă de

maximum 24 de ore.
PUROI
Când recoltăm:
- în orice moment există supuraţii, colecţii purulente.
Ce recoltăm:
- puroi din plăgi suprainfectate, flegmoane, abcese.
Cum recoltăm:
- în funcţie de localizare şi de leziune;
-puroiul poate fi recoltat prin ştergere cu tampoane de vată, atunci când nu

există altă soluţie sau cu ansa
bacteriologică;
- când este vorba de colecţii purulente se recomandă recoltarea prin

biopsiere, chiuretare sau puncţie şi
aspiraţie.
- tampoane de vată sterile, anse bacteriologice, seringi cu ac, bisturie.
Transport:
- imediat sau în maximum 2 ore;
- când se suspectează o infecţie cu germeni anaerobi, seringa folosită la

recoltare se închide cu dop pentru
asigurarea condiţiilor de anaerobioză.
2.2.Tehnica efectuării frotiului din produs patologic.
Deşi examenul microscopic nu are de fiecare dată valoare decisivă în

diagnosticul de laborator, totuşi de cele mai multe ori reuşeşte să orienteze
medicul de laborator în ceea ce priveşte urmarea unei anumite scheme de
diagnostic.
În diagnosticul de laborator se foloseşte examenul microscopic în

etapa a doua când se examinează produsul patologic şi în etapa a patra când
se examinează coloniile crescute pe mediile de cultură.
Prelevarea şi întinderea pe lamă a produsului patologic sau a unui

fragment din cultura bacteriană în vederea unei examinări microscopice
poartă denumirea de frotiu.
În practica curentă se utilizează două tipuri de frotiuri :

1. Frotiul umed (lamă - lamelă);
2. Frotiul uscat (colorat).
FROTIUL UMED/nativ sau lamă-lamelă
Tehnică: Pe o lamă se pune o picătura de ser fiziologic apoi se descarcă un

fragment din produsul patologic se
ataşează lamela prin poziționarea laterala la locu de incidență lama

produs, sub un unghi dupa care se
lasa ușor în jos, evitându-seformarea de bule.
În diagnosticul microbiologic frotiul umed oferă informaţii în ceea ce

priveşte :
• mobilitatea germenilor;
• morfologia bacteriană.
Frecvent acest preparat este folosit în diagnosticul parazitologic.
Ţinând cont de faptul ca aceste frotiuri conţin germeni vii, necoloraţi

examinarea se face cu:
• microscopul cu fond întunecat - bacteriile se văd luminoase pe un fond

întunecat;
• microscopul optic, cu obiective uscate, condensator coborât;
• microscop cu contrast de fază.
FROTIUL USCAT
Etapele realizării unui frotiu uscat din produs patologic lichid sau din cultura
microbiană lichidă (Fig. 2.9.):
1. etalarea –produsul patologiclichid acesta se prelevează cu ansa

bacterilogică sterilăși se întinde pe lamă
prin mişcări circulare fărăa atinge marginile acesteia;
2. uscarea la temperatura camerei, în urma uscării frotiul apare ca o

pată albă neaderentă la lamă, în acest
stadiu frotiul este contaminant;
3. fixarea (la flacără sau chimică) – prin fixare bacteriile aderă strâns la
lamăși astfel sunt distruse,cel mai frecvent se foloseşte fixarea la
flacără. Lama este trecută de trei ori prin flacără (călcând flacăra cu
frotiul în sus) și de fiecare dată se testează temperatura prin atingerea
dosului palmei la tabacheră. Dacă tolerăm termic (560C) atunci frotiul
a fost fixat corespunzător. Nu trebuie depașită acestă temperatură
deoarece se produce denaturarea frotiului.
Fixarea are rolul de a:
- creşte aderenţa produsului patologic de lamă;
- creşte afinitatea elementelor de pe frotiu pentru colorant.
4. colorarea - se foloseşte una dintre cele mai frecvente trei coloraţii :

Albastru de metilen, Gram, Ziehl Neelsen
Fig. 2.9. Etapele efectuării unui frotiu(desen A. Topolniski)

Etapele realizării unui frotiu uscat din produs patologic solid sau din cultură
microbiană solidă:
1. etalareadacă produsul patologic este semisolid sau solid se pune

mai întâi o picătură de
ser fizilogic, se omogenizează produsul patologic cu serul fiziologic apoi

se întinde în strat cât mai
subţire pe lamăprin mişcări circulare fără a atinge marginile.
2. uscarea la temperatura camerei;
3. fixarea (la flacără sau chimică) – cel mai frecvent se foloseşte

fixarea la flacără;
4. colorarea se foloseşte una dintre cele mai frecvente trei coloraţii :

Albastru de metilen, Gram, Ziehl Neelsen
Frotiul uscat, colorat ne oferă informaţii în ceea ce priveşte:
• morfologia germenilor
• dispoziţia germenilor
• tinctorialitatea (colorabilitatea)
Examinarea se face cu :
• microscopul optic cu imersie – cea mai uzitată metodă
• microscopul optic cu obiectiv uscat
2.3. Tehnici de colorare a frotiurilor: tehnica albastrului de

metilen, tehnica Gram și tehnica Ziehl-
Neelsen
Pentru colorarea frotiurilor se pot folosi diferite coloraţii, dar aşa cum
am precizat şi mai sus cele mai frecvente sunt: albastru de metilen, Gram şi
Ziehl Neelsen.
Coloraţia cu albastru de metilen:

Este cea mai simplă coloraţie, foloseşte un singur colorant şi asigură o
bună diferenţiere a detaliilor structurale atât ale celulelor eucariote, cât şi ale
celulelor procariote.
Tehnică:
- se acoperă frotiul cu soluţie albastru de metilen, se lasă 1-2 min;
- se spală cu apă de la robinet;
- se lasă la uscat în stativ;
- se examinează la microscopul optic cu imersie (obiectiv de imersie

100x iar între lama și obiectiv de pune ulei de cedru).
Examen microscopic:
- bacteriile se colorează în albastru
- celulele eucariote se colorează în albastru
- capsula şi sporul bacterian NU se colorează (capsula se observă ca un

halou în jurul bacteriilor şi sporul ca o lipsă de substanţă de formă
sferică în interiorul bacteriilor)
Coloraţia Gram:
Este o coloraţie dublă, complexă, foloseşte doi coloranţi şi un

decolorant.
Principiu: Coloraţia Gram diferenţiază bacteriile în funcţie de structura

peretelui celular, astfel încât bacteriile cu perete gros fixează primul colorant
pe care nu-l cedează în totalitate la decolorare, iar bacteriile cu perete
subţire fixează primul colorant pe care-l cedează la decolorare urmând a se
recolora cu ultimul colorant.
Tehnică:
- se acoperă frotiul cu soluţie violet de genţiană, se lasă 1-2 minute

după care se varsă;
- se acoperă frotiul cu lugol (mordant, fixator de culoare), se lasă 1-2

minute, după care se varsă;
- se decoloreaza frotiul cu alcool acetonă, se lasă maxim 10 secunde;
- se acoperă frotiul cu fucsină diluata 1/10 (9 părţi apă

distilată/1parte fucsină preparata extemporaneu),
se lasă 1-2 minute;
- se lasă la uscat în stativ;
- se examinează la microscopul optic cu imersie.
Examen microscopic:
- bacteriile se colorează în violet (gram pozitive „G +” cu perete

gros) şi roşu (gram negative „G -”cu perete subţire)
- celulele eucariote se vor colora în culoarea ultimului colorant

folosit (roşu)
- levurile se colorează în violet
- capsula şi sporul bacterian NU se colorează (capsula se observă

ca un halou în jurul bacteriilor şi sporul ca o lipsă de substanţă
sferică în interiorul bacteriilor)
Dacă frotiul uscat este realizat din produs patologic, la microscopul

optic vom vizualiza bacterii gram pozitive / gram negative, celule eucariote
colorate în roşu, cu sau fără capsulă (halou necolorat) şi spor (lipsă de
substanţă) - etapa a doua a diagnosticului de laborator.
Dacă frotiul uscat este realizat din cultură, la microscopul optic vom
vizualiza doar bacterii cu aceeaşi morfologie, cu o anumită aşezare, colorate
în gram pozitive / gram negative, cu sau fără capsulă şi spor – etapa a patra
a diagnosticului de laborator.
Tabelul 2.1. Exemple de bacterii gram pozitive şi gram negative
Bacterii Gram pozitivi Gram negativi

coci stafilococi, streptococi, meningococi, gonococi
pneumococi
bacili b. cărbunos, b. tetanic, b. enterobacterii
botulinic, bacilii gangrenei
gazoase
Coloraţia Ziehl - Neelsen:
Este o coloraţie complexă folosită în identificarea bacililor acid-alcoolo-

rezistenţi (BAAR).
Principiu: Bacteriile cu perete bogat în lipidoceruri fixează primul colorant

(fuxina) la cald şi rezistă la decolorarea cu acid-alcool.
Tehnică:
-se acoperă frotiul cu fucsină bazică;

-trecem cu o sursă de căldură (un tampon imbibat cu alcool căruia i se
dă foc) pe sub lama acoperită cu fucsină până apar emisii de vapori.
Repetăm operaţia de încălzire a lamei de trei ori şi dacă este nevoie
reacoperim cu fucsină. Timpul total de lucru este de max 10 minute,
lama se lasă să se răcească;
-se spală cu apă de la robinet;
-se decoloreaza frotiul cu acid-alcool, se lasă 2-3 minute;
-se recolorează frotiul cu albastru de metilen, se lasă 1 minut;
-se lasă la uscat în stativ;
-se examinează la microscopul optic cu imersie;
Examen microscopic:
- bacilii acid-alcool rezistenţi (BAAR) se colorează în roşu
- celelalte bacterii (altele decât BAAR) se colorează în albastru
- celulele eucariote se vor colora în culoarea ultimului colorant

utilizat (albastru).
Dacă frotiul uscat este realizat din produs patologic, la microscopul
optic vom vizualiza BAAR, alte bacterii ne-AAR şi celule eucariote - etapa a
doua a diagnosticului de laborator.
Dacă frotiul uscat este realizat din cultură, la microscopul optic vom
vizualiza doar BAAR coloraţi în roşu.
Tabelul 2.2. Sintetizează modul în care se colorează bacteriile şi celulele în

cele trei coloraţii descrise mai sus:
Albastru de Gram Ziehl Neelsen

metilen
Bacterii G pozitiv BAAR: ROŞU
ALBASTRU :VIOLET Alte bacterii:
G negativ: ALBASTRU
ROŞU
Celule ALBASTRU ROŞU ALBASTRU
eucariote
LUCRAREA PRACTICĂ3
3.1. Tehnici utilizate pentru studiul morfologiei microorganismelor.
Bacteriile sunt organisme procarioteunicelulare, care au un “nucleu

primitive”, fără membranăproprie, constituit dintr-un ADN dublu catenar
covalent circular închis, fiind lipsit de aparat mitotic. Faţăde celula eucariotă
nu prezintă, mitocondrii, reticul endoplasmicşi aparat Golgii.
Majoritatea bacteriilor au dimensiuni cuprinse între 1-10μ şi de aceea,
pentru examinarea microorganismelor sunt necesare aparate de mărit.
În studiul obişnuit al bacteriilor se utilizează microscopul optic darşi

microscopul cu fond întunecat, microscopul cu contrast de fazăşi microscopul
cu fluorescenţă.
Fig. 3.1. Microscop optic (din dotarea Disciplinei
de
Microbiologie, foto C. Defta)
Microscopul optic,în principiu este un instrument format din două

sisteme de lentile, care, folosind lumina, permite observarea şi studierea
microorganismelor invizibile cu ochiul liber. Aparatul este format dintr-o
parte mecanicăşi o parte optică.
Partea mecanică cuprinde piciorul pe care se sprijină microscopul,

coloana, revolverul în care se înşurubează obiectivele (10X,20X,40x, 90X,
100X), platina sau masa port obiect pe care se plasează lama cu produsul de
examinat ce se fixează pe aceasta cu ajutorul a doi călăreţi. Prin orificiul
central al platinei trece fanta de lumină. Platina se poate mişca pe două
direcţii perpendicular(stânga-dreapta şi sus-jos). Microscopulprezintăşi tubul
pe care se fixează ocularul la partea superioarăşi obiectivul la partea
inferioară. Este prevăzut cu macrovizăpentru reglaje grosiere necesare
prinderii imaginii având o viteză de deplasare mărităşi microvizăpentru
reglaje fine cu scopul de a obţine imaginea clară având o viteză de deplasare
lentă.
Partea opticăeste reprezentata de sistemul de iluminare şi două

sisteme de lentile numite obiectivşi respectivocular. Ocularul fiind plasat la
capătul superior al tubului prin care priveşte ochiul observatorului. Sistemul
de iluminat este reprezentat de oglindăşi condensator. Oglinda are rolul de a
dirija razele de la sursa de lumină spre axul optic. Condensatorul este format
din 2-3 lentile cu ajurorul cărora lumina reflectată de oglindă este
concentrată asupra obiectului. Înainte de a intra în condensator razele de
lumină trec printr-un suport de filtre şi o diafragmă de apertură.
Condensatorul are rol esenţial în luminozitatea imaginii (Fig. 3.1.).
Microscopul cu fond întunecat,se foloseşte pentru examinarea

preparatelor nativeîn studiul morfologiei şi mobilităţii germenilor
(Treponeme, Leptospirel, etc.). Este asemănător microscopului optic dar are
un condensator cordioidcare împiedică razele luminoase să pătrundă direct în
obiectiv. Lumina ajunge numai la margine în condensator, fiind reflectatăîn
sus de suprafaţa concavă.Obiectul este iluminat oblic generând astfel efectul
Tyndall.Astfel particulele în suspensie apar luminoase pe un fond întunecat al
câmpului. Obiectul este imersat cu o peliculă de glicerină pentru a evita
reflexia totală a razelor.
Microscopul cu contrast de fază, permite examinarea preparatelor

native necolorate pentru urmărirea în timp a proceselor celulare,spre
exemplu diviziunea celular, prin transformarea diferenţelor de fază a luminii
în diferenţe de intensitate care traverseazăpreparatul în funcţie de
densitatea particulelor intensitatea luminii variază. Microscopul prezintă un
condensator cu diafragme inelare, obiective de fază notate “Ph”, ocular de
centrare, lampă specială, filtru, etc.
Microscopul cu fluorescenţă, folosit în cazul preparatelor fluorescente

(marcate cu fluoresceină – intravital sau după fixare)în depistarea şi
identificarea rapidă a unor microorganismeîn produsele patologice (reacţii
serologice cu anticorpi marcaţi). Sursa de luminăa acestui tip de microscop
este o lampă care emite radiaţii UV. Razele UV excită particulele fluorescente
fixate pe microorganismul de cercetat. În final, pe fond întunecat apar
vizibile aceste particule fluorescente. În funcţie de intensitatea fluorescenţei
se noteaza cu -, +/-, ++, +++, ++++ fiind o reacţie calitativă. Microscopul
mai dispune şi de un set de filtre:filtrul caloric absoarbe radiaţiile emise de
lampă, filtrul de excitaţie permite trecerea spre preparat a radiaţiilor cu
lungimea de undă mică (ex. UV) iar filtrele de baraj asigură protecţia
ochiului celui care examinează. Condensatorul măreşte contrastul imaginii.
3.2. Examinarea la microscop a frotiurilor efectuate din produse

patologice și culturi microbiene.
(Carmen Defta)
Examinarea unui preparat lamă/lamelă.
Tehnica: Pe o lamă se pune o picătură din produsul ce urmează să fie

examinat, se ataşează lamela la locul de aderenţă a picăturii la lamă, se
lasăuşor în jos pentru a evita formarea bulelor de aer. Se aşeazăfrotiul pe
platina microscopului fixându-se cu ajutorul călăreţilor. Apoi se priveşteîn
obiectiv iar cu ajutorul macrovizei se coboarăobiectivul de 40X până
deasupra lamelei. Când s-a obţinut imagineaîn câmpul microscopului, cu
ajutorul microvizei se clarifică imaginea, în acest timp condensatorul este
plasat la 1,5 cm sub platină iar diafragma este semideschisă.
Astfel,se pot examina: sedimentul urinar, materiile fecale din diverse
afectiuni digestive, diareei, parazitoze, frotiurile din micozele cutanate,
preparatele din şancrul moale, cele din secreţia obţinutăîn urma tubajului
duodenal, etc.
Examinarea unui frotiu fixat şi colorat.
Tehnica: Frotiul fixat şi colorat este pus pe platina microscopului şi

fixat prin intermediul călăreţilor. Se centrează zona ce urmează să fie
examinată, se coboara obiectivulde 40X prin intermediul macrovizei, până
obţinem imaginea apoi căutăm câmpul relevant. După ce cămpul a fost ales,
se ridică obiectivul, se pune o picătură de ulei de cedru pe lamă, se schimbă
obiectivul de 40X cu cel de imersie 100X,după care se coboarătubul
microscopului până ce obiectivul se scufundăîn uleiul de cedruatingând lama.
Apoi privind în ocular, se ridică lent, rotind macroviza, pânăce seobţine
imaginea în câmp, urmată de clarificare prin manevrarea microvizei.
În funcţie de provenienţa frotiului vom distinge următoarele

formaţiuni: în cazul frotiurilor din produs patologic frotiul va avea bacterii,
celulepolimorfonucleare, celule eucariote, mucus sau fibre,în funcţie de zona
din care s-a făcut prelevarea. În cazul frotiurilor din cultură dacă aceasta
este pură nu poate prezenta decât un singur tip de bacteriedar care ar putea
prezenta forme diferite dacăîn caracteristica speciei intră polimorfismul.
Aspectele microscopice ale germenilor ţin de formă, dispoziţie,

afinitate, tinctorialitate şi dimensiuni, toate aceste caracteristici aparţin
speciei bacteriene.În funcţie de aceste aspecte bacteriile pot îmbrăca forme
diverse, se pot grupa în maniere diferite, aşezarea lor în spaţiu este legată
de existenţa unor planuri de clivaj apărute în timpul diviziunii.
Cocii sunt sferici au dimensiuni între 0,5-2μ, pot fi G(+) aşezaţi în

lanţuri - Streptococii cu cât mediul este mai nefavorabil cu atât lanţurile sunt
mai lungi, în ciorchine-Stafilococii, pachete cubice-Sarcina, in diplo lanceolaţi
sau lanţuri de diplo, capsulaţi- Pneuococii. Dar şi coci G(-) reniformi in diplo
sau grămezi de diplo iar pe frotiurile din produse patologice prezintăşi
capsula- Neisseria (gonococul şi meningococul).
Bacilii au o lungime de 0,3-2μ şi lăţime de 0,3-0,4μ pot fi scurţi subţiri

încovoiaţi dispuşi în corzi –BK (BAAR), bacili G(+) cilindrici mari cu capete
drepte dispuşi în lanţuri capsulaţi - Bacillus anthracis, cilindrici cu spor
terminal (bat de chibrit) b. tetanic (Clostridium tetani), cilindric gros cu spor
subterminal (rachetă de tenis) b. botulinic, gros scurt spor subterminal
Clostridium perfringens, măciucaţi dispuşi în palisade sau litere chinezeşti –
Bacilul difteric. Bacili G(-)fusiformi cu capete ascuţite - Fusobacterium, bacili
cilindrici cu capete rotunjite – Enterobacteriile.
Cocobacilii au o lungime de 1-5μ şi lăţime de 0,2-0,5μexemplu, Bacilul

pertusisşi al pestei.
Bacteriile spiralate pot fi cu spire deformabile cu amplitudine mare –

Borelia, sau cu spire nedeformabile Spirochetele (Treponema şi
Leptospira)(Fig. 3.2.)
Fig.3.2.Exemple de forme bacteriene(desen C. Defta)
3.3. Medii de cultură.
Definiţie: reprezintă suportul steril alcătuit din substanţe energetice şi

nutritive, care să asigure dezvoltarea şi izolarea germenilor în afara nişei
ecologice.
Condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească un mediu de cultură:
1. Să fie steril, aşezat în recipiente ermetice;
2. Să asigure substanţele necesare dezvoltării germenilor (surse de

carbon, de azot, etc.), factorii nutritivi
(săruri minerale, factori de creştere, vitamine, etc.) conform

necesităţilor metabolice ale germenilor;
3. Să aibe un pH optim (7-7,6)- excepţie fac anumiţi germeni (ex.

Vibrio);
4. Să fie izoton;
5. Să aibe o umiditate favorabilă dezvoltării germenilor;
6. Să aibe potenţial de oxido-reducere;
Criterii de clasificare a mediilor şi exemple de medii.
Pe baza diferitelor criterii privind aspectul şi compoziţia lor, precum şi

natura ingredientelor folosite la prepararea lor, mediile de cultură pot fi
împărţite:
1. După starea de agregare:

- medii lichide, exemple: bulion Mueller-Hinton, bulion nutritiv, bulion sânge,
bulion selenit, bulion thioglicolat, etc.
Fig. 3.3. Geloza sânge Fig. 3.4. Geloza MH cu sânge Fig. 3.5. Medii de
identificare(fotoD.Ionescu)
- medii solide, exemple: geloză (agar) (Fig. 3.3.), AABTL, ADCL, Chapman,
Müeller-Hinton (Fig. 3.4.);
- medii semi-solide, exemple: Cary-Blair, MIU, MILF, TSI etc. (Fig. 3.5.);
2. După complexitatea ingredientelor:
- medii simple, exemple:agar, bulion simplu, etc.;
- medii complexe, exemple:agar-sânge, geloză chocolat, agar cu factori X şi

V.
3. După scopul urmărit:
a) Medii de transport: asigură condiţii optime germenilor de la recoltare

pană la însămânţare; exemple: mediul Cary-Blair pentru enterobacterii,
mediul Stuart pentru streptococ, etc;
b) Medii de îmbogăţire: pot fi lichide sau solide, conţin factori care

favorizează înmulţirea anumitor bacteriişi inhibând creşterea altora
(prelungesc faza de ”lag” a bacteriilor de contaminare) în produsele
patologice cu floră de asociaţie;
- exemple: mediul Pike pentru îmbogăţirea streptococilor: bulion glucozat cu

cristal violet (inhibă dezvoltarea stafilococilor), acid de Na (inhibă Gram
negativii), +/- sânge;
- mediul hiperclorurat pentru îmbogăţirea stafilococilor: bulion + NaCl 7,5%;
- mediul Müllfer-Kauffmann pentru Salmonella spp.: bulion + verde briliant,

carbonat de Ca, bilă, iod-iodurat;
- mediul OCST pentru bacilul difteric: ou, cistină, ser, telurit de potasiu;
c) Medii de izolare
Mediile selective- medii solide, acestea conţin substanţe bacteriostatice

care inhibă dezvoltarea anumitor specii bacteriene din flora asociată,
favorizând dezvoltarea altora.
Se pot clasifica în: - slab selective;
- moderat selective;
- înalt selective;
Exemple: -mediul Leifson (ADCL – agar dezoxicholat citrat, lactoză) - pentru

enterobacterii:săruri biliare +
lactoză + roşu neutru;
-mediul Levine (EMB – eosine – methyl blau) - pentru

enterobacterii, E. coli:eozină + albastru de
metilen + lactoză;
-mediul Istrati-Meitert - pentru enterobacterii: bila, + lactoza +
albastru de bromtimol;
-mediul Chapman - pentru stafilococi: NaCl 7,5% + manitol +

roşu fenol;
Mediile elective- acestea conţin ingrediente care favorizează

dezvoltarea unor anumite specii bacteriene, exemplu mediu Löffler
favorizează dezvoltarea bacilului difteric în 8-12 ore faţă de alte bacterii care
se dezvoltă în 18-24 ore;
d) Mediile de diferenţiere sau identificare-permit identificarea

germenilor după caracterele biochimice (fermentarea zaharurilor,
capacitatea de oxidoreducere, utilizarea citratului ca unică sursă de
carbon,etc.); exemple:
- geloză lactozată: lactoză + albastru de bromtimol – se studiază

fermentarea lactozei;
- mediul Hiss: un zahăr + albastru de bromtimol – se studiază

fermentarea zaharurilor;
- MIU (mobilitate, indol, urează): agar semisolid pentru studiul

mobilităţii, bogat în triptofan pentru studiul producerii de indol şi
conţinut de ureee pentru detectarea producerii de urează;
- TSI (triple sugar iron) conţine glucoza, lactoza, zaharoza pentru

studiul fermentării acestora, sulfat de Fe pentru detectarea
producerii de hidrogen sulfurat (Fig. 3.5.)
- Simmons – mediu cu citrat pentru studiul folosirii citratului ca unică

sursă de carbon (Fig. 3.5.);
e) Medii de conservare - care permit păstrarea bacteriilor un timp
îndelungat; mediul Löwenstein pentru bacilul Koch, mediul Graves pentru
anaerobi.
3.4. Tehnici de însămânțare a produsului patologic și tehnici de

izolare bacteriană. (Doris Ionescu)
Insămânţarea reprezintă operaţia de introducere a produsului patologic

într-un mediu de cultură artificial.
Izolarea: repicarea unei singure colonii pe alte medii de cultură cu

scopul de a obţine o cultură pură.
A. Tehnica însămânţării unui produs patologic pe mediul lichid
Scop: îmbogăţirea unui inocul bacterian dintr-un produs patologic insuficient

cantitativ sau care conţine floră de asociaţie;
Materiale necesare: produs patologic, mediu lichid (bulion), ansa

bacteriologică, bec de gaz.
Tehnică:
- Se sterilizează ansa bacteriologică până la incandescenţă, urmată de

flambarea portansei;
- Se scoate dopul recipientului care conţine produsul patologic şi se

flambează uşor, prin trecerea gurii eprubetei
de 2-3X prin flacără;
- Se introduce ansa, se răceşte de pereţii eprubetei şi se încarcă cu produs

patologic;
- Se flambează din nou şi se ataşează din nou dopul;

- Se flambează gâtul eprubetei cu mediu lichid, după ce i-a fost îndepărtat
dopul;
- Se introduce ansa în eprubeta cu mediu lichid, fără a se atinge pereţii

eprubetei;
- Se descarcă ansa în mediul lichid, prin agitarea uşoară şi lovirea de pereţii

eprubetei;
- Se flambează din nou eprubeta, se ataşează dopul şi se agită prin lovirea

în palma stângă pentru o mai bună
omogenizare;
- Se introduce la termostat timp de 24 ore la 37 grade Celsius;
Citire: creşterea şi înmulţirea bacteriilor pe mediul lichid se va evidenţia prin

tulburarea omogenă a mediului de cultură;
B. Tehnica însămânţării unui produs patologic pe geloză înclinată.
Scop: identificarea biochimică a bacteriilor.
Materiale necesare: produs patologic, geloză înclinată, ansă bacteriologică,

bec de gaz.
Tehnică:



patologic;
- Se flambează gâtul eprubetei cu mediu lichid, după ce i-a fost îndepărtat

dopul;
- Se introduce ansa în eprubetă cu geloza inclinată, fără a se atinge pereţii

eprubetei;
- Se descarcă ansa pe suprafaţa gelozei, cu mişcări de zig-zag, începând din

capătul opus gurii eprubetei;
- Se flambează din nou eprubeta, se ataşează dopul (Fig. 3.6.);
- Se introduce la termostat timp de 24 ore la 37oC;
Citire: în funcţie de caracterele biochimice se va observa de exemplu

fermentarea zaharurilor cu sau fără producere de gaz, virarea culorii
mediului în funcţie de utilizarea substratului, producerea de hidrogen
sulfurat, producerea de indol, etc.
Fig 3.6.Însământare în plan înclinat Fig. 3.7. Însămânţare pentagon

Fig.3.8 Culturăîn placă(foto D. Ionescu)
Tehnica însămânţării pe mediul solid, prin tehnica dispersiei în
pentagon.
Scop: obţinerea de colonii izolate dintr-un produs patologic pluribacterian.
Materiale necesare: produs patologic, placă Petri cu mediu solid, ansă

bacteriologică, bec de gaz;
Tehnică:



patologic;
- Se ia placa Petri, aşezată cu capacul în jos, se ridică placa şi se descarcă

ansa pe suprafaţa mediului trasând 3-4
linii paralele, ce vor constitui primul cadran.
- Se sterilizează ansa şi se răceşte în mijlocul plăcii;
- Se trasează al doilea cadran cu 3-4 linii paralele, care vor intersecta primul
cadran;
- Se repeta operaţiile de mai sus pentru cadranul trei şi patru;
- Al cincilea cadran va fi trasat cu o singura linie ce intersectează cadranul

patru, după care se epuizează ansa în
zig-zag, spre mijlocul plăcii, fără a intersecta primul cadran;
- Se introduce placa la termostat timp de 18-24 ore (Fig. 3.7).
Citire: în primele cadrane se vor obţine colonii bacteriene suprapuse,

confluate; în cadranele patru şi cinci se va observa apariţia coloniilor izolate
(Fig.3.8).
4.1. Tehnici de identificare bacteriană.

Identificarea bacteriana se realizeaz ținând cont de trei criterii:
caracteristicile macroscopice, microscopic și
biochimice
I. Caracteristicile macroscopice sau de cultură:
a) morfologia coloniilor: aspect, formă, relief, mărime, margini (Fig. 4.1).

Fig. 4.1.Exemplu de margini și suprafață bacteriană(desen C. Defta)
b) suprafaţa coloniilor: - forma S: netedă, lucioasă, margini regulate;
- forma R: rugoasă, mată, margini neregulate;
c) culoarea coloniilor: determinate de pigmentogeneză sau de virajul

indicatorului de culoare inclus în mediu.
- pigmenţi intracelulari – nu difuzează în mediu, vor colora doar colonia

(stafilococul-galben auriu/galben citrin);
- pigmenţi extracelulari – difuzează în mediu, colorează şi mediul

(Pseudomonas/verde foasforescent).
d)mirosul: unii germeni au miros caracteristic:
Proteus – fetid;
Candida – drojdie;
Esherichia coli – varză acră;
Pseudomonas – miros aromat, floral de tei;
Shigella – miros de spermă.
II. Caractereisticile microscopice în care se observă imaginea

microscopică a frotiului obţinut din cultură
bacteriană obţinută în urma izolării agentului patogen.
III. Caracteristicile biochimice

Teste enzimatice:
a) Testul catalazei pe lamă;
Catalaza este o enzimă ce descompune peroxidul de hidrogen în oxigen şi

apă.
Tehnică: Pe o lamă de microscop se depune 1 picătură de apă oxigenată

20%, în care, cu ansa, se emulsionează colonia de testat - se folosesc
colonii de pe un mediu fără sânge, pentru a evita reacţii fals pozitive datorită
catalazei eritrocitare (din mediul geloză –sânge).
Citire şi interpretare: Reacţie pozitivă: apariţia bulelor de gaz până la

efervescentă
Reacţie negativă: absenţa bulelor.
Exemple: Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli sunt gemeni catalazo-

pozitivi, Enterococcus faecalis-catalazo-negativ (Fig.4.1.).
Fig.4.1.Reacția catalazei (foto D. Ionescu) Fig.4.2. Reacția
oxidazei(foto D. Ionescu)
b) Testul oxidazei
Oxidaza (citocrom oxidaza) este o enzimă din lanţul respirator al

bacteriilor, care lipseste la bacteriile strict anaerobe. Reactivul folosit conţine
tetrametil-p-fenildiamina care se oxidează determinând apariţia culorii violet
sub acţiunea citocrom oxidazei).
Tehnica: pe o bucată de hartie de filtru se pune o picatură de reactiv

pentru oxidază. Cu o ansă se prelevă o porţiune din colonia de testat, care
va fi etalată uşor pe hartia umezită.
Citire şi interpretare:
Test pozitiv: apariţia culorii violet (purpuriu) în maxim 10 secunde.
Test negativ: absenţa culorii (Fig.4.2.).
c) Testul coagulazei - este un test folosit la diferenţierea

stafilococilor. S. aureus coagulează plasma prin producere de coagulază, în
timp ce S.epidermidis nu produce coagulază.
Tehnica: - pe lama
Pe o lamă de microscop se pune o picătură de plasmă umană (se poate

folosi şi plasma de iepure). În picătură se omogenizează cu ansa o colonie
din cultura pură a bacteriei de identificat. Omogenizarea se continuă
imprimând lamei mişcări de rotaţie.
Citire și interpretare:
• Test pozitiv - apariţia de grunji, care lasă picătura limpede;
• Test negativ - amestecul rămâne omogen;
Orice reacție negativă se continuă cu testarea coagulazei în tub.

- în tub -0,5 ml plasmă se incubează cu 0.5 ml cultură de 24 ore a tulpinii
de testat în bulion glucozat,la 37 C
pentru patru ore.
Citire şi interpretare:
• Rezultat pozitiv presupune apariţia unui coagul, se poate prelungi

incubarea probei până la 16-18 ore, dacă coagulul nu a apărut în
primele patru ore, cu verificarea periodică a probei;
• Rezultat negativ - lipsa coagulului;
c) Producerea de hemolizine: se observă pe medii ce conţin sânge.
- Hemoliza alfa sau hemoliza parţială (parte din hematii rămân intacte) se
evidenţiază prin înverzirea mediului din
jurul coloniei;
- Hemoliza beta sau hemoliza completă: zona clară (toate hematiile sunt
distruse);
- Hemoliza alfa-prim – apare o zona de hemoliză incompletă, încojurată de

hemoliza completă;
- Hemoliza gamma- impropiu numită, deoarece indică absenţa hemolizei.
Teste biochimice
a) Studierea metabolismului glucidic.
1. Fermentarea manitei pe mediul Chapman.
- fermentarea manitei se face cu producere de acid;
- culoarea indicatorului (roşu fenol) virează în galben;
- se diferenţiază: stafilococii patogeni – manitopozitivi;
stafilococii nepatogeni – manitonegativi.

2. Fermentarea lactozei pe mediul Istrati-Meitert
- fermentarea lactozei se face cu producere de acid;
- culoarea indicatorului (albastru de bromtimol) virează în galben;
- se diferenţiază enterobacteriile;
patogene – lactozonegative
nepatogene – lactozopozitive.
3. Fermentarea lactozei pe mediul Leifson
- culoarea indicatorului (roşu neutru) virează în roşu;
- se diferenţiază enterobacteriile patogene de nepatogene.
4. Fermentarea lactozei pe geloză lactozată
5. Fementarea zaharurilor pe mediul Hiss
- în mediul Hiss lichid se introduce un glucid;
- fermentarea lui duce la formare de acid;
- evidenţierea producerii de gaz se face cu tub Durham.
6. Fermentarea zaharurilor pe mediul TSI
- fermentarea glucozei se studiază pe porţiunea dreaptă;
- fermentarea glucozei se face cu producere de acid;

- culoarea indicatorului (roşu fenol) virează în galben;
- fermentarea lactozei, zaharozei se studiază pe porţiunea înclinată.
b) Studierea metabolismului proteic
1. Producerea de indol
- degradarea proteinelor (triptofanul) se face cu producere de indol;
- indolul în contact cu reactivul Erlich (galben) formează de nitrozoindol

(roşu).
Metode de evidenţiere:
a). Extragerea indolului cu eter
- în apă peptonată însămânţată + eter + reactiv Erlich
inel roşu – indol pozitiv
inel galben – indol negativ
b). Benzi pentru reacţia indolului
- benzi de hârtie de filtru impregnate cu reactiv Erlich (galbene)
- se ataşează la dopul eprubetei cu apă peptonată sau mediul MIU
banda devine roșie – indol pozitiv
banda rămâne galbenă – indol negativ
2. Producerea de H2S.
- descompunerea proteinelor se poate face cu producere de H2S,
- H2S în contact cu săruri de fier sau plumb formează sulfuri de culoare

neagră.
Metode de evidenţiere:
a). Benzi pentru H2S
- benzi de hârtie de filtru impregnate cu acetat de plumb (albe)
- se ataşează la dopul eprubetei cu apă peptonată însămânţată

banda devine neagră – H2S pozitiv
banda rămâne albă – H2S negativ
b). Pe mediul TSI
- mediul conţine săruri de fier şi proteine;
- se însămânţează prin înţepare;
- apariţia unui inel negru între porţiunea dreaptă şi cea înclinată - H2S
pozitiv;
c). Pe mediul PISU cu cisteină
- mediul conţine cistină şi acetat de plumb;
- se însămânţează prin înţepare;
- apariţia unui halou cafeniu în jurul înţepăturii - H2S pozitiv;
3.Testul ureazei.
- se studiază pe mediul MIU;
- scindarea ureei se face cu producere de amoniac;
- mediul devine alcalin, culoarea indicatorul (roşu fenol) virează în roşu.
c ) Alte teste biochimice
1. Mobilitateagermenilor se studiază pe mediul MIU
- însămânţare prin înţepare:
mobilitate negativ- mediul rămâne clar
mobilitate pozitiv – mediul se tulbură
2. Folosirea citratului ca sursă de carbon
- se studiază pe mediul Simmons;
- dacă germenii folosesc citratul în metabolism, cresc şi alcalinizează mediul;
- culoarea indicatorului (albastru de bromtimol) virează în albastru.

Teste antigen-anticorp (vezi rectia Ag- Ac)
4.2. Testarea sensibilității la antibiotice a tulpinilor bacteriene-

ANTIBIOGRAMA
Antibiograma: reprezintă testarea sensibilităţii unei tulpini bacteriene la

antibioticeşi chimioterapice.
1. Metode calitative: Metoda difuzimetrică Kirby-Bauer
Principiul reacţiei constăîn apariţia unei zone de inhibiţie în jurul discului

cu antibiotic, aceasta zonă este proporţională cu sensibilitatea tulpinii testate
la anibiotic sau chimioterapic.
Prepararea inoculului:
- se suspensionează 2-3 colonii izolate în ser fiziologic;
- turbiditatea suspensiei trebuie să fie de 0.5 McFarland (1,5x108cfu/ml).

Aceasta se controlează nefelometric sau comparând cu tuburile etalon
(conţin suspensii de particule latex/sulfat de bariu având turbiditate
determinată);
Însămânţare:- se alege un mediu corespunzător speciei bacteriene testate:
- Müeller-Hinton pentru majoritatea bacteriilor;

- Müeller-Hinton cu sânge pentru pretenţioşi (ex. streptococi);
- medii speciale (pentru Haemophilus spp ., Neisserii);
Tehica însămânţării în pânză:
a. se introduce un tampon în suspensia bacteriană, se stoarce pentru

îndepărtarea excesului de lichid;se însămânţează uniform toată
suprafaţa mediului pe 3 direcţii;
b. se inundă uniform placa cu inocul,excesul de inocul este prelevat cu o
pipetă Pasteur şi introdus în amestec sulfocromic pentru a impiedica
contaminarea. În ambele cazuri se lasă placa pe masa de lucru cu
capacul desfacut, la uscat cca. 15 min. la temperatura camerei.
Depunerea microcomprimatelor de antibiotice:
- se aleg antibioticele care trebuiesc testate în funcţie de specia bacteriană

izolata şi în funcţie de localizarea
infecţiei;
- se depun discurile de antibiotic la 1,5 cm distanţă de marginea cutiei Petri

şi la 2 cm distanţă unul faţă de
celălalt;
Incubare:- la 35°C,în funcţie de specia bacteriană: în atmosfera obişnuită

sau atmosferă de CO2 (ex. streptococi,
Neisserii.);
- timp de 16-18 ore (pentru germenii pretenţioşi până la 20-24 de ore);
Citire şi Interpretare:- apare o cultură bacteriană confluentă, în jurul

microcomprimatelor apar zone de inhibiţie
(lipsa creşterii bacteriene) (Fig. 4.2.);
Fig. 4.2. Antibiograme (foto D. Ionescu)
- se citesc diametrele zonelor de inhibiţie;
- se compară diametrele citite cu diametrele standard în

funcţie de antibiotic, cantitatea de
antibiotic din comprimat, specia bacteriană testată;
- pot apărea fenomene de sinergism/antagonism care

reflectă diferite mecanisme de rezistenţă;
- colonii izolate în interiorul zonei de inhibiţie: subpopulaţii

rezistente(mutante);
Tabel 4.1. : Exemple de diametre standard, conform standardelor NCCLS

(National Committee for Control
Laboratory Standards USA). CA-SFM (Commitee de l'Antibiogramme -

Societe Francaise de Microbiologie):
Specii bacteriene Antibiotic Sensibil Intermedia

sensibil
NCCLS S. aureus Oxacilină 1 µg > 14 mm 11-13

0Interpret
SCN Oxacilină 1 µg > 18 mm -
area
antibiogra
CA-SFM S. aureus sau Oxacilină 5 µg > 20mm -
melor:
SCN
- rezultatul se raportează: sensibil (S), intermediar sensibil (IS) sau

rezistent (R) laantibioticul testat;
- nu se comunică diametrele citite (metodă calitativă);
Variabilele care influenţează rezultatele:
- compoziţia mediului (conţinut de cationi, timidină);

- pH (optim: 7,2-7,4);
- grosimea gelozei (standard: 4 mm);
- inoculul - 0,5 McFarland;
- microcomprimate (valabilitate, conţinut, condiţii de păstrare);
- timpul, temperatura de incubare;
- citirea diametrelor (lumină refractată/reflectată, colonii izolate,
prezenţa unui văl, margini crenelate);
Control de calitate:a microcomprimatelor iar loturile noi de medii de cultură
se testează cu tulpini de referinţă;
2. Metode cantitative:- permit stabilirea concentraţiei minime inhibitorii

(CMI) a unui antibiotic
CMI: cantitatea cea mai mică de antibiotic care inhibă complet multiplicarea
unei bacterii
Este recomandată testarea cantitativă în următoarele situaţii:
- cazuri clinice grave (septicemii, endocardite, meningite)

- 0rezultate incerte cu metoda difuzimetrică / sensibilitate
nedeterminată;
- situaţii speciale (de ex. testarea sensibilităţii pneumococului la
penicilină printr-o metodă cantitativă când diametrul zonei de inhibiţie
la oxacilină este sub 20 mm)
CMI obţinut se raportează la punctele de ruptură superior şi inferior date de
NCCLS sau CA-SFM.
Tabelul4.2. Exemplu: Puncte de ruptură CMI în ug/ml pentru ampicilină
Specii bacteriene Sensibil Intermediar sensibil Rezisten
Stafilococi ≤ 0,25 - ≥ 0,5
0Enterococi ≤8 ≥16
Enterobacterii ≤8 16 ≥32
3. Metoda diluţiilor (macro/microdiluţie):
- se realizează diluţii succesive din antibioticul de testat în mediu de

cultură lichid;
- se adaugă cantităţi fixe din cultura bacteriană cercetată;
- incubare 18ore 35°C;
- se urmăreşte apariţia culturii în mediul lichid;
CMI: cea mai mică concentraţie de antibiotic care nu permite creşterea
germenilor (cultură limpede);
4. Metoda diluţiilor în agar:
- se realizează diluţii succesive din antibioticul testat în geloză Müeller-

Hinton, se însămânţează cultură bacteriană în spoturi;
- citire: CMI - concentraţia cea mai mică care inhibă complet creşterea
sau apare o singură colonie
5. E-test:
- pe suprafa0ţa mediului de cultură solid şi însămânţat se aplică fâşii din

plastic impregnate cu antibiotic în concentraţie crescândă - la un capăt
concentraţia este minimă, la celălalt este maximă; gradaţiile sunt
notate pe fâşie;
- incubare;
- apar zone de inhibiţie de formă elipsoidală, în dreptul intersectării cu
fâşia de plastic se citeşte CMI (Fig.
4.3.);
Fig. 4.3. E-test (foto C. Defta)

0
5.1. Reacția antigen-anticorp de diagnostic.
Reactia antigen (Ag) - anticorp (Ac) este o reacţie specifică care se

realizeazăîntre epitopul antigenului şi paratopul anticorpului. Complexele Ag-
Ac sunt cu atât mai stabile cu cât energia de legare a elementelor implicate
în reacţie este mai mare. Există doi parametrii care influentează interacţia
dintre Agşi Ac; primul fiind afinitatea ce implică structurile complementare
dintre Ag şi Ac, în acest caz afinitatea poate fi înaltă ce comportă structuri
perfecte complementare sau mai scazutăîn care forţele de respingere între
grupările de legare sunt mai mari decât cele de legare. Cel de-al doilea este
aviditateadintre epitopi00i multipli ai unui antigen şi paratopii anticorpului.
Clasificarea reacţiilor antigen-anticorp;
1.Reacţia de precipitare: - în mediu lichid –reacţia Ascoli
- în mediu solid-imuno difuzia radiară simplă – teh.

Mancinii
2.Reacţia de aglutinare: -în tuburi;reacţie de serodiagnostic - reactia Widal
- pe lamă; reacţie de seroidentificare – identificarea Enterobacteriilor,

grupelor de
Streptococi
3.Reacţia de neutralizare: - cantitativă - reacţia ASLO

- calitativă – reacţia Eleck
4.Reacţia de fixare a complementului (RFC)
5.Treacţia Ag-Ac cu markeri: -fluorescenţi –imunofluorescenţa (IF)
-enzimatici - ELISA
-radioactivi – radioimunoanaliza (RIA)
1. Reacţia de precipitare
Reacţia de precipitare este o reacţie în care antigenul solubil vine în contact
cu anticorpul specific în faza lichidă sau solidă, complexele formate Ag-Ac
devin insolubile şi stabile fiind astfel vizibile sub forma precipitatelor.
1.1 Reacţia de precipitare în mediu lichid –reacţia Ascoli
Este o reacţie de precipitare în inel utilizată pentru identificarea prezenţei

antigenului carbunos (Bacillus anthracis).
Tehnica: Ag se obţine din organe recoltate de la animale moarte cu antrax.
Se utilizează3 tuburi, din care primul este cel de testat iar celelalte 2 sunt
martor de Ag şi martor de ser.
În tubul de proba se pun 0,5 ml ser anticarbunos,urmând ca cei 0,5 ml din

soluția cu antigen săfie turnaţi lent prin prelingere pe peretele intern al
tubului, aşa încăt, cele 2 soluţii să nu se amestece.În cazul reacţiei pozitive
într-un interval de 5 minute, la limita dintre cei 2 reactivi apare un inel de
precipitare alb-opalescent.
În cazul martorului de antigen se pun în tub 0,5 ml ser normal de cal şi 0,5
ml soluţie de Ag.În tubul martor de ser se pun în tub 0,5 ml ser anticarbunos
+0,5 ml ser fiziologic în ambele situaţii nu trebuie să apară precipitarea.
1.2. Reacţia de precipitare în mediu solid –Imunodifuzia radiară simplă

(IDRS tehnica Mancini)
Principiul reacţiei constăîn difuzia Ag din serul provenit de la pacient,în
gelozaîn care se aflăincorporată ocantitate constantăşi uniformăde Ac
specific. La întâlnirea Ac cu Ag se formează o zonă de precipitare a cărei
diametru este direct proporţional cu concentraţia antigenului. Anticorpul
incorporatîn geloză este un anticorp anti elementul pe care vrem să-l
determinăm.
Tehnică: Sunt necesare plăcute cu godeuri, acestea au culori diferite în

funcţie de Ac incorporat (ex. plăcutele pentru determinarea IgG au culoarea
roșie, etc.). Serul provenit de la pacient este diluat 1/4 pentru IgG, Ig A,
siderofilina şi 1/2 pentru Ig M).
În godeul din mijloc se pune serul de referință, iar in cele de pe

margine se pune ser povenit de la pacienți
(Fig 5.1.)
00
Fig 5.1. Placă cu godeuri(1)Fig.5.2.Placă cu inelele de precipitare(2 –inel, 3-

diametrul inelului)
Plăcuţele sunt ţinute pe masă 10 minute, apoi sunt incubate la 370C

timp de 24 de ore, iar pentru Ig A şi Ig M se ţin 48 de ore.
Citirea și interpretarea rezultatelor: Cu ajutorul unei rigle gradate se

măsoară diametrul inelului (Ø) de precipitare din centru unde a fost pus
serul de referinţă. Dacă valoarea găsită este cea dată de tabele se merge
mai departe în măsurarea celorlalte diametre exprimate în mm, sunt apoi
căutateîn tabelul ce însoţeşte setul de plăcuţe. Valoarea găsităîn dreptul
dimensiunii se înmulţeşte cu inversul diluţiei,în funcţie de diluţia aplicată iar
valoarea găsită se exprimăîn UI/ml(Fig. 5.2)
2. Reacţia de aglutinare
Aceasta este o reacţie Ag-Ac în care Ag este corpuscular (corp bacterian,
flagel) iar reacţia decurge în 2 etape. În prima etapă specifică are loc
formarea complexelor Ag-Ac pe bază de specificitate. În cea de a 2-a
etapăse formeazăcomplexele secundare care sunt agregate mai mari legate
prin forţe intermoleculare, necovalente, precum legături de hidrogem, forţe
electrostatice, legaturile Van der Waals şi legături hidrofobe.
3.1. Reacţia de aglutinare în tuburi- reacţia Widal

Principiul reacţiei: este o reacţie de serodiagnostic al febrei tifoideşi
constăîn identificarea Ac-lor din serul pacientului prin intermediul Ag-nelor
cunoscute de tip O sau H (aparţinând Salmonellei tiphy). Este o reacţie care
stabileşte atât prezența cât şi titrul Ac-lorîn febra tifoidă.
Tehnică: Se pregătesc 2 şiruri de eprubete în care se fac diluţii (1/40,

1/80,1/160 etc.)în ser fiziologic a serului provenit de la pacient, fiecare tub
conţine 0,5 ml. În primul şir se adaugă 0,5 ml ser Ag O iar în cel de al doi-
lea rând se adaugă 0,5 ml Ag H. Pentru fiecare şir se pregătesc şi martorii
(ser fiziologic + Ag O sau H).
Dacă se urmăreşte procesul infecţios în dinamică se recoltează produsul

patologic la 7-10 zile de la prima recoltare iar prelucrarea este aceiaşi ca mai
înainte.
Cele douăşiruri se incubează astfel: tuburile cu Ag O la 52oC timp de 20

de ore, iar cele cu Ag H se incubează 2 ore la 52oC şi încă 10 minute la
temperatura camerei.
Citirea şi interpretarea reacţiei:0
Tuburile sunt examinate printr-o uşoară agitaţie, pentru a

surprindeaglutinatele sub forma de grunji. Titrul reacţiei este dat de ultimul
tub la care se constată prezenţa grunjilor (Fig. 5.3)
Fig. 5.3. Reactia Widal (bacteria de tuburi şi detaliul reacţie pozitivăşi

negativă)(foto C. Defta)
Titrul normal pentru Ag O este de 1/200, iar pentru Ag H 1/1000.
Reacţia este semnificativă dacă se dublezăîn săptămâna III de boală sau

dacă titrul creşte de patru ori în dinamică.
3.2. Reacţia de aglutinare pe lamă

Este o reacţie Ag-Ac de identificare a tupinii bacteriene izolata dintr-o
boală infecţioasă. Prin cultivarea
produsului patologic pe medii specifice se obţin colonii izolate pe care le

putem identifica prin reacţia de aglutinare pe lamă.
Tehnică: Materialele necesare - colonie tânără, ser fiziologic şi Ac

cunoscuţi faţă de Ag pe care dorim să-l identificăm, lama de microscop.0
Pe o lamă se pune o picătură de ser fiziologic în care omogenizăm un

fragment din colonia ce dorim s-o identificăm. Dacă picătura rămâne
opalescentă se continuă reacţia, dacă apar grunji înseamnă că tulpina şi-a
modificat structura (colonia poate fi de tip”R”) iar reacţia nu se continuă
deoarece s-ar obţine rezultate fals positive.
Dacă reacţia se poate continua se procedeaza astfel; pe aceiaşi lamă se

pune o picătură de ser cu Ac-ul tulpinii ce urmează să fie identificată apoi se
omogenizează un fragment din colonie cu serul aferent, se amestecăpânăce
se obţine o suspensie tulbure. Se roteşte uşor lama pentru a favoriza
contactul Ag-lui cu Ac şi respectiv contactul complexelor Ag-Ac. Dacă reacţia
de identificare este pozitivă (s-a realizat reacţia Ag-Ac) vor apăre grunji de
aglutinare picătura devenind limpede; dacă nu picătura rămâne în
continuare opalescentă.
Această reacţie de aglutinare directăeste folosită pentru identificarea

enterobacteriilor. Pentru identificarea serologica a Streptococilor, Candidei şi
Neisseriilor este necesara liza enzimatică a bacteriilor, urmată de reacţia Ag-
Ac de identificareîn acest caz aglutinarea este indirectă.(vezi tehnica
aglutinării pe lamăa cocilor G (+şi -)).
3. Reacţia de neutralizare
Reprezintă reacţia Ag, Ac în care Ac-ului neutralizează efectul toxic al Ag-
nului.
Principiul constăîn punerea în contact a unor Ac antitoxici cu Ag omolog iar

în final va duce la anihilarea efectului antigenului. 0
Seroneutralizarea poate fi- calitativă- testul Eleck
- cantitativă– reacţia ASLO

3.1. Testul Eleckeste o reacţie Ag, Ac în care Ac antitoxina difterică
neutralizează antigenul reprezentat de toxina difterică sintetizată de tulpinile
toxigene de bacil difteric.
Tehnică: Pe o placă mare cu geloză se practică central o fantăîn care se

pune Ac antitoxina difterică, iar de-o parte şi alta a fantei se însământează
tulpini diferite de bacil difteric. Se introduce placa la termostat la 370C, iar
după 24 de ore se face citirea. Acolo unde tulpina a produs toxina difterică
(ex .T1 şi T4 Fig. 5.4.) a difuzat în mediu iar la locul de întâln0ire cu Ac
reacţia este vizibilă printr-un arc de precipitareîn vecinătatea fantei.
T1
1T2
T3
T4
T5
Fig. 5.4. Reacţia Elek cu arcurile de precipitare(desen C. Defta)
3.2. Reacţia ASLO

Principiul reacției constăîn neutralizarea efectului hemolitic a streptolizinei O
(SLO) asupra hematiilor de iepure sau de berbec, de către anticorpii anti
streptolizina O proveniți din serul pacienților
Tehnică: Se realizeaza o baterie cu tuburi de hemoliză ce conţin ser

provenit de la pacienţiîn diluţiilede 1/12, 1/50, 1/100, 1/150/ 1/166, 1/250,
1/333, 1/700, 1/1000în ser fiziologic.Se adaugă aceiaşi cantitate de SLO. Se
agită pentru o bună omogenizare după care se ţin tuburile, la 370C timp de
15 minute. Se adaugă suspensia de hematiide iepure 0,5 ml/tub. Se agită
din nou apoi se incubează 45 de minute la 370C.
Citirea şi interp00retarea reacţiei:
Titrul reacţiei este dat de ultimul tub la care se constată absenţa hemolizei.
Reacţie pozitivă este caracterizată de absenţa hemolizei (prezenţa Ac-anti-
SLO a neutralizat efectul SLO), reacţia negativă caracteriată prin prezenţa
hemolizei (în absenţa Ac, SLO rămâne liberăşi hemolizeză hematiile)
Titrul normal este de 200 Todd (Fig. 5.5)
Fig. 5.5 Reactia ASLO(foto C.

Defta)
4. Reacţia de Fixare a Complementului (RFC)
Este o reacţie Ag, Ac care se bazeză pe proprietatea complementului de
ase fixa la complexele Ag-Ac, aceastareacţie nu este vizibilă direct, de aceea
se foloseste sistemul hemolitic care este un complex Ag-Ac format din
hematii de oaie legate cu anticorpi antihematii de oaie. Ag este o
cardiolipinăşi reprezintă un extract de cord de bou adsorbit pe cristale de
cholesterol.
Tehnică: se efectuează urmatoarele tuburi- tubul de cercetat şi martorii:

martor sigur pozitiv, martor sigur negativ, martor ser de cercetat, martor
Ag, martor de complement, martor sistem hemolitic.
Serului provenit de la pacient i se inactiveazăcomplementul propriu, prin

menţinere la 560C timp de 30’ în baie de apă. Într-o eprubetă se pun în
contact Ag cunoscut+ serul inactiv +complementul, iar eprubeta se ţine 24
de ore la frigider. A2-a zi se0 adaugă sistemul hemolitic - hematii de oaie pe
care sunt fixaţianticorpi antihematie de oaie. Dacăîn serul pacientului există
Ac se va forma complexul Ag-Ac la care se va lega complementul, adăugarea
sistemului hemolitic (SH) duce la depunerea lui la fundul tubului sub forma
unui bănuţ/buton roşu de hematii;
reacţie (+). Dacă nu există Ac în serul
pacientului, Ag rămâne liber, prin
adăugarea complementului acesta
rămâne liber iar prin adăusul SH,
complementul se va fixa la complexul
Ag-Ac reprezentat de H-AcH de oaie
ducând la liza hematiilor; reacţie (-
)(Fig. 5.6.)
Martorii au urmatoarea compozitie:

Martorul sigur pozitiv: Ag+Ac+C+SH= buton hematii
Martor sigur negativ: Ag + 0 + C+SH=hemoliza
Martor de antigen: Ag+SF+C+SH= hemoliza
Martor de complement: SF+SF+C+SH= hemoliza
Martor de sistem hemolitic: SF+SF+SF+SH= buton hematii
Fig.5.6. Reacţia RFC cu martori(foto C. Defta)
5. Reacţia Ag –Ac cu markeri se bazează pe proprietatea Ac de a se cupla

cu un marker fără să-şi modifice capacitatea de legare la Ag
5.1 Reacţia de Imunofluorescenţă se bazează pe proprietatea Ac de a se
cupla cu o substanţă fluorescentă(fluorocrom) fără să-şi modifice
proprietaţile biologice şi imunologice.Fluorocromii sunt compuşi organici
care în prezenţa radiaţiilor UV emit radiaţii luminoase. Exemplu de
fluorocromi; auramina O, rhodamina b, etc.
Imunofluorescenţa (IF) poate fi directă sau indirectă.
IF directă: când căutam antigenul folosind Ac marcat (Ac*). Antigenul în

acest caz poate fi: cultura bacteriană, produs patologic, fragment bacterianîn
acest caz este o reacţie de seroidentificare.
Tehnică: pe o lamăse pun în contact Ag şi Ac* se lasă 30’ la 370C. Se spală

lama cu tampon fosfat, apoi cu apă distilată, seusucăşi se examinează la
microscopul cu fluorescenţă.
Se pot identifica astfel Treponema pallidum, Mycobacterium tuberculosis,

Bordetela pertussis etc.
IF indirectă: se caută Ac, în reacţie se introduce un Ag cunoscut şi un Ac* Ig

umana, este o reacţie de serodiagnostic.
Tehnică: pe o lama se pun în contact Ag cunoscut şi Ac din serul de cercetat.
Se lasă la incubat 30’, la 370C. Se spală lama se adaugă apoi Ac anti Ig * şi
se incubează din nou 30’ la 370C. Se spală, se usucăşi se observă la
microscop.
Citirea şi interpretarea rezultatelor. Rezultatele se dau sub forma de “+”,

astfel: + nesemnificativ, ++slab semnificativ, +++ semnificativ, ++++înalt
semnificativ
5.2. Reacţia ELISA analiza imunoenzimaticăîn acest caz Ac cunoscut este

marcat cu o enzimă.
Tehnica ELISA poate fi folosită pentru identificarea Ag cât şi identificarea sau
titrarea Ac. Etapele de lucru sunt următoarele:
-În funcţie de ce dorim să depistăm în acest caz Ac sau Ag cunoscute sunt

fixate pe pereţii unor godeuri speciale.
-Se adaugă componenta pe care dorim s-o determinamfie Ag, fie Ac, dacă
are loc reacţia se formează complexul Ag-Ac.
-Se spală cu soluţie 0tampon pentru eliminarea surplusului de reactivi.
-Se adaugă reactivul marcat cu o enzimă (peroxidază) care se cuplează la

complexul deja format.Reacţia este urmată de o nouă spălare iar în final se
adaugă substratul cromogen, pe care enzima îl scindează iar în funcţie de
cantitatea de reactiv marcat, intensitatea culorii va fi mai intensă, atenuată,
sau foarte atenuată.
- Se face curba etalon (densitate optică cu concentraţia corespunzătoare)

după care se face citirea rezultatelor.
-Interpretarea rezultatelor se face conform indicaţiilor din protocolul care

însoţeşte trusa ELISA, este o reacţie cu specificitate şi sensibilitatea foarte
bună.
5.3. Radioimunoanaliza (RIA)în care marcărul este o substanţă
radioactivăexemplu3H, 14
C cuplată la Ag
cunoscut. În reacţie se introduce Ac provenit din serul pacientuluişi Ag
marcat. Se măsoară radioactivitatea complexului Ag-Ac cu un contor de
scintilaţii. Este o tehnică de mare fineţe putându-se identifica cantităţi
minime, dar tehnica necesită incinte şi echipamente speciale de aceea în
timp a fost înlocuită cu ELISA.
5.2. Produse biologice cu rol în diagnosticul bolilor infecțioase.
În principal sunt reprezentate de preparate de antigene şi anticorpi

cunoscuţi. Atunci când se cunoaşte Ac şi se caută identificarea Ag-lui se
numeşte seroidentificare, iar când în reacţie se introduce Ag cunoscut pentru
determinarea concentratiei de anticorpi se numeste serodiagnostic.
a. Preparatele de antigene sunt de fapt culturi microbiene sau fragmente

macroscopice microbiene.
Spre exemplu A0g-nele din Salmonella typhi se prepară din cultura de
Salmonella typhi: Ag H, Ag O, Ag Vi.
Un alt exemplu de antigene sunt treponemele nepatogene-Nikolson,
cardiolipinele (extracte de cord de bou adsorbite pe cristale de
cholesterol), SLO etc.Antigenele cunoscute sunt puse în contact cu un
ser provenit de la pacient care conţine anticorpi necunoscuţi. Dacă se
produc complexe Ag-Ac, sunt astfel puşi în evidenţa anticorpii
diagnosticându-se astfel boala.
b. Preparatele de anticorpi cunoscuţi. Se obţin prin injectarea Ag-nelor în
animalele de laborator, după care se recoltează serul ţi se separă Ac
specifici.
c. Se izoleaza de la pacient un agent etiologic necunoscut, ţinând cont de
toate criteriile de izolare suntem direcţionaţi să folosim un anume tip
de Ac cunoscut. Dacăîn urma reacţiei se formează comlexul Ag-Ac
identificăm astfel Ag (necunoscut). Reacţia se numeşte de
seroidentificare
Exemple de Ac de diagnostic: Ac specifici enterobacterilor, Ac specifici
diferitelor tipuri sau grupe de streptococi, neiserii, Ac marcaţi cu
markeri diferiți etc.
6.1. Diagnosticul de laborator în infecțiile produse de cocii Gram-

pozitivi.
6.1.1. Genul Staphylococcus
-Stafilococi coagulazo-pozitivi: S. aureus
-Stafilococi coagulazo-negativi (SCN) cu importanţă clinică: S. lugdunensis,

S. schleiferi, S. hyicus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus
Produse patologice
- portaj: secreţie din cavitatea nazală anterioară, exsudat faringian
- plăgi, otite, infecţii tegumentare  puroiul (S. aureus)0
- infecţii urinare  urină (S. saprophyticus, S. aureus)
- infecţii gastro-intestinale, toxiinfecţii alimentare  materii fecale,

vomismente, alimente.
- meningite  LCR
- septicemie, febră puerperală  sânge (S. aureus, SCN)
- pneumonie  spută.
- infecţii nosocomiale - S. aureus meticilino-rezistent (MRSA, SARM), SCN
meticilino-rezistent
1. Examenul direct al produsului patologic:
- macroscopic: puroi cremos, filamentos, gălbui.
- microscopic: coloraţia Gram: coci gram (+), dispuşi în grămezi

asemănătoare ciorchinilor de strugure
(Fig. 6.1.)
Fig. 6.1. Frotiu din pp., coci G (+) in

diplo, tetrade şi grămezi mai mari sau
mai mici(foto C.Defta)
2. Izolare: 0
- mediul de îmbogăţire: mediul

hiperclorurat lichid
- geloză sânge
- Chapman (Ch)
Incubare aerobă la 37°C, 18 – 24 ore.
3. Identificarea bacteriei:
- Caractere morfotinctoriale: frotiu din cultură pură  coci Gram (+), in

diplo tetrade sau în grămezi.
- Caractere de cultură: col “S” , mari, cu pigment galben-auriu până la

citrin, uneori pot fi şi mucoide tip M
- Caractere biochimice:
- oxidază -
- catalază +
- coagulaza liberă +: S. aureus;
- coagulaza liberă -: stafilococi coagulazo-negativi (SCN)
- coagulaza legată (clumping factor - CF) +: S.aureus, S. lugdunesis, S.

schleiferi
- producerea de DN-ază: S. aureus, S. schleiferi, S. hyicus
- descompunerea manitolului – pe mediul Chapman  Ma(+); tulpini

patogene;
- producere0 de pigment: de la auriu la portocaliu, galben citrin (S. aureus,

S. lugdunensis, S. Chromogenes,ş.a.)
- producerea de hemolizine – pe geloză-sânge vizibila ca o β-hemolizăîn

jurul coloniei
 hemoliza β (S. aureus, S. haemolyticus, ş.a.)
 nu prezintă hemoliză (majoritatea tulpinilor SCN)
- Identificare pe baza rezistenţei la novobiocină a S. saprophyticus
- R. Ag-Ac: determinarea enterotoxinei produsă de stafilococ
4. Determinarea patogenităţii:
in vitro: producerea de coagulază, hemolizine, descompunerea manitolului
in vivo: inocula0re la animale de laborator (cobai, iepure)
5. Tipizarea bacteriilor: pentru identificarea sursei de infecţie
- prin lizotipie (determinarea sensibilităţii stafilococului faţă de bacteriofagi;

este o sensibilitate stabilă a
stafilococului)
- prin metode de biologie moleculară
6. Antibiograma-obligatorie.
6.1.2. Gen Streptococcus

-S. pyogenes, S. agalactiae, S. grup viridans
- S. pneumoniae (Pneumococ)
- Enterococi – E. faecalis
Podus patologic:
S. pyogenes: exsudat faringian, secreţie din leziuni tegumentare, sânge

pentru serologie;
S. grup viridans: segăsesc în mod normal în faringe;
Enterococi: urină, secreţie uretrală, secreţie prostatică, secreţia canalului

cervical, puroi din plăgi, bilă, sânge;
S. agalactiae : secreţie vaginală, secreţia canalului cervical –la mamă;
LCR, sânge, aspirat bronşic – la nou-născut;
Pneumococ: spută, LCR, sânge;
Transportul produselor patologice se face în maxim 2 ore de la

recoltare, pentru cocimediul de transport este mediul Stuart, pentru
Streptococii βhemolitici de grup A se foloseşte mediul selectiv şi de
îmbogăţire Pick în care germenul poate rezista 3 zile la temperatura
camerei.
Examenul direct al produsului patologic:
-macroscopic:-S. pyogenes, S. de grup viridans;
-enterococii - nu este necesar examenul macroscopic a

produsului patologic;
-pneumococ  spută ruginie.
- microscopic: - coloraţia GRAM – coci gram(+):
-S. pyogenes: coci rotunzi, dispuşi în lanţuri (Fig. 6.2.);
- S. de grup viridans: coci rotunzi sau ovalari dispuşi în lanţuri;
- Pneumococii: coci lanceolaţi, dispuşi diplo cu capetele ascuţite

spre exterior şi înconjuraţi de o
capsulăproprie (Fig. 6.3);

- Enterococii: coci ovalari, mai mari, dispuşi tot în lanţuri.
Fig 6.2. Coci G(+) în

lanţuri mai lungi sau Fig. 6.3. Coci G(+) lanceolaţi in diplo capsulaţi
mai scurte (foto C. Defta)
Izolarea bacteriei:
- mediul de îmbogăţire: PIKE
- Geloză-sângecu cristal violet.
- Bulion-sânge; bulion ser; bulion glucozat
Identificare:
Caractere morfotinctoriale: (vezi anterior)
Caractere culturale : pe geloză sânge:
- col “S” cu hemoliză βeste punctiformă de culoare uşor albastruie

pe mediu geloză sânge cu cristal violet Streptococi β-hemolitici dau o
hemolizaclară, transparentă, totală.
sensibilitate faţă de BACITRACINĂ Determinarea hidroca

- identificare grup A peretele bacterian pr
şi aglutinare – stabilir
- col “S” cu hemoliză α-incompletă, de culoare verde datorită
reducerii Hemoglobinei la Methemoglobină
Bilă Optochin Inulină Esculină
S. de grup viridans Rezistent Rezistent - -
Enterococi* Rezistent Rezistent - +
Pneumococi Sensibil Sensibil + -
Notă: * Enterococii pot fi nehemolitici.
Descompunerea Inulinei, Esculinei, Rafinozei se realizează pe

mediul HISS.
Pneumococii dau colonii ”S”, ”R” sau ”M”verzui.
Identificarea Streptococul :-reacţia oxidazei (-), catalazei (-)
-testul la bacitracină: este un test de screening

pentru diferenţierea streptococilor β-hemolitici de grup A faţă de celelate
grupe (B,C,D etc.). Tehnica constăîn obţinerea unei culturi în pânză(cultura
pură) apoi fixarea unui comprimat de bacitracină. Citirea se face după 24 de
ore de incubare. Dacă zona de inhibare a creşterii este ≥ 10mm sunt
streptococi grup A, dacă cultura creşte pânăîn dreptul discului avem
streptococi B, C, D dacă reacţia nu este foarte sigură se face şi identificarea
Ag-nică.
-reacţia de coaglutinareeste o seroidentificare

necesită o trusă Streptic care conţine reactivi pentru streptococii de grup
A,B,C,D,preparat suspensie bacteriana. Tehnica suspensia se obţine din
câteva colonii prelevate de pe bulin glucozat, la care se adugă extract
pancreatic din trusa cu rol de liză a peretelui bacterian eliberând Ag
(carbohidratul de grup) şi incubarea la 370C. Reactivii conţin seruri
antistreptococice de grup A,B,C,D,G,F (conţin IgG). Pe o lamă se pune câte o
picătură de ser aparţinând grupurilor peste care se pune câte o picătură de

suspensie. Se roteşte lama pentru un mai bun contact, acolo unde s-a
realizat reacţia Ag-Ac apar grunjii de precipitare, iar picătura devine limpede,
unde nu, picătura rămâne opalescentă (Fig. 6. 4.)
Fig. 6.4.a.- trusa Streptic Fig. 6. 4.b.- Reactie
(+) la 3 şi (-) la 6
Pneumococ :-reacţia oxidazei (-), catalazei (-)
- Diagnostic diferenţial cu St. viridans:

-Eliberează enzime proteloitice, în culturile vechi se
produce clarificarea mediului-Autoliză
-Testul la sărurile biliare = biloliza; culturile în
mediu lichid + o picătură de bilă de bou (conţine săruri biliare), după
incubare mediul se clarifică. Pentru pneumococ bila are caracter
bactericid.
-Testul la optochim similar ca tehnică cu testul la
bacitracină. După incubare dacă diametrul zonei de inhibitie ≥20mm
cultura este de pneumococ, dacă creşte pânăîn dreptul discului cultura
este cu St. viridans.
- Identificarea antigenică prin evidenţierea
polizaharidelor capsulare de tip:
a. reacţia de umflarea a capsulei: pe o lamă se pun o picătură de
culturăîn ser fiziologic, o picătură ser specific, o picătură albastru de
metilen. Se examinează intre lamăşi lamelă. Reacţia Ag-Ac între
polizaharidele capsulare şi Ac antipolizaharide se observă microscopic ca
o capsulă mult mărită.
b. reacţia de coaglutinare:pe o lamă se pune o picătură de ser
antipneumococ + soluţia lizată de pneumococ. Daca reacţia este pozitivă
se produce complexul Ag-Ac.
După identificare se realizează antibiograma.
Streptococul de grup A: şi-a păstrat sensibilitatea faţă de penicilină –

nu se efectuează antibiogramă (numai în situaţii speciale, de exemplu
alergie la penicilină).
Reacţia indirectă prin evidenţierea Ac:
- Streptolizina “O” = SLO= Ag  determină formarea de Ac anti-SLO =

ASLO
Val < 1/200 UI/ml  nu există infecţie streptococică
Val > 1/200 UI/ml  este infecţie streptococică în evoluţie.
6.2. Diagnosticul de laborator în infecțiile produse de cocii Gram-

negativi de genul Neisseria
Cuprinde mai multe genuri dar numai 2 vor fi luate în discuţie: genul N.
gonorrhoeae – Gonococul şi N. meningitides-Meningococul.
Recoltarea produselor patologice:
- LCR- în cazul infecţiei cu meningococ se face prin puncţie lombară. Se

recoltează cu seringa sterilă iar produsul se transportă imediat la
laborator la temperatura de 370C.
- Recoltarea secreţiilor nazale pentru a pune în evidenţă meningococul.
- Secreţia uretrală la bărbat apărută ca urmare a uretritei gonococice.
Recoltarea se face dimineaţa înainte de prima micţiune, dupăce în
prealabil pacientul a consumat un pahar de alcool tare înainte de culcare.
Secreţia uretralăare aspect purulent de culoare verde fosforescent,
recoltarea se face cu ansa sau cu tamponul. Transportul se face
imediat,la 370C, în microaerofilie.
- La femei se recoltează secreţia vaginalăîn urma gonoreei localizată
endocervical. Recoltarea se face pe masa ginecologică din fund de sac
vaginal între a 5-9 –a zi a ciclului.
Examenul direct al produsului patologic:
-macroscopic:- secreţia uretrală este verde fosforescentă,
-secreţia vaginală este purulentă,
-LCR-ul tulbure opalescent cu turbidităţi diferite în funcţie de

stadiul infecţiei.
-microscopic: ambele genuri sunt coci G(-), dispuşi in diplo, reniformi,

imobili, înconjuraţi de o structură capsulară comună. Se grupeazăşi în
grămezi de diplo.
Pe frotiul din LCR se observă polimorfo nucleare (PMN) care sunt celule
inflamatorii şi coci renifomi dispuşi în diplo, capsulaţi intra şi/sau
extracelulari.
Examinarea frotiului din secreţia uretralăşi vaginală, pune diagnosticul,

fiind prezente celulele inflamatorii, PMN, dar şi cocii reniformi dispuşi in diplo
capsulaţi. (Fig. 6. 6.)
Fig. 6. 6.Frotiu colorat

albastru de
metilen, coci reniformi

dispuşi in diplo
capsulaţi intra şi extra

celulari.(foto C.Defta)
Însămânţarea: se face pe medii complexe în microaerofilie (3-
5%CO2), la 370C.
Mediile sunt: Müller-Hinton cu adaos de colistin, vancomicină, nistatin şi

trimetoprim.
Gelozăchocolat, geloză sânge
Nu cresc pe medii simple sau lichide.
Identificarea
Macroscopică: coloniile - apar după 24-48 de ore;
- de tip ”S” de 1-2 mm (meningococul), 0,5-1mm

(gonococul) sau ”M”.
Microscopică: coci G (-) in diplo înconjuraţi de o structură capsulară comună
Biochimică: - oxidazo (+)este test cheie în identificare, catalazo (+);
- Fermentează zaharurile: glucoza ambii, maltoza numai

meningococul,
- Nu fermentează lactoza, fructoza, zaharoza.
- În funcţie de structura capsulei există mai multe serogrupuri se

face printr-o reacţie de identificare antigenică de tip aglutinare. În cazul
meingococcului avem serogrupele A,B, C, Y, sau W-135.Iar în cazul
gonococului identificarea se face cu ser antigonococ de iepure.
Antibiograma este obligatorie pentru ambele genuri
7.1. Diagnosticul de laborator în infecțiile produse de spirochete
(Treponema pallidum, treponemele
bucale)
Treponema pallidum subspecia pallidum este agentul etiologic al

sifilisului. Trăsătura caracteristică a treponemelor este prezența a 10 - 20
de spire principale. Treponemele pot evidențiate prin microscopie în câmp
întunecat. Aceste bacterii nu pot fi cultivate pe medii de cultură. Sifilisul este
o boală specifică omului. Agentul patogen se transmite prin contact direct, în
majoritatea cazurilor prin contact sexual. Microorganismele invadează
țesutul conjunctiv adiacent prin intermediul microtraumatismelor de la
nivelul tegumentelor și mucoaselor. Boala evoluează în stadii diferite
denumite sifilis primar, secundar și terțiar sau stadiile 1, 2 și 3.
Stadiul 1 se caracterizează prin șancrul dur, nedureros și limfadenita

locală. Diseminarea conduce la stadiul 2 caracterizat prin limfadenopatie
generalizată precum și exantem și enantem generalizat. Stadiul 3 este
caracterizat de prezența neurosifilisului, sifilisului cardiovascular și gomelor
sifilitice. În stadiile 1 și 2 agentul patogen de la nivelul leziunilor poate fi
vizualizat în microscopie în câmp întunecat. Testele serologice care pun în
evidență prezența răspunsului imun din partea gazdei sunt VDRL, TPHA și
testul de imunofluorescență indirectă FTA-ABS.
Tratamentul de elecție este penicilina.
Morfologie
Aceste microorganisme sunt bacterii subțiri, cu dimensiuni de 0,2 μm

lățime și 5-15 μm lungime.
Se caracterizează prin prezența a 10-20 de spire principale, iar

motilitatea se realizează prin rotația în jurul propriului ax. Datorită formei
foarte subțiri sunt greu de vizualizat prin colorare. Pot fi observate in vivo la
microscopia în câmp întunecat. Cultivarea in vitro nu a putut fi realizată.
Patogenie și aspect clinic
Sifilisul este o boală specific umană. Se transmite de obicei prin

contact sexual. Infecția apare ca urmare a contactului direct cu leziunile
infectante ce conțin treponeme. Perioada de incubație este de 2-4
săptămâni. Netratată boala se manifestă în mai multe stadii.
Stadiul 1 – leziuni dure, nedureroase, ulterior infiltrative și ulcerate

numite șancru dur. Aceste leziuni conțin un lichid clar care este bogat în
treponeme, fiind descris ca ”apa de stâncă”. Se acompaniază cu limfadenită
regională nedureroasă. Șancrul se vindecă spontan.
Stadiul 2 – infecția se generalizează după 4-8 săptămâni de la sifilisul

primar. Simptomele clinice întâlnite cuprind limfadenopatie generalizată,
exantem macular sau papuloscuamos, condiloame late și enantem.
Sifilisul latent – stadiul în care simptomele sunt absente, dar agentul

etiologic este prezent în organism, iar testele de detecție a anticorpilor
specifici sunt pozitive. Acest stadiu se împarte în sifilis latent precoce (mai
puțin de 4 ani) și sifilis latent tardiv (peste 4 ani).
Sifilisul terțiar (stadiul 3)– stadiul de gome sifilitice ce apar la nivelul

tegumentelor, mucoaselor și în diferite organe. Leziunile sunt slab infectante
sau neinfectante. Sifilisul cardiovascular se manifestă prin arteriopatie
obliterantă și aortită sifilitică, neurosifilisul se caracterizează prin sifilisul
meningovascular și sifilisul parenchimatos.
Transmiterea treponemelor de la mamă la făt după luna a 4-a de

gestație conduce la apariția sifilisului congenital caracterizat prin avort
spontan sau multiple afectări de organe la fetus. Infecția în primul semestru
de sarcină este incompatibilă cu viața.
Diagnosticul de laborator include atât izolarea și identificarea agentului

patogen, cât și teste serologice.
Identificarea agentului patogen
Se poate indentifica în lichidul din șancrul primar, din secrețiile

leziunilor exudative din stadiul 2 sau prin biopsia ganglionilor limfatici.
Metodele utilizate sunt microscopia în câmp întunecat și imunofluorescență
directă. Punerea în evidență a agentului patogen are valoare de diagnostic.
Tehnica în cazul şancrului primar, se îndepărtează crusta de deasupra

leziunii iar cu ansa, sau cu o pipetă Pasteur se recoltează din profunzimea
leziunii, deorece este strict anaerobă. Se efectuează un preparat
lamă/lamelă care se observa la microscopul cu fond întunecat. Unde se
urmărtesc mişcările caracteristice de flexie caracteristică treponemelor
patogene, de rotaţie axială, de pendulare şi de translaţie.Pe frotiul colorat
Giemsa sau cu săruri argentice Fontana –Tribandeu, apare ca o formă
helicoidalăcu spire strânse şi regulate, cu lungime de 5-15 μm şi lăţime de
0,5μmşi cu 3 flageli polari.
Testele serologice
Se efectuazăîn stadiul secundar şi terţiar al infecţiei.
1. Teste cu Ag cardiolipinic –VDRL, RFC

2. Teste cu Ag treponemic –Imunofluorescenţa şi testul de imobilizare
al treponemelor
1. Teste cu Ag cardiolipinic utilizeză ca antigen extracte lipidice
nespecifice treponemei = extracte alcoolice din ţesutul animal.
Cardiolipina este un extract alcoolic purificat din muşchi de cord de
bou (cel mai frecvent utilizat), adsorbit pe cristale de colesterol. Se
depistează Ac-ul din serul bolnavului.
a. VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) este un test serologic
în care antigenul este cardiolipina, iar reacția este de aglutinare.
Acest test este pretabil la rezultate false pentru că se folosește un
antigen nespecific.
Tehnică: Se pun la temperatura camerei în placa cu godeuri 0,05 ml
ser inactivat (fără complement) şi o picătură de Ag. Se roteşte placa
cu un agitator la 180rot/ minut timp de 4 de minute. Se citeşte imediat
pe un fond negru cu ajutorul unei lupe începând cu martorii (negativ,
pozitiv, martor de Ag, martor slab pozitiv). Rezultatele se dau sub
forma de „+”:
+ flocoane mici, lichidul puţin clarificat
++ flocoane evidente
+++ şi ++++ flocoane mari în lichid clar
- absenţa flocoanelor, lichidul opalescent.
b. RFC. Reacţia Bordet –Wasserman (vezi reacţia Ag-Ac de

diagnostic)
2. Teste în care se folosesc antigene treponemice

a. TPHA (Treponema Pallidum hemagglutianation assay) este un test
în care se folosește antigen specific treponemic obținut prin tratarea
unei culturi celulare de treponeme cu ultrasunete.
Testul de imunofluorescență (FTA-ABS). Antigenul este obținut din
treponeme, iar anticorpul de captură este marcat fluorescent.
b. Testul de imunofluorescenţă,este o reacţie indirectă, Ag este o
treponemă patogena Nichols. Astfel, se pun în contact Ag cu Ac-ul
(serul de la pacient) şi Ac marcat cu o substanţă fluorescentă.
Preparatul obţinut se observă la microscopul cu fluorescenţă.
c. Testul de imobilizare al treponemei, se examinează la microscop un
preparat nativ în care sunt puse,în contact suspensii de treponeme
vii, ser diluat de la pacient, complement seric. În prezenţa Ac
antitreponema palidum şia Cs mai mult de de 50% din treponeme
îşi pierd mobilitatea. Fenomenul este urmărit la microscopul cu fond
întunecat.
Testele serologice pot fi folosite după cum urmează:
Screening: VDRL
Diagnostic primar: VDRL, TPHA și FTA-ABS
Diagnostic special: VDRL cantitativ, FTA-ABS
Succesul terapeutic poate fi monitorizat cu ajutorul VDRL cantitativ. O

scădere în titrul anticorpilor indică un tratament eficient efectuat.
În cavitatea orală se găsesc o multitudine de specii treponemice:

Treponema denticola, Treponema sockranskii, Treponeama pectinovorum,
Treponema vincentii, Treponema medium, Treponema maltophilum,
Treponema putidum. Acestea par a fi implicate în patogenia și progresia bolii
parodontale, în asociere cu alte bacterii. Din păcate aceste treponeme sunt
foarte greu de cultivat întrucât sunt strict anaerobe. În ultima vreme,
datorită dezvoltării tehnicilor moleculare de diagnostic, identificarea acestora
se poate realiza la pacienții cu afectare parodontală(Fig. 7.1.).
Fig. 7.1.Frotiu gram din punga parodontala,
sageata indica treponemele orale (foto C. Defta)
7.2. Mycobacterium tuberculosis (BK): schema diagnosticului de

laborator în tuberculoză
Mycobacterium tuberculosis (BK) reprezintă agentul etiologic al

tuberculozei (TBC). Principala localizare atuberculozei este pulmonară,dar
poate fi întălnităşi în alte zone ale corpului:renală, digestive, la nivelul SNC,
etc.
Recoltarea şi transporul produselor patologice:
Principalul produs patologic îl reprezintă sputa. Aceasta se recoltează de la

pacienţii care expectorează, dimineţa la prima oră după igiena bucală. În
cazul pacienţilor care nu expectorează se fac spălături laringotraheale cu ser
fiziologic,recoltarea se face în plăci Petri sterile în ambele cazuri.
La copii deoarece aceştia au tendinţa de a-şi înghiţii sputa se recoltează

materiile fecale (în coprocultoare) şi lichidul de spălătură gastrică (în plăci
Petrii).
În cazul TBC-lui urogenital se recoltează urină timp de 24 de ore, spermă,

sânge menstrual în recipiente cu capac sterile. În cazul urinii recipientele de
recoltare se ţin la frigider între micţiuni.
În TBC-ul seroaselor (pleurezis, peritonită) se recoltează exudatele din
puncţii în eprubete sterile.
În meningita tuberculoasă se recoltează LCR prin puncţie lombară în

eprubete sterile.
Examenul direct de laborator:
Macroscopic: se pune recipientul cu sputa pe un fond întunecat pentru

aprecierea, aspectului, consistenţei, culorii, prezenţei altor formaţiuni. LCR,
urină estimarea turbidităţii şi a altor formaţiuni prezente.
Microscopic : Pentru realizarea frotiurilor din spută aceasta trebuie

omogenizatăcu Na OH 4%,urmată de neutralizarea cu tampon fosfat pH 6,8.
Examinarea include realizarea urmatoarelor tipuri de frotiuri:
- AM- pentru aprecierea generală aelementelor;

- Gram-pentru flora microbiană de asociaţie;
- MGG-pentru citologie în TBC predomină
limfocitele;
- Z-N- pentru punerea în evidenţă a BK care
apare sub forma unor bacili subţiri, de
lungime variabilă, drepţi uşor încurbaţi sub
formă de corzi. Pe frotiu apar izolaţi sau
grupaţi dând aspect de litere în unghiuri
(N,X,V). Pe frotiu toate celelalte elemente
sunt colorate în albastru(Fig. 7.2.)
Fig. 7.2.BK: frotiu din sputăcolorat Z-N, bacili

subţiri asezaţi în
corzi coloraţi în roşu.(foto C.Defta)

În cazul urinii se face centrifugarea iar frotiul se execută din sediment,
prezenţa a unui singur bacil are valoare de diagnostic.
Însământarea şi cultivarea:
Mediile folosite sunt: - Löwenstein-Jensen, mediu solid pe bază de gălbenus

de ou;
- Baird - Parker mediu pe bază de agar şi gălbenuş de ou;
- Agar cu piruvat, telurit şi gălbenuş;
La aceste medii se adaugă verde malachit care inhibă flora de asociaţie.

Incubarea se face în atmosferă de CO2, 8-10%,la 370C. BK are o creştere
foarte lentă având o rată de diviziune de 12-27 de ore iar colonia este
prezentăîn 2-4 săptămâni.
Identificarea:
Macroscopicăa culturii, colonia are câţiva mm, de tip R conopidiformă foarte

caracteristică de culoare galbuie. Pe mediu lichid creşte numai la suprafaţă
mediului,acesta rămân limpede, dă un val care cuprinde treptat toată
suprafaţa, se ridică puţin pe pereţi, se îngroaţăşi se pliseză, fiind o forma de
creştere caracteristică.
Microscopic: bacili subțiri roșii dispuși sub forma de corzi.
Biochimic: -reduce nitratul la nitriţi
- testul catalazei la 220C şi dupăîncălzire la 680C sunt pozitive
- ureazo(+)
-testul producerii de niacin

Teste de patogenitate, în urma testăriipe animalelor de laborator determină
moartea acestora (2-3 luni): cobai, iepure.
Antibiograma: poate fi făcută direct sau după cultivare:
-Directă când la examenul microscopic se observă un număr foarte mare de

germeni.
-Din suspensie realizată din culturile de pe mediul Löwenstain.
Diagnosticul indirect de laborator –Imunologic este IDR (intra dermo-

reacţia) cu PPD (produs proteic preparat din tuberculina). După injectare se
face citirea zonei la 72 de ore, dacă diametrul zonei este mai mare de 10mm
se impune o radiografie, dacă diametrul are 9mmnecesară vaccinarea fiind o
reacţie (+) se caracterizeză prin eritem, induraţie, rară necroză sau
ulceraţie. La persoanele neimunizate reacţia este (-), pentru a confirma
rezultatul negative înainte de a decide vaccinarea se repeta IDR cu 10UI/0,1
la 15 zile de la prima testare,dacăşi acesta este negativăse revaccinează cu
BCG (bacil viu cu virulenţă atenuată care dă microinfecţii urmată de
imunizare).
7. Diagnosticul de laborator în infecțiile produse de bacilii Gram-

negativi- Fam.Enterobacteriaceae
Cuprinde organismele patogene pentru om cum ar fi: Salmonella,
Shigella, Yersinia şi condiţionat patogene Esherichia colii (E. coli), Proteus,
Klebsiella.
Enterobacteriile sunt definite ca o grupare de bacili G(-), mobile sau
imobili(Klebsiella, Shigella, Yersinia la 370C), aerobeşi facultativanaerobe,
nesporulate, necapsulate (exceptie Klebsiellain vivo)
Metabolismul este de tip respirator (aerob) şi fermentative (facultative

anaerob)producând acid din glucoză sau alte zaharuri, cu producere sau nu
de gaz. Majoritatea sunt catalazo(+), oxidazo (+), reduce nitraţii la nitriti.
Mobilitatea datorată cililor peritrihi.
Invazivitatea este o caracteristică a tupinilor de Proteusşi Klebsiella.

Este inhibată de anumite substanţe tensioactive(acizii biliari, detergent)şi
coloranţi (verde brilliant, cristal violet).
8.1. Diagnosticul de laborator în infecţiile cu E.coli
E. coli cuprinde tulpini condiţionat patogene(saprofite) şi patogene

(E.coli enteropatogena, E. coli enterohemoragica, E. coli enterotoxigena,
E.coli enteroinvaziv, etc.)
Recoltarea şi transportul produselor patogene:
-Materiile fecale (în coprocultoare cu mediu de transport ex. Blair)se

recoltează din mai multe zone şi porţiuniedificatoare;
- Lichid de vărsătură (în plăcii Petrii sterile);
-Urina în urocultoare dimineaţa după toaletarea zonei, se recoltează

jetul mijlociu.
Transportul se face în maxim 2 ore de la recoltare, la temperatura

camerei.
Examenul direct de laborator:

Macroscopic: - materiile fecale pot avea urme de mucus, uneori
sanghinolente, cu lambouri de mucoasă epitelială,
- urina este tulbure opalescentăcu sediment şi cu miros de varză acră,

uneori pot fi prezente şi urme sanghinolente.
Microscopic: Pe frotiul colorat Gram se observă prezenţa bacililor subţiri cu

capete rotunjite G (-), leucocitePMN, celule EK de diferite tipuri, mucus,
resturi obşinute din digestie. Pe frotiul din sedimentul urinar se observă
bacilii, celule inflamatorii PMN-urile.
În practica curentă se fac şi frotiuri native lama/lamelă pentru a observa

hematiile şi PMN-le.
Însămânţarea:
Se face pe medii slab selective MacConkey (conţine săruri biliare

şicristal violet) şi ADCL (agar, dezoxicolat, citrate, lactoza) şi pe Geloză
sânge.
În cazul urinii se face o urocultură cantitativă (nr. de bacteria /ml de

urină). Se însământează astfel 0,1 ml urină diluată (diluţie de 1/1000),
incubăm după apariţia coloniilor se numără, se înmulţesc cu 10 şi cu 1000
pentru a afla numărul de bacterii /ml. Astfel dacă numărul de bacterii /ml
este mai mare de 100.000 urocultura este pozitivă. Dacă numărul de colonii
este mai mic de 10.000 sau absent rezultatul este negativ. Dacă rezultatul
este pozitiv se trece la etapa de identificare şi respectiv antibiogramă.
Identificarea:
Macroscopic: coloniile nepatogene sunt mari, de culoare roză pe mediul

MacConkey şi galbene pe ADCL.
Tulpinile patogene sunt mari şi incolore, iar pe geloza sânge sunt mari de
culoare gri închis şi dau hemoliza de tip β.
Microscopic: bacili subţiri capete rotunjite dispuşi aleator pe toată suprafata

(Fig. 8.1.)
Fig. 8.1. Frotiu colorat Gram, bacili

G(-) dispuşi
aleator (foto C.Defta)
Biochimic:se fac pe mediile de identificare TSI, MILF, MIU, sau în galeriile de

identificare a testului ID (Bio Meriux)
- fermentează glucoza cu producere de gaz;în mediu lichid vizualizat prin

deplasarea tuburilor Durham.
- tulpinile nepatogene sunt lactozo (+), cele patogene sunt lactozo (-);
- nu produc hidrogen sulfurat,pot produce indol, ureazo (+)și sunt mobile.
Teste de identificare antigenica prin reacţii de aglutinare sau latex aglutinare

(vezi reacţia Ag-Ac).
Antibiogramaobligatorie.
8.2. Diagnosticul de laborator în infecţia cu Klebsiella

Recoltarea și transporul produselor patologice
-Alimentele responsabile de toxinfecţiile alimentare(TIA) de tip infecţios,

produsul patologic se
recolteazăîntr-un recipient steril cu capac.
-În infecţiile urinare se recoltează urină (în urocultoare şi în condiţiile

prezentate anterior).
-În infecţiile tractului respirator se recoltează sputa (în plăci Petri)
Examenul direct de laborator
Macroscopic:Urina este tulbure opalescentă, sputa este mucoidă de culoare

roşu închis “în jeleu de coacăze”.
Microscopic: pe frotiul gram se observă bacilul G(-) sub formă de pişcot cu

capsulă, prezenţa celulelor inflamatorii PMN, macrofage, celule EK.
Însământarea
Pe MacConkey, pe medii obişnuite, pe geloza sânge, incubarea se face la

370C timp de 28 de ore.
Identificare
Macroscopică: colonii mari 2-3mm la 24 de ore peste 4mm la 48 de ore, de

tip M, bombate,lucioase, vâscoase, cu aspect de curgere pe mediu, extreme
de aderente, cremoase de culoare gri pe mediu geloză sânge.
Microscopică:bacili subțiri asemănători unui pişcot cu capete rotunjite G (-).
Biochimică: -degradează glucoza cu producere de gaz, lactozo (+), nu

produce H2S,ureazo (+), indol(-), citrat (+), citratul este unica sursă de
carbon.
- Teste de identificare antigenice: aglutinarea pe lamă, latex
aglutinarea
- Testarea sensibilitatii la bacteriofagi.
Antibiogramaobligatorie
8.3. Diagnosticul de laborator în infecţia cu Proteus
Recoltarea și transporul produselor patologice:
- În infecţiile urinare produsul patologic esteurina(recoltatăîn urocultoreşi în

condiţiile discutate anterior),
transportul se face în maxim 30’ de la recoltare;
- În TIA produsul patologic sunt alimentele şi materiile fecale.
- În infecţiile nosocomiale produsul patologic este recoltat în funcţie de

sediul infecţiei în condiţiile
corespunzătoare.
Macroscopic: urina este tulbure, purulentă cu miros fetid.
Microscopic:edificator este frotiul lamă-lamelăîn care se observă mişcările

active ale bacteriei. Pe frotiul gram prezintă fenomenul de polimorfismde la
bacili, cocobacili la forme filamentoase, PMN-re, celule EK.
Însământarea
Se face pe medii simple de cultură.
Identificare
Macroscopică: Colonia prezintă fenomenul de invazie în valuri concentrice,
succesive cuprinzând întreaga suprafaţăîn 24-48 de ore, prezintăşi
fenomenul de căţărare.În cazul a două tulpini diferite însămânţate pe aceiaşi
placă ele creează linia de demarcaţie.
Microscopică:bacili subţiri poliformi G(-) cu capete rotunjite așezaţi oarecum

haotic (Fig. 8.2).
Biochimică: lactozo (-), glucozo (+), produc H2S, mobile, ureazo(+), citrate
(+) se pot dezvoltă având citratul ca unică sursă de C.
Antibiograma obligatorie
Fig. 8.2. Frotiu din cultură,colorat

Gram prezentand bacili G(-) de
dimensiuni diferite.(foto C.Defta)
8.4. Diagnosticul de laborator în infecţia cu Salmonella
Produce TIA (salmonelozele minore) când diagnosticul este bacteriologic iar

în febra tifoidă (salmonelozele majore)diagnosticul este atât bacteriologic cât
şi serologic.
-Materiile fecale în TIA, în febra tifoidă, în cazul purtătorilor sănătoşi se pot

recolta materiile fecale a doua zi după administrarea în timpul serii a unui
purgativ (sare Epson).
-Sângele în febra tifoidă în prima săptămâna de boală.

-Secreţia biliară în febra tifoidă după prima săptămână de boală şi în cazul
purtătorilor sănătoşi obţinută prin tubaj duodenal.
-Transportul cu medii de transport maxim 2 ore la temperature camerei.

Sângele se transport în tuburi sterile,în maxim 30 ‘.
Microscopic:bacili subţiri cu capete rotunjite G(-), cu cili peritrichi,

necapsulaţi, PMN, celule EK.
Însământarea
Pe medii lichide de îmbogăţire (bulion selenit), pe medii solide selective

MacConkey şi ADCL.
Incubare la 18-24 de ore la 35-370C.
Identificare
Macroscopică: colonii de tip S necolorate pe MacConkey, pe ADCL sunt

necolorate cu sau fără mijlocul negru.
Microscopică:bacili subţiri cu capete rotunjite G (-).
Biochimică: lactozo(-), produce H2S, utilizeză citratul ca unică sursă de C,

glucozo(+) cu producere de gaz.
Diagnosticul serologic. Vezi Reacția Widal de la reacţia Ag-Ac.
8.5. Diagnosticul de laborator în infecţia cu Shigella

În genul Shigella există 4 subgrupe: A are 13 serotipuri, B are 6 serotipuri, C
cu 18 serotipuri, D un serotip. Diagnosticul este direct şi trebuie pus rapid.
- Produsele alimentarese recoltează în TIA de tip infecţios;
- Materiile fecale după apariţia dizenteriei ca urmare a ingestiei a unui număr

de 10-100 bacterii. Transportul se face de urgenţă pe mediu Cary-Blair
Macroscopic: materiile fecale prezintă mucus, sânge, puroi.
Microscopic: bacili G(-) subţiri cu capete rotunjite, numeroase PMN-uri iar

dacă PMN sunt în procent de 70% alături de hematii acesta constituie
aspectul sugestiv pentru dizenteria bacteriană.
Însământarea
Se face pe medii moderat selective ADCL şi MacConkey, incubare 24 de ore

la 370C.
Identificare
Macroscopică:colonii de tip S mici

transparente rourate cu miros caracteristic.
Microscopică:bacili G(-) (Fig. 8.3.)
Fig 8.3. Frotiu din cultura colorat gram, cu

bacili mici subţiri G(-)
(foto C.Defta).
Biochimică:lactozo(-), aerobi şi facultative anaerobi, glucozo(+) fără

producer de gaz. Subgrupul A este manito(-), restul subgrupelor sunt manito
(+), nu produc H2S, ureazo (-), indol (-).
Teste de identificareantigenic se utilizeaza reacția de aglutinare pe lamă, cu

seruri polivalente anti-subgrup
Antibiogramaeste obligatorie
8.6. Diagnosticul de laborator în infecţia cu Yersinia
Prezintă mai multe specii dar patogene pentru om sunt: Y.enterocolitica, Y.

pestis (agentul etiologic al ciumei), Y. pseudotuberculosis
Materiile fecale se foloseşte mediul de transport Cary-Blair
Microscopic:bacili sau cocobacili G(-) coloraţi bipolari, prezintă pleomorfism,

prezintă PMN şi celule EK
Însământarea
Se efectuază pe medii selective MacConkey, ADCL şi CIN. Incubând la

temperatura camerei (22-290C)
Identificare
Macroscopică: colonii de tip S, 1-1,5 mm sau 2-3 mmla 48 de ore,
transparente
Microscopică:bacili sau cocobacili G (-), pleomorfi.
Biochimică:lactozo (-), glucozo (+) fără producere de gaz, nu produce H2S,

imobili la 370C și mobile la 220C,
indol(-), ureazo (+).
Testul de identificare antigenic utilizeză serurile specific anti-Yersinia
Antibiogramaobligatorie.
LUCRAREA PRACTICĂ9
9.1. Diagnosticul de laborator în infecțiile produse bacilii Gram-

pozitivi.
Bacilii gram pozitivi pot fi aerobi, genul Bacillus sau anaerobi, genul
Clostridium
9.1.1 Diagnosticul de laborator în infecţia cu Bacillus anthracis
Genul Bacillus prezintă mai multe specii, dar cele implicate în patologia
umană sunt B. anthracis, B. cereus şi B. subtilis.
Recoltarea şi transpotul produselor patologice
Se face în funcţie de forma de boală:
-Exsudat vezicular este produsul patologic înforma cutanată.La locul de

inoculare apare o veziculă cu lichid sero-sanghinolentcare ulcerează cucrustă
neagră,la periferie apar vezicule care diseminează–regiunea subiacentă
leziunii prezintă edem gelatinos nedureros de unde se recoltează lichidulde
edem, un alt produs patologic;
-În formă sistemică apare localizarea pulmonarăde unde se recoltează

sputa;
-Localizarea digestivă- enterocolita rară la om podusul patologic fiind materii

fecale;
-În cazul localizăriimeningeală,mai rar se recoltează LCR,cu sau fără

septicemieiar produsul patologic este sângele.
-Fragmente de organe (în diagnosticul retrospectiv): ficat, splină, piele.
Microscopic: Frotiuri colorate AM sau Gram unde B. anthracis apare sub

formă de bacili groşi cu capete retezate, dispuşiîn lanţuri acoperite de
capsulă.Pe frotiul Gram este G (+) cu PMN şi celule
EK specifice tesutului(Fig. 9.1.)
Fig 9.1. Frotiu din produs paologic, colorat gram cu

bacil G (+) dispuşi
in diplo sau lanţuri scurte(foto C.Defta)
Însămânţarea:
Se face pe medii simple: bulion simplu, geloza simplă, geloză sânge.

Incubarea se face în aerobiozaîntre 15-420C, optim la 370C.
Identificare:
Macroscopică: colonii de tip R, mari, 2-5 mm cu margini neregulate cu
prelungiri laterale ce seamănă cu “capul de meduză “ sau “coama de leu”.
Coloniile sunt nehemolitice.
Microscopică: bacili groşi cu capete drepte sau retezate dispuşi în lanţuri,

prezintă capsulă şi cu spor central care nu deformează bacteria.
Biochimică: catalazo (+), produce lecitinază, indol (-).
Teste de identificare antigenică prin IF direct (seroidentificare) se aplică

serul imun fluorescent anticapsular, după efectuarea preparatului se observa
la microscopul cu fluorescenţă.
Diagnostic serologicîn diagnosticul retroactiv reacţia Asscoli (vezi reacţia

Ag-Ac).
9.1.1 Diagnosticul de laborator in infectia cu Clostridii
Genul clostridiilor include mai multe specii care se găsesc în intestinul

animalelor şi care eliminate în mediul extern, sporulează.
Speciile patogene pentru om sunt Cl. tetani, Cl botulinum, Clostridium

perfringens care alături de Cl. septicum, Cl. histoliticum, Cl. sporogenes, Cl.
oedematiens sunt agenţii etilogici ai gangrenei gazoase.
Toți au capacitatea dea sintetiza o toxina difuzibilă.
Trecerea de la forma vegetativă la forma sporulată se face în prezenţa

oxigenului molecular.
Aceste bacterii sunt strict anaerobe.

Iar pentru cultivare sunt necesare condiții de anaerobioză. Se folosesc fie
cutii “Boxanaerob”recipiente mari, care se închid ermetic şi în care sunt
așezate plăcile Petrii însămânţate cu produse patologice. În aceste
cutiiînainte de închidere sunt introduse plicuri cu amestecuri reducătoare
care genereazăo atmosferă anearobă,datorită reacţiilor chimice
consumatoare de oxigen. Condiții de anerobioză pot fi obţinute şi în
termostate de anaerobioză care au ataşate butelii cu amestecuri de gaze
necesare menţinerii acestor condiţii.
Acest tip de diagnostic de laborator este dificil de realizat, costisitor şi

necesită personal calificat. În cazul infecţiilor cu clostridii diagnosticul de
laborator uneori poate fi tardiv, de aceea acesta are mai mult rol în
cercetare. Etapele diagnosticului pot fi următoarele
Recoltarea şi transportul produselor patologice
-Fragmente de ţesut necrozat şi secreţii de culoare închisă;
-Puroi cu sânge recoltat din plăgi, toate acestea pot fi însoțite de miros
neplăcut cadaveric sau putrid, transportul
seface în condiţii de anaerobioză în recipient special;
-Conserve alimentare;
-Probe din sol sau obiecte care au stat în sol.
Examenul direct de laborator este orientativ.
Toate clostridile sunt bacili G(+) cu sporul dispus diferit în funcţie de specia
care deformează bacteria.
Clostridium tetani e un bacil lung, subţire, cu spor dispus terminal, seamănă

cu un băt de chibrit.
Clostridium botulinum e un bacil mare, gros cu sporul dispus subterminal,

semănă cu o rachetă de tenis,
Clostridium perfringens eun bacil gros scurt drept, capete rotunjite, spor
subterminal.
Însămânţarea
Se face pe medii speciale: mediu lichid VF, geloză sânge cu neomicina
pentru condiţiile de anaerobioză. Incubarea se face 24-48 de ore la 35-370C.
Identificarea
Clostridium tetani
Macroscopicîn mediu lichid colonia are

aspect de puf de păpădie, iar mediul
miroase a corn ars, bacteriile sunt mobile.
Microscopic identic cu descrierea din

examenul direct de laborator (Fig. 9.2.)
Fig. 9.2. Frotiu din culturăcu bacili G (+)

cu spor terminal cu aspect de “băţ de
chibrit”(foto C.Defta)
Biochimic: lichefiază gelatina, nu fermentează nici un zahăr, indol+/-

,produce H2S.
Caractere de patogenitateîn cultură pură,produce mii de doze mortale/ml de

exotoxină tetanică. Exotoxina prezintă 2 fragmente: tetanolizina-hemolitică,
tetanospasmina cu tropism pentru SN, ambele sunt solubile, se
sintetizeazăîn anaerobiozăşi difuzează rapid.
Clostridium botulinum
Macroscopic colonii de tip S cu margini ondulate cu tendinţa de invadare a

mediului sunt mobile.
Microscopic identic cu descrierea de sus.

Biochimic: fermetează câteva zaharuri, indol (-), nu produce colagenază,
produce lecitinazăîn cantitate mai mică decâtCl. perfringens.
Caractere de patogenitate în cultură pură produce milioane de doze

mortale/ml. Există 6 subtipuri de Cl. botulinumce produc toxine diferite ca
proprietăţi, boala la om este dată de subtipul A mai frecvent în SUA şi
subtipul B mai frecvent în Europa.
Diagnosticul de laborator în botulism se bazează pe evidenţierea toxinei: a.

prin IF cu antiser marcat cu izocianat de fluoresceinăşi b. prin toxinotipie se
centrifugheazăalimentul incriminat din supernatant care conţine toxina A/B.
Se inoculează supernatantul la 6 şoareci, la 2 numai supernatant, la 2

supernatant şi serantibotulinic A, lotul 3 supernatant - ser antibotulinic B.
Interpretarea rezultatelor: moartea animalelor din lotul 1 şi 2-Toxina B,

moartea animalelor din lotul 1 şi 3 - Toxina A, supravieţuirea loturilor nu e
toxină botulinică.
Clostridium perfringens
Macroscopic colonii de tip S cu margini ondulate, însămânţat în profunzimea

mediului are aspect pufos, este imobil
Microscopic identic frotiucu descrierea de mai sus.
Biochimic fermentează toate zaharurile utilizate, produce; hialuronidază,

colagenază, hemolizină, lecitinazăîn cantitate mare. Caractere de
patogenitate exotoxina de tip special în cultură pură produce sute de doze
mortale /ml. Prezintă 6 tipuri de toxine notate cu litere mari,în care tipul A
este patogenă pentru om şi produce cantitatea cea mai mare de lecitinază,
celelalte tipuri sunt patogene pentru animale şi predomină alte enzime.
9.2. Diagnosticul de laborator în actinomicoza cervicofacială.
Actinomycoza cervico facial este o infecţie primară datoratăActinomyces

israelii şi A. naeslundi
Recoltarea produselor patologice
-Prin puncţie cu seringa sterilă din:-nodulii maxilari de culoare roşie, din

abcesele vestibulare;
- recoltarea lichidelor de evacuare sinusale;
-Recoltarea lichidului din şanțul crevicularîn parodontopatii cu vârfuri de

hârtie;
-Cu ace stomatologice se recolteaza probe din canalul rădăcinii.
Macroscopic: lichidul de puncţie are aspect cremos, gros, purulent uneori cu

urme sanghinolente.
Microscopic: pe frotiu apar ca bacili G(+) pleomorfi până la filamentoşi,

ramificaţi, nesporulaţi, neciliaţi, limfocite PMN, rare celule epiteliale.
Pe frotiul din lichidul sinusal, pe lăngă formele caracteristice se mai

observăşi “granulele de sulf”, mici formaţiuni din material galben în ţesut ce
sunt aglomerari de actinomycete.
Însămânţarea se face pe mediu Columbia cu vancomicină, mediu

Schaedler cu menadiona şi hemină, în condiţii de 5% CO2 darşi anaerobioză,
la 370C.
Identificarea
Macroscopică: Coloniile cresc foarte greu în minim 7 zile până la 21 de zile,

sunt colonii de tip R, aderente, care formează colonii fiice în jur.
Microscopic: identic cu frotiulapar ca bacili G (+) pleomorfi pana la

filamentosi, ramificati, nesporulati, neciliati
Biochimic identificarea se face cu teste rapide Api ID32 A.
Fig. 8.2. Exemplu de test rapid de identificare (foto C. Defta)
Antibiograma este obligatorie şi se efectuaeză tot în condiţii de anerobioză.
Pentru înţelegerea manierei de abordare a diagnosticului de laborator
în cazul paraziţilor este necesar să se cunoască date succinte legate de
morfologia parazitului şi localizare.
10. Diagnosticul de laborator în infestările produse de:
10.1. Entamoeba histolytica.

Clasificarea Amibelor se poate face după patogenitate în:
-amibe parazite, întotdeauna patogene, de ex. Entamoeba histolytica;
-amibe parazite, nepatogene sau condiţionat patogene, de ex. Entamoeba

gingivalis
Entamoeba histolyticase mai numeşte şi E. dysenteriae,are localizare

intestinală,este hematofagă. Fiind un parazit invaziv, pătrunde în ţesuturile
intestinale dar poate şi disemina extraintestinal pe calea sângelui.
Entamoeba histolytica provoacă amibioza sau dizenteria amibiană cu

anumite caracteristici care diferă de dizenteria bacteriană dată de Shigella.
Prezintă două forme de trofozoit şi de chist.
Sub formă de trofozoitare 20-30 μ, format dintr-o singură celulă, care

își modifică forma datorită pseudopodelor pe care le emite permanent cu
scop de mişcare şi hrănire.Citoplasma este structurată în ectoplasmă
(periferică) şi respectiv în endoplasmă
(situată în jurul nucleului), conţine
numeroase vacuole precum şi lizozomi.
Nucleul este sferic, excentric, înconjurat de o
membrană nucleară cu cariozom situat
central şi cromatină situată periferic (Fig.
10.1).
Fig.10.1.Entamoeba histolitica: 1-endoplasma granulară, 2- ectoplasma, 3-

vacuolă, 4-nucleu, 5-cariozom central, 6- cromatină periferică, 7-eritocit
fagocitat(desen C. Defta)
Forma de rezistenţă în mediul extern este reprezentată de chist şi are o
dimensiune de circa 8-20 μ, rotund cu un perete gros, refractil, conţine patru
nuclei. În citoplasmă prezintă baghete siderofile, sau corpii cromatoizi.
Chistul se formează în intestin atunci când condiţiile de supravieţuire nu sunt

prielnice. Infecţioşi sunt doar chiştii maturi, care conţin patru nuclei (Fig.
10.2).
Fig. 10.2.Chist de entamoeba histolitica: 1-

membrana chistică,
2-baghetă siderofilă, 3 - citoplasmă, 4 -

nucleu,
5 - cariozom central(desen C. Defta)
Diagnosticul poate fi direct sau indirect
Diagnosticul parazitologic direct constă în punerea în evidenţă a

parazitului sau chistului.
În amibioza intestinală se face examenul coproparazitologic cu frotiuri

umede lamă-lamelă, pentru punerea în evidenţă a trofozoiţilor şi în care se
remarcă atât dimensiunea, structura căt şi mişcarea parazitului.
Examenul coproparazitologic prin preparatele cu lugol lamă-lamelă sunt puse

în evidenţă şi chisturile.
Se pot realiza şi preparate colorate AM, Gram, Giemsa.

Prin metoda ELISA pot fi detectate coproantigenele de entamoeba.
Cultivarea se poate realize pe mediu Löffler modificat, urmat de examinarea

la microscop a frotiurilor lamă-lamelă.
Diagnostic imunologic sau indirect se face în cazul localizărilor

viscerale atunci când apar modificări ale probelor de laborator, spre exemplu
hemoleucograma evidenţiază leucocitoză, eozinofilie, neutrofilie iar în cazul
localizării hepatice amibioza este însoţită şi de citoliză hepatică cu
transaminaze crescute.
Se utilizează şi tehnici imagistice, radiologie şi ecografie în funcţie de

localizarea bolii, tomografia computerizată este necesară numai în anumite
situaţii.
10.2. Entamoeba gingivalis cunoscută şi ca E. bucalis
Amibă localizată la nivelul cavităţii bucale, face parte din microbiocenoza

cavităţii bucale fiind comensală, neinvazivă specifică omului.
Poate deveni patogenă în anumite condiţii, fie a unei igiene deficitare, fie ca
urmare a apariţiei cariilor, plăcii dentare, tartrului dentar la persoanele care
au diferite forme de parodontopatii sau în scăderea rezistenţei locale la
nivelul cavităţii bucale.
Din punct de vedere morfologic nu prezintă decât forma de trofozoit,

neexistând forma chistică. Trofozoitul are 10-30μ, ectoplasma este clară,
endoplasma este granulara şi conţine vacuole digestive cu leucocite, bacterii,
niciodată cu hematii, nucleul este sferic
ceva mai mic (Fig. 10.3).
Fig. 10.3. Trofozoitul de E. gingivalis: 1- nucleu, 2-cariozom , 3- 3-vacuolă
cu un PMN în interior, 4-PMN ,5-vacuole cu bacterii, 6- endoplasma
granulară,7-ectoplasma clara.(desen C. Defta)
Diagnosticul direct de laborator se realizează prin punerea în evidenţa a

parazitului din produsele patologice provenite de la pacienţi. Produsele
patologice pot fi: secreţia recoltată din şantul gingival, secreţia din şantul
parodontal profund, secreţia din alveola dentară, exudatul faringian, sputa.
În cazul acestui parazit se fac numai frotiuri umede lamă-lamelă în

care parazitul este în suspensie într-o soluţie de ser fiziologic pentru a-i
menţine viabilitatea şi a-i observa mobilitatea. Nu se fac frotiuri native
colorate cu lugol deoarece acesta conduce la distrugerea trofozoitului.
Frotiurile colorate se obţin prin tehnica MGG,prin aceasta sunt puse în

evidenţă atât amibele căt şi bacteriile existente în produsul patologic. Pentru
e se pune un diagnostic corect privind agentul etiologic implicat în afecţiunile
mai sus menţionate, se faceşi un diagnostic microbiologic.
Aceasta amiba poate fi cultivata pe mediul Löffler, iar ceea ce rezultă

în urma cultivării poate fi observat la microscop.
10.3. Giardia duodenalis sau G.lamblia
Este un parazit din categoria protozoarelor flagelate cavitare,

intestinale, unicelulare, se deplaseză datorită flagelilor. Prezintă două forme
de existenţă, trofozoitul şi chistul care reprezintă forma de rezistenţă în
mediul extern.
Trofozoitul are următorul aspect: o dimensiune de 10-20μ lungime şi
5-15 μ lăţime, este piriform cu o extremitate anterioară rotunjită, iar cealaltă
mai ascuţită. Seamănă cu o pară tăiată pe jumătate, de aceea privită din
profil are o latură plată iar cealalta este convexă. Forma vegetativă prezinta
patru perechi de flageli iar pe partea ventralã(plată) prezintă un disc adeziv
cu care adera la enterocit.
Discul adeziv ocupă 3/5
din faţa ventrală a
parazitului(Fig. 10.4.).
Fig. 10.4. Trofozoitul de

Giardia. 1- perechea de
flageli anteriori, 2- nucleu,
3-3 perechi de kinetosomi,
4- corpii mediani, 5- discul adeziv, 6 – citoplasma, 7-flagel posterior, 8-
flagel lateral, 9- flagel caudal, imaginea din dreapta este privire lateral (desen
C. Defta)
Forma de rezistență chistul este oval cu perete gros, lung de 11-14μ și

lat de 7-10μ, conține un număr par de nuclei (2 sau
4) care pot fi plasați fie la extremități fie grupați la
un cap.În zona mediană se observă niște structuri
lineare, flexuroase, care sunt flagelii și discul adeziv (Fig. 10.5.).
Fig. 10.5. Chistul de Giardia. 1- nucleul chistului, 2- flagel, 3-perete
chistic.(desen C. Defta)
Fig 10.6. Frotiu lama/lamela din pp., sageata indică

chistul de giardia
(foto C.Defta)
Diagnosticul în giardioză este direct şi se efectuează din următoarele

produse patologice, lichidul duodenal şi secreţie biliară obţinute prin tubaj
duodenal şi materiile fecale.
Examenul microscopic proaspăt (lamă-lamelă) preparat din lichidului

duodenal şi secreția biliară, pe aceste frotiuri pot fi observați trofozoiţi. Din
aceste produse patologice pot fi făcute şi frotiuri Giemsa.
Examenul coproparazitologic se face cu soluţie de ser fiziologic lamă-

lamelă în care se observă trofozoiţii, nu se folosesc preparatele cu Lugol
deoarece trofozoiţii sunt distruşi, în schimb pe aceste frotiuri se pot observa
uşor chiştii (Fig 10.6.).
În cazul rezultatelor negative, dar în prezenţa simptomatologiei
caracteristice acestei boli parazitare examenul se repetăde 4-5 ori în decurs
de 7-10 zile. În anumite situaţii examenul coproparazitologic este completat
prin examinarea frotiurilor colorate Giemsa sau hematoxilină-eozină.
Metoda indirectă de identificare specifică (fiind necesară o singură

determinare)este identificarea antigenică din produsul coproparazitologiccare
se face prin reacţia ELISA, contra-imuno-electroforeză,
imunofluorescenţă(IF) cu Ac marcaţi, punând în evidenţă coproantigenele.
Poatefi cultivată cu scop de cercetare pe mediul Löffler modificat.
În cazul acestei afecţiuni nu se constată modificări ale leucogramei, uneori

se remarcă o eozinofilie.
Imunodiagnosticul din sereste irelevant în cazul acestei afecţiuni.
Se recomandă repetarea examenului coproparazitologic la 7 zile după

tratament.
10.4. Trichomonas vaginalis.
Este un protozoar flagelat cavitar patogen urogenital, se prezintă

numai sub formă vegetativă, boala se numeste tricomoniază şi este o boală
cu transmitere sexuală.
T.vaginalis este piriform de 18-26μ cu citoplasmă granulară cu un

nucleu de dimensiuni mari care prezintă un cariozom situat central, anterior
în vecinătatea blefaroplaştilor din care pornesc 4 flageli polari (de dimensiuni
egale) şi un flagel recurent care dă naştere unei membrane ondulante pe
două treimi ale parazitului, cu rol în locomoţie la fel ca şi flagelii
liberi(Fig.10.7.).
Fig.10.7. Trofozoitul de T. vaginalis. 1-nucleu, 2-flageli
anteriori, 3- cost
\a, 4-membrana ondulanta, 5 –axostil, 6-axostil posterior,

7- filamentul parabazal, 8- grup de blefaroplasti, 9 –
corpusculi cromatici, 10- citoplasma(desen C. Defta).
Diagnosticul parazitologic constă în evidenţierea în secreţia vaginală şi

uretrală a T vaginalis.
Recoltarea secreţiei vaginale trebuie să îndeplinească următoarele
cerinţe: la 48 de ore de la ultimul contact sexual sau lavaj vaginal, în
primele zile postmenstruale, la 6-7 zile de la întreruperea unui tratament cu
antibiotice locale sau sistemice. Recoltarea se face din fund de sac vaginal cu
tamponul sau spatulă, iar dacă prelucrarea se face după 2-3 ore de la
recoltare se foloseşte mediu de transport format din ser fiziologic cu glucoză
5%.
Recoltarea secreţiei uretrale se face dimineaţa înainte de micţiunecu ajutorul
ansei sau tamponului steril de la nivelul meatului urinar, fără a se fi
adminstrat antibiotic înainte. Se poate folosi şi lichidul prostatic, spermatic
pentru evidenţierea parazituluiîn cazul transpotului se foloseşte acelaşi
mediu ca mai sus.
Examenul microscopic se face sub forma preparatelor lamă-lamelă pe care

se observă mişcările parazitului, se pot efectua cu preparate colorate
Giemsa. Produsele patologice sărace în paraziţi se pot cultiva pe mediul
Löeffler modificat cu amidon de orez, streptomicină, penicilină, pH 4-5.
Pentru un rezultat cât mai concludent se pot folosi concomitant examenul la
microscop însoţit de cultivare.
Pe frotiul Giemsa parazitul are citoplasmă bleu, nucleul este roşu violet,
flageliişi axostilul roşu carmin.
Imunoidentificarea prin detectarea Ag-nelor parazitare este o metodă

modernă şi sigură de diagnostic.
10.5. Trichomonas tenax sau T. bucalis
Este un protozoar localizat la nivel cavităţii bucale, apare ca făcând parte

din microbiocenoza cavităţii bucalespecifice omului. Se hrăneşte cu
microorganisme din biocenoza bucală, contaminarea de la un individ la altul
s-ar face prin picăturile de salivă, nu supravieţuieşte în
tractul intestinal sau vaginal.
- Aspecte morfologice este piriform de 5-12 µ,
posedă 4 flageli liberi şi un flagel recurent pe
marginea membranei ondulante, deține axostil
cost şi un nucleu(Fig 10.8.).
Fig. 10.8. Trichomonas denticola: 1- flageli liberi, 2- nucleu, 3- axostil, 4-
membrane ondulantă, 5-axostil posterior, 6-filament parabazal, 7-costa, 8-
grup de blefaroplaşti(desen C. Defta).
- A putut fi identificat în biofilmul dentar, în unele cavităti ale dinţilor

cariaţi, celulele necrozate şi criptele amigdaliene, nu a fost dovedită
implicarea directă în producerea biofilmului dentar sau tartrului şi nici
a cariilor sau în alte afecţiuni patologice orale.
- Cu toate acestea T. tenax(bucalis) este de regulă întâlnit la persoanele

care au o afecţiune patologică la nivelul cavităţii bucale sau în
proximitatea acestei cavităţi.La persoanele cu igienă deficitară se
remarcă prezenţa lui T. tenaxîn cavitatea bucală.
10.6.Toxoplasma gondii.
Face parte din clasa Sporozoare care prezintă următoarele

caracteristici:are capacitatea de a se reproduce atât asexuat (schizogonie)
cât şi sexuat (sporogonie).În urma multiplicării sexuate, rezultă oochistul
care dă naştere după maturare sporozoiţilor.Sporozoarele au o localizare
intracelularaîn cel puţin unul dintre stadiile evolutive.
Gazda definitivă adăposteşte sporogonia, iar gazda intermediară

adăposteşte schizogonia.Toxoplasma gondiiîn patologia umană ocupa un rol
important.
Se găseşte sub 3 forme:trofozoit, chist tisular şi oochist;primele două

forme se găsesc în organismul uman, animale (mamifere şi păsări), care
sunt gazdele intermediare ale parazitului, oochistul se găseşte la pisică–care
este gazda definitivă a parazitului.
Aspecte morfologice
Trofozoitul (tahizoiţi, endozoiţi)este forma vegetativă,semilunară are
un capăt mai rotunjit,cealalatăextremitateeste mai
ascuţitacu o dimensiune de 4-8 μm / 2-3 μm.Are
localizare intracelulara şi nu se multiplică extracelular
sau pe medii artificiale.Prin colorare Giemsa are nucleul
roşu şi citoplasma bleu (Fig. 10.9.)
Fig. 10.9. Trofozoit de Toxoplama gondii: 1 - conoid, 2

- roptrii, 3 - granule dense,4 - apicoplast, 5 - complex
Golgi, 6 - reticul endoplasmic, 7 - mitocondrie, 8 -
membrana internă, 9 – por, 10 – nucleu (desen C. Defta).
Oochistul se formeazăîn intestinul felinelor infectate şise elimină prin

fecaleîn funcţie de condiţiile de mediu (temperatură,umiditate), sporulează
în câteva zile, poate supravieţui în mediul extern până la 18 luni. Conţine 2
sporochişti iar aceştia conţin la rândul lor, fiecare câte 4
sporozoiţi (formele infectante)şi are o dimensiune de 12 μm
(vezi Fig.10.10).
Fig. 10.10. Oochist: 1-oochistul, 2-sporochişti, 3-sporozoiţii (desen C. Defta)
Chistul tisular se poate localiza în orice ţesut dar cu tropism

pentru:ţesutul nervos, ochi, muşchi.Conţine mii de bradizoiţi (hipnozoiţi fază
dormindă), poate atinge 100 μm şi poate persista toată
viaţa, fără manifestări clinice (Fig. 10.11).
Fig. 10.11. Chist: 1 - chist tisular, 2 - bradizoiţi

(chistozoiţi)(desen C. Defta)
Diagnosticîn cazul infestării cu T. gondii poate fi pus prin metode directe dar
şi indirecte.
- Metodele directe constau înevidenţierea parazitului sau se realizează

izolarea acestuia, astfel se folosesc prelevările de la nivelul ganglionar,
muscular, SNC -LCR, cordonului ombilical, placentă sau probe prelevate
după necropsie, constând în ţesuturi de la fetuşi avortaţi spontan sau
decedaţi intrauterin.
Se efectuează frotiuri sau preparate histo-patologice din produsele
patologice enumerate, de regulă sunt colorate Giemsa astfel se pot evidenţia
tahizoiţii sau chisturile tisulare.
- Metodele indirecte de diagnostic sunt cele uzuale, depistând anticorpi
sau antigene de T. gondii prin teste cu diferite principii de acţiune:
• reacţiile de imuno-fluorescenţă indirectă, dozând IgM (testul
Remington) şi IgG;
• recţia de hemaglutino-inhibare;
• testul Sabin-Feldmann (Dye Test) este o metodă foarte laborioasă, se
utilizează inocularea la şoarecii de experienţă;
• reacţiile imunoenzimatice (ELISA);
• testul ISAGA (immunosorbent agglutination assay).
Dintre tehnicile moderne care pot depista antigenele parazitare, se
utilizează PCR-ul (reacţia de amplificare genică) şi Western blotul (immuno-
blotting-ul).
În cazul femeilor ce doresc un copil, statusul serologic faţă de parazit
trebuie să fie determinat înainte ca femeia să rămână însărcinată. Astfel
prezenţa Ac IgG şi absenţa Ac IgM indică o infecţie cronică dar şi faptul că
fătul va fi protejat faţă de infecţie prin Ac IgG de la mamă (trecând prin
bariera placentară).
Se recomandă ca determinarea titrului de anticorpi să se facă în dinamică
la 3-6 săptămâni pentru a certifica stabilitatea concentraţiei Ac de tip IgG. În
lipsa Ac IgM cu un titru foarte înalt al Ac IgG, care creşte în dinamică, poate
indica o infecţie relativ recentă sau o reactivare a bolii.
În situaţia prezentatăse recomandă efectuarea concomitenta a două
metode de diagnostic, cu principii diferite, sau care folosesc antigene
diferite. Exemplu testul de aviditate IgG, test care permite aprecierea
„vechimii” infecţiei, înainte sau după 20 de săptămâni, interpretare corelată
cu momentul concepţiei.
Prezenţa Ac specifici IgM, IgA sau IgE la făt sau la nou-născut, pune
diagnosticul de toxoplasmoză congenitală şi pentru că nu pot străbate
bariera înseamnă că sunt sintetizaţi de către făt.
Prezenţa Ac IgG la nou-născut, în lipsa Ac de tip IgM, nu se poate pune
diagnosticul de toxoplasmoză congenitală deoarece ei provin de la mamă şi
pot rămâne în organismul nou-născutului şi sugarului, până la vârsta de 1
an.
Se poate pune diagnosticul de primoinfecţie şi în cazul seroconversiei,
adică a unei serologii iniţial negative pentru T. gondii (absenţa Ac IgM şi
IgG) cu apariţia acestor Ac pe parcursul sarcinii.
În toate situaţiile în care se pune diagnosticul de primoinfecţie în timpul
sarcinii, se recurge la tratamentul cu spiramicină pe toată durata sarcinii,
pentru a evita propagarea infecţiei la produsul de concepţie.
Cea mai frecventa „infecţie reactivată” este toxoplasmoza oculară in care
titrul Ac IgG este scăzut şi nu există Ac IgM. O serologia pozitivă în sângele
periferic ce dovedeşte prezenţa în organism a T. gondii, poate fi responsabil
de leziuni cu localizare oculară în peste 80% dintre cazuri,cel mai frecvent în
polul posterior ocular.
11.1Diagnosticul de laborator în infecțiile produse de: Platelminţi

Platelminţii sau viermii plaţi, care pot fi nesegmentaţinumiţi
trematode(Fasciola hepatica) şi viermii plaţi segmentaţi numiti cestode
(Teniile)
- Trematode
11.1.aFasciola hepatica
Adultul este plat, nesegmentat, foliaceu (seamănă cu o frunză), hermafrodit,
cu tub digestiv incomplet, cu două ventuze pe faţa ventrală cu ajutorul
cărora se fixează de peretele canaliculului biliarunde parazitul se răsuceşte
„în cornet”, aredimensiunea de 1,5 – 3/ 1,3 cm.
Corpul este acoperit de o cuticulă cu spini orientaţi antero-posterior, care
ajută la înaintarea în căile biliare şi în acelaşi timp împiedică întoarcerea
parazitului ( Fig 11. 1.a. 1)
(Fig. 11. 1.a. 1. Fasciola: În stânga Fasiciola schemă; 1-ventuze de

prindere, 2 - corp foliaceu, 3 - sistem
digestiv incomplet. În dreapta imagine macroscopică

(desen şifoto C.Defta)
Oul este mare, de formă ovală, cu coajă subţire, operculat, cu diametrul de

circa 150 μm, conţine o masă de celule viteline şi celula ou. El nu este
embrionat în momentul eliminării din gazda definitivă, în această situaţie nu
este infecţios (Fig. 11.1.a. 2)
Fig. 11.1.a. 2. Oul:în stânga desen ou de fasciola; 1- opercul, 2-celule
viteline, 3- celula ou. În dreapta
imagine microscopică a oului pe un preparat lamă-lamelă (desen şi foto C.Defta)
Diagnosticul poate fi direct sau indirect astfel:
Diagnosticul directse va pune prin evidenţierea ouălor caracteristice

produse de Fasciola hepaticacoproparazitologicdin materiile fecale, sau prin
examenul microscopic al lichidului duodenal, sau din bilă.
Acest tip de diagnostic cu evidenţierea oului este valabilă numai în

momentul în care parazitul a ajuns în faza de adult, aproximativ în 3 luni de
la infestare.
În scaunul pacientului pot să apară „ouă de pasaj”, atunci când se
consumă ficat de vită insuficient preparat termic, care conţine paraziţi. I se
recomandă pacientului să ţină un regim fără carne şi sărepete examenul
coproparazitologic.
Diagnosticul indirect, imunologic, poate fi realizat în toate fazele bolii

parazitare. Se pot depista anticorpi specifici anti- Fasciola hepatica prin
diferite tehnici:
- imunoenzimatice (ELISA);
- imuno fluorescenţă;
- contra imuno electroforeză;
- hemaglutinare;
- dublă difuzie;
În aceastăafecţiune un semn distinct de laborator este prezenţa
eozinofilia,cu următoarele semnificaţii:
înregistreazăvalori mari în perioadele de migrare a parazitului prin ţesuturi

(20-40%) şi valori ceva mai mici de 10% în perioada de cronicizare a bolii.
Diagnosticul imagistic este tot un diagnostic indirect care se realizeaza

prin ecografie abdominală, colangiografie retrogradă, tomografie
computerizată şi are un rol important în perioadele în care nu există încă ouă
în scaun, dar pacientul este simptomatic.
- Cestode
Cestodele sunt viermii plaţi, segmentaţi în careforma adultă este
alcătuită din:cap (scolex) ce prezintă ventuze, cârlige sau botridii, gâtul
care dă naştere segmentelor corpului - proglotele,corpul sau strobila, alcătuit
din totalitatea proglotelor cu vârste diferite.
Proglotele au aspect caracteristic speciei în cazul celor adulte; cele
tinere sunt în apropierea gâtului, cu structură internă nediferenţiată în timp
ce proglotele adulte sunt mai mari, au aparat reproducător bine diferenţiat
iar cele terminale „bătrâne” au uterul plin cu ouă. Acestea se desprind şi se
elimină odată cu materiile fecale în exterior (gâtul generează noi proglote).
11.1. b. Taenia solium.

Taenia solium produce tenioza, boală manifestată prin prezenţa
adultului în intestinul uman şicisticercoza, manifestată prin existenţa formei
larvare frecvente la porc dar şi în ţesuturile umane.
Adultul are un scolex de circa 1 milimetru prevăzut cu 4 ventuze şi 50
de cârlige dispuse pe două rânduri,este un vierme plat, segmentat, de
aproximativ 5 metri, alb, cu aproximativ 1000 de proglote.
Proglotele mature au un raport lungime-lăţime de 3 la 1. Proglotele
gravide au uterul situat median, ramificaţiile primare uterine sunt în număr
de 5-10 şi se descriu şi ramificaţii secundare, de tip dendritic, nu are orificiu
de comunicare cu exteriorul şi adăposteşte aproximativ 50.000 de ouă (Fig.
11. 1. b. 1.).
Proglotele se elimină pasivodată cu scaunul în lanţuri mai scurte sau
mai lungi, la intervale neregulate de timpsunt imobile, având o musculatură
redusă. Eliminările spontane de proglote pot fi declanşate de consumul de
condimente sau de alcool care pot determina contracţia spastică a
parazitului.
Fig 11. 1. b.1.În stânga:1- cârligele scolexului, 2-ventuze, 3- gât, 4-
proglote tinere, 5 - proglotă matură, în dreapta imaginea macroscopica a
parazitului(desen şi foto C.Defta)
Oul de T. solium este rotund, are o dimensiune cuprinsăîntre35-45 μm, cu

o coroană striată periferică şi un embrion hexacant situat în interior. Oul
este embrionat în momentul eliminării şi este infecţios atât pentru porc cât şi
pentru om (Fig. 11.2.b.).
Larva se numeşte Cysticercus cellulosae şi este o larvă monochist,
monocefală, are aspect de veziculă translucidă, poate ajunge la o
dimensiune de 2 centimetri, conţine un lichid cu aspect limpede şi cu
scolexul invaginat.
Fig. 11.1 .b. 2.Oul. În stânga schema:1- înveliş extern albuminos, 2- înveliş
gros radiar, 3- embrion hexacant, 4- bule viteline; în dreapta imaginea
microscopică a unui frotiu umed lamă/lamelă(desen şi foto C.Defta)
Diagnosticul în tenioze poate fi direct prin punerea în evidenţă a ouãlor

şi indirect prin metode imunologice şi imagistice.
Diagnosticul direct în tenioză, prin examen coproparazitologic, se pot
evidenţia ouă de T. Solium în aproximativ 10% dintre cazuri.
Ca urma a ruperii accidentale a proglotelor în momentul eliminării,
ouăle pot deveni vizibile contaminând scaunul. Prin metode de concentrare
cunoscuta ca metoda Kato-Miura cresc şansele de a evidenţia ouăle în
examenul coproparazitologic. Poate fi utilă în scop diagnostic şi studierea
proglotului eliminat pasiv, această examinare ajută la stabilirea speciei.
Cea mai indicată pentru diagnosticul teniozei este metoda Graham sau
amprenta anală “scotch-test”, în care recoltarea se face cu ajutorul unei
benzi transparente de scotch aflata pe o baghetă de sticlă,dimineaţa de la
nivelul pliurilor anale, înainte de scaun şi de toaleta locală. Banda astfel
obţinută se pune pe o lamă şi se examinează la microscop. Se pot observa
ouă de T. solium.
Diagnosticul indirect
În neurocisticercoză (larvele aflate la nivelul SNC)se coroborează
datele obţinute prin metode imagistice (computer tomografie, rezonanţă
magnetică nucleară), cu cele obţinute prin diagnosticul imunologic, prin
depistarea în ser a anticorpilor anti-Cistercus cellulosae în LCR, prin tehnici
de tip ELISA şi urmărind aceste date, în dinamică, pe parcursul
tratamentului bolii.
În cisticercoza oculară se folosescaceleaşi tehnici imagistice,tomografia
cerebrală, RMN-ul cerebral dar şi ecografia oculară. În acest caz, se vor
căuta anticorpii în umoarea apoasă.
Pentru formele musculare de cisticercoză se efectueaza biopsia
musculară, cu realizarea de secţiuni histo-patologice care vor fi examinate.
Examenul serologic se face folosind sânge periferic. Pentru completarea
diagnosticului se pot face radiografii de părţi moi, când se vizualizează bine
formele cu calcificări.
11.1.c. Taenia saginata.

Adultul are o strobilă de 6-8 m sau chiar şi de 10 metri, are
aproximativ 2000 de proglote, scolexul are 4 ventuze, nu are cârlige iar
dimensiunile acestuia sunt de aproximativ 2 mm. Proglotele terminale au
raportul lungime-lăţime de 5 la 1, o lungime de aproximativ 3 centimetri,
uterul este median, are mai mult de 16 ramificaţii uterine primare care se
divid dihotomic şi se termină în fund de sac fiecare proglot conţine
aproximativ 100.000 ouăşi nu prezintă orificiu de eliminare al ouălor ( Fig
11.1.c.)
Proglotul este musculos, mobil, poate forţa sfincterul anal şi se poate

elimina în afara defecaţiei
Fig 11.1.c. T. saginata: în stânga schema parazitului; 1 – ventuze, 2 –
scolex, 3 –proglote tinere, 4 - proglot matur. În dreapta imagine
macroscopică a parazitului (desen şi foto C.Defta)
Oul la examenul microscopic obişnuit nu se poate deosebi de oul de T.

soliumfiind foarte asemănător cu acesta, are in jur de 40 μm, o coroană
striată periferică şi în interior un embrion hexacant . Oul este infecţios
pentru bovine fiind gazdele intermediaraale parazitului. Gazda definitivă,
care poate adăposti parazitul adult, este omul.
Larva se numeşte Cysticercus bovis este o larvă monochist,

monocefală, are aproximativ 1 centimetru şi aspectul unei vezicule cu scolex
invaginat.
Diagnosticul în linii mari este asemănător cu al teniozei data de T solium.
Spre exemplu :- examenul microscopic al amprentei anale -metoda Graham,

metodă de elecţie în tenioza cu T. solium şi T. saginata.Mai rar pot fi
evidenţiaţi prin examen coproparazitologic, când se examinează materiile
fecale prin metode de concentrare Kato-Miura.
- examenul macroscopic al proglotului care este musculos,

mobil şi care iese în apropiera anusului
Evidenţiindu-se cu raportul 5/1 între lungime şi lăţime.
11.1.d. Diphyllobotrium latum (Botriocefalul)

Diphyllobothrium latum sau„tenia cu spină” este cea mai lungă tenie
umană poate ajunge până la 13 m. Are un scolexul în formă de migdală,
prezentând două fante laterale numite botridii cu rol de ventuze, cu care se
ataşează de mucoasa intestinului subţire. Strobila cuprinde 4000 de
proglote, proglotele terminale sunt mai mult late decât lungi, au un uter
median rozetat, lipsit de ramificaţii uterine clasice care comunică cu
exteriorul printr-un orificiu numit tocostom.(Fig. 11. 1 d. A.)
Oul de Diphyllobothrium latumeste oval cu undiametrul de 70 / 45 μm,
operculat la o extremitate iar la cealaltă extremitate prezintă un pinten
numit carenă. În interiorul oului există celula ou şi o masă de celule viteline,
uşor de identificat la examenul coproparazitologic,acesta este neembrionat şi
neinfecţios în momentul eliminării (Fig. 11. 1
d. B)
Fig. 11. 1 d. A. Diphilobotryum: în stânga desenul scolexului:1-botridii, 2 -

scolex, 3 - gât. În dreapta imaginea parazitului(desen şi foto C.Defta)
Fig. 11. 1 d. B. Oul de Botriocefal: în stanga; 1- celula ou,2- opercul,3-
membrana, 4- carena, 5- celulele viteline. În dreapta imaginea microscopica
pe un frotiu lamă-lamelă (desen şi foto C.Defta)
Diagnosticul este pus prin examenul coproparazitologic deoarece ouăle

se elimină în mod constant şi în număr mare în intestin.Proglotele apar în
situaţii rareîn materiile fecale,doar dacă pacientul a consumat condimente şi
astfel este stimulată contracţia spastică a parazitului. În mod normal,
proglotul se dezintegrează în intestindupă eliminarea ouălor.
În cazul acestei parazitoze hemoleucograma evidenţiază anemie
macrocitară, reticulocitoză, leucopenie cu neutropenie, trombocitopenie,
eozinofilie şi un VSH-ul accelerat. Se constată hipergamaglobulinemie şi
hipoalbuminemie.
11.1.e. Echinococcus granulosus.

Adultul este un cestod mic, de 4-6 milimetri, format din scolex cu 4
ventuze şi o coroană dublă de cârlige, gât şi strobilăcu 3 proglote. Primul
proglot de lângă gât este tânăr, cu organe genitale imature, al doilea este un
proglot matur, cu organe genitale dezvoltate. Cel de al trei-lea are uterul
plin cu ouă embrionate, aproximativ 500-800. Ouăle embrionate sunt
infecţioase atât pentru ierbivore cât şi pentru om.
Oul asemănător cu oul de Taenia solium şi Taenia saginata,este rotund
de aproximativ 40 μm, cu o coroană striată periferică şi un embrion
hexacant în interior (Fig 11.1.e.).
Larva este cunoscută sub denumirea de hidatidă sau chist hidatic este
polichistică şi policefalică, se dezvoltă în gazda intermediară “normală”
reprezentată de oi, vaci şi porci. La om se poate dezvolta accidental cel mai
frecvent cu localizare hepatică şi pulmonară, dar poate fi observată practic în
orice organ. Are dimensiuni variabile în funcţie de vârstă şi de ritmul de
creştere, între 1 şi 5 centimetri pe an. Formarea protoscolecşilor necesită o

durată mai mare de 1 an.
Fig. 11.1.e.Ecinococcus granulosus: adultul în stânga; 1- carlige, 2- ventuze,
3- scolex, 4- proglotă 1 tânără, 5 –proglota a 2-a matura, 6- proglota a 3-a
matură cu ouă. Chistul hidatic în dreapta 1- ţesutul gazdă, 2- adventicea, 3-
membrana cuticulară, 4- stratul germinativ, 5- capsula proligeră , 6-
veziculă fiică liberă(desen C. Defta)
Diagnosticul în infestarea cu E. granulosus poate fi direct prin punerea în

evidenţă a chistului hidatic şi indirect prin metode de laborator.
Diagnostic direct. Boala se numeşte hidatidozaşi este descoperită de cele
mai multe ori de un examen radiologic de rutina în special la nivel pulmonar
apărând ca o opacitate netă, omogenă, rotundă, cu contur net în
parenchimul pulmonar carenu se calcifică. Comparativ cu chistul hepatic care
în 50% din cazuri, prezintă o margine subţire de calcifiere.
Pentru precizarea diagnosticului de hidatidoză trebuie coroborate, datele
clinice, imagistice şi serologice.
Din punct de vedere imagistic pot fi utile:
- Ecografia reprezintă metoda de elecţie pentru toate localizările, cu
excepţiacelor toracice;
- Examenului radiologic i se adaugă o varietate de metode imagistice
sensibile care diferenţiază chistul hidatic de cei de altă natură.Radiografia
toraco-pulmonară de faţă, urmată uneori cu imaginea de profil pentru
evidenţierea localizărilor pulmonarefiind vizibile ca o opacitate omogenă,
rotundă, cu contur delimitat net în cazul chisturilor hidatice compacte sau cu
nivel hidro-aeric în cazul chisturilor hidatice parţial evacuate.
- Examenul CTpoate evidenţia mai multe detalii ale hidatidozei, decelează
chistul hidatic cu dimensiuni mai mici de 1 centimetru, permite aprecieri cu
privire la conţinutul chistic. Se foloseştesubstanţă de contrast în special la
formele peritoneale şi retro-peritoneale, în hidatidoza secundară sau în cazul
recidivelor postoperatorii, localizări cerebrale, de orbită, osoase. În
diagnostic,examenul CTcompletează util atât examenului ecografic cât şi
monitorizarea tratamentului chistului hidatic, decelează apariţia
complicaţiilor: abcese, fistule, rupturi, etc.
- RMN foarte util în anumite localizări cerebrale, în recidivele postoperatorii,
în localizările multiple intra-abdominale şi retro-peritoneale, musculare,
osoase şi în cazul, în care se renunţă la o nouă intervenţie chirurgicală şi se
face monitorizarea evoluţiei sub tratament antiparazitar (valabil şi pentru
tomografia computerizată).
-Arteriografia este utilă numai în faza preoperatorie, furnizând chirurgului o
hartă vasculară completă indispensabilăîn cazul unei hepatectomii.
- Puncţia exploratorie este contraindicată atunci când se suspicionează boala
hidatică, datorită riscului diseminării hematogene local sau la distanţă
(urmată de recidivă).
Diagnosticul indirect, imunologic, completează diagnosticul imagistic şi
constăîn detectarea anticorpilor specifici în serul bolnavilor printr-o serie
de tehnici de tipul:
- reacţiei de hemaglutino-inhibare,
- reacţiei de imuno-fluorescenţă,
- contra imuno electroforeză în care se detectează anticorpii faţă
de antigenul 5 specific parazitului.
- latex-aglutinare,
- reacţiei imunoenzimatice (ELISA).
Un procent de 10% sau chiar 20% dintre bolnavi pot să aibă serologie
“negativă” pentru antigenele lui E. granulosus, majoritatea dintre aceştia
având chistul hidatic localizat la nivel pulmonar, la nivel cerebral sau la
nivel ocular;
Acelaşi răspuns “negativ” se poate întâlni la bolnavii cu chisturi hidatice
calcificate deoarece aceștia încetează de a mai stimula antigenic gazda de
multe ori, examenul serologic este negativ şi la copii.
Fisurarea sau ruperea chistului hidatic este urmată de o stimulare
bruscă a titrului de anticorpi sau de o seroconversie (examen “negativ”
urmat de examen “pozitiv”).
Post-operator se poate înregistra seroconversia sau creşterea
semnificativă a titrului anticorpilor anti-E. granulosus. Reacţiile serologice
pot contribui la monitorizarea în dinamică a bolnavilor, după operaţie.
După creşterea tranzitorie a titrului anticorpilor anti-E.granulosus, post-
operator, apare de regulă o scădere progresivă pe parcursul a circa 1 an;
o nouă ascensiune a titrului anticorpilor, ridică suspiciunea de recidivă.
Un procent important dintre pacienţii operaţi de chist hidatic pot să
prezinte timp de ani de zile valori pozitive a titrului anticorpilor anti-E.
granulosus,.
Testele de confirmare a hidatidozei se pot face numai în laboratoarele
specializate şi implică următoarele tipuri de analize:
- reacţia de dublă difuzie cu identificarea antigenului 5 (din
celulele parenchimatoase ale protoscolecşilor şi în veziculele
proligere),
- reacţia de imuno electroforeză cu identificarea aceluiaşi antigen,
- determinarea IgG4 prin tehnici de tip ELISA,aplicarea tehnicii
Western blot pentru diferite antigene specifice
11.2. Nematode
Sunt viermi cilindrici, au sexe separate.Femela este mai lungă decât
masculul si are extremitatile corpului
Drepte, în timp ce masculul are capătul terminal răsucit „în cârjă”.Au aparat
digestiv complet.
11.2. a. Ascaris lumbricoides. (Limbricul)
- Adultul cel mai mare nematod parazit la om.
- Femela are o lungime de 20-25 cm şi diametru de 6-7 mm iar extremitătile

sunt drepte şi ascuţite.
- Masculul are olungime 10-17 cm şi diametru de 4 mm la capătul

anterioreste ascuţitiar cel posterior este răsucit în formă de “cârje”.
- La capătul anterior se află capsula bucalăce prezintă 3 buze cu margini

dinţate cu care se prinde de mucoasa
intestinală.
- Oul produs de femelă poate fi nefertil atunci când nu există un mascul în

intestine.
-Aspectul oului nefertil: este mare de 90µm, mai colţuros, cu învelis

mamelonat, de culoare galben brun, cu
conturul amorf care umple complet oul.
-Oul fertil este tot oval de dimensiuni mici 65-75/30-50 µm, culoare galben-
brun, înveliş mamelonat extern cu rol
de membrană protectoare externă, sub aceasta exista un strat incolor gros,

iar în profunzime se află o membrană subţire
În profunzime se află celula ou care nu umple comple oul (Fig 11.2.a)
-Ambele tipuri de celule sunt eliminate odată cu materiile fecale.

Fig 11.2 a. Ascaris ou şi adult. Pornind din stânga prima imagine e un ou
fertil, a doua imagine reprezintă un ou nefertil, în ultima imagine este un
adult mascul cu extremitatea posterioara in carje(foto C.Defta)
Diagnosticul în ascarioză
Pentru diagnosticul ascariozei se efectuează un examen

coproparazitologic, care poate evidenţia ouă fertile sau nefertile cu aspectul
descris mai sus prin examen microscopic direct, sau examen
coproparazitologic realizat prin tehnici de concentrare urmat de examinarea
microscopică. Pentru a pune in evidență ouale este necesarca parazitulsă
ajungă la stadiulul de maturitate (producător de ouă).
În timpul „pneumoniei verminoase” se examinează sputapentru a

evidenţialarvele.
Adultul poate fi eliminat prin anus fie viu, în perioadacât traieşte în intestin
(1-2 ani), sau mort şi poate fi prezent în materiile fecale, putând fi
recunoscut ca femelă sau masculdupăcaracteristicilor prezentate. Uneori, în
timpul intervenţiilor pe tractul digestivintraoperator, pot fi descoperiţi adulţi
de Ascaris lumbricoides.
Hemoleucograma este modificată manifestând eozinofilie cu valori mai mari

în timpul perioadei de migrare tisulară şi scade sub 10% în perioada în care
parazitul este localizat intestinal.
Examenul după tranzitul baritat permite evidenţierea unui „defect de
umplere” la nivel intestinal. Uneori, se pot vizualiza paraziţii adulţi, prin
endoscopie efectuată la nivel digestiv superioar.
11.2. b. Toxocara spp.
- Adultul are câţiva cm lungime,o grosime de 1 mm seamănă cu Ascarisul

fiind cilindric, alungiţi de culoare gri
prezintă 2 aripioare laterale la extremitatea cefalică.
- Oul:oval, 80 microni, perete subţireeste neembrionat şi neinfecţios în

momentul eliminării (Fig.11.2.b.)
Fig.11.2.b.Toxocara.Ou –stânga, adulţi – dreapta(foto C.Defta)
Diagnosticul în toxocaroză
Toxocaroza la om este dată de prezenţa în diverse organe a formelor

larvare ale toxocarei sp. care nu ajunge în faza de adult,în organismul
uman.Rămâne în fază larvară dând sindromul de larva migrans visceralis
care este stabilită de obicei pe criteriiclinice, ce implică anamneza, tehnici
imagistice şi analize imunologice.
Anameza furnizează informaţii importante legate de contactul
pacientului cu animale parazitate, dacă nu urmează regulile de igienă, sau
accidental a ingerat pământ.
Tehnicile imagistice implică:
- Radiografia pulmonara care pune în evidenţă infiltratele pulmonare,

care apar ca rezultat al migrării larvelor prin parenchimul pulmonar.
-CT-ul şi ecografia abdominală care evidenţiază afectările viscerale prin

aspectul neomogen al parenchimului datorită granuloamelor eozinofilice
perilarvare.
Diagnosticul serologic poate evidenţia prezenţa anticorpilor prin

tehnicile următoare:reacţia de precipitare, reacţia de aglutinare,RFC, ELISA,
IF, tehnica Western blot.
Ac de tip Ig M ar stabili o formă acută, dar în această afecţiune IgM

poate persista timp de 8-12 luni.
În cazul Ac IgG testul de aviditate poate arăta daca infecţia este mai
recentă sau mai veche.
Western blot din LCR poate confirma sau infirma parazitoza cerebrală.
În diagnosticul sindromului de LMV un rol important îl are prezenţa

leucocitozei însoţită de eozinofilie. Dar pot fi luate în consideraţie şi alte date
de laborator,cum sunt creşterea transaminazelor, creşterea altor enzime
datorită colestazei, citolizei musculare, hipergamaglobulinemiei, apariţia
diferiţilor reactanţi de fază acută, aceste date sunt asociate cu diagnosticul
serologic pozitiv pentru emiterea unui diagnostic real.
Un alt diagnostic important este dat şi de identificarea larvelor în

sputăsau în granuloamele eozinofilice tisularesau a nodulilor hepatici.
În toxocaroza oculară cunoscută ca sindromul de larva migrans
ocularis (LMO) pot apare semne similare ca în LMV, dar existăşi situaţii în
caresingurele manifestări sunt cele oculare. În acestă situaţie diagnosticul
constăîn ecografii oculare, CT cranian, angio-fluorografia și diagnosticul
imunologic. Tehnicile de lucru imunologice implică reacția ELISA, test
Western blot, PCR din ser dar și din umoarea apoasă.
11.2. c. Enterobius vermicularis (Oxiurul)
Este un vierme cilindric mic, albicios, femela are 1 cm cuextremităţile

drepte,porţiunea mediană mai groasă datorită celor 2 utere pline cu 15 000
ouă, porţiunea posterioară subţire ca un vârf de aţă, masculul are 3-5 mm
cu extremitatea posterioară răsucită “în carje” şi un spicul terminal.
Extremitatea anterioara atât la femelă cât şi la mascul prezintă un buton

cefalic cu care se ataşează de mucoasa cecului.
Oul – oval, plan convex, cu înveliş dublu, transparent prin care se poate
vedea embrionul giriniform cu corp oval şi prelungire ca o coadă. În 1-4 ore
embrionul trece în forma larvarăinfecţioasă(Fig. 11.2.c)
Fig. 11.2.c. Oxiurul:oul cu larva giriniformăstânga iar în dreapta

femela adult(foto C.Defta)
Diagnosticul în enterobioză
Examenul direct coproparazitologic poate evidenţia ouăle în 10-15%

dintre cazuri. Se pot observa, uneori, viermii adulţi în materiile fecale, mai
ales după scaune diareice, sau după ce au început să ia un tratament
antihelminticfie după consumul unor alimenta. Mamele pot vedea paraziţii
adulţi în pliurile mucoasei anale, la copil, dimineaţa, atunci când fac toaleta
locală a acestuia sau cand copilul acuză mâncărimi în această zonă.
O alta metoda de investigaţie este examenul amprentei anale prin
metoda Graham,în care recoltarea se efectueazăcu o bandă de scotch
transparentăînfăşurată pe o bagheta de sticlă, care se aplică în zona anală
dimineaţa, înainte de defecaţie şi toaleta locală imprimându-i o mişcare sus-
jos, dreapta-stânga şi apoi se examinează la microscop. Seaşează banda de
scotch pe o lamă adăugând şi o picătură de soluţie salină fiziologică sau
glicerină realizând un preparat lamă lamelă. Această metodă permite
creşterea semnificativă a diagnosticului pozitiv, care ajunge la circa 50% din
prima examinare.
12. 1. Norme privind recoltarea şi transportul produselor patologice

în vederea efectuării diagnosticului de laborator în viroze.
Să fie efectuată de către personalul instruit în acest scop.

- Să fie realizată cât mai precoce în raport cu debutul bolii.
- Să ofere un eşantion reprezentativ, în cantitate suficientă, din produsul

patologic în care este cel mai plauzibil să fie depistat agentul etiologic
viral.
- Să fie făcută cu instrumentar steril, în recipiente sterile, respectând cu

stricteţe normele de asepsie.
- Cu unele excepţii spre exemplu LCR, unde probele sunt prelucrate imediat
după recoltare.
Probele se introduc în recipient cu mediu conservant, tamponat (ex.

mediul Hanks cu albumină bovină 2-4%, penicilină, streptomicină, nistatin,
griseofulvină). Recipientele cu probe se etichetează corespunzător şi cu
excepţia sângelui, sunt congelate, preferabil la -70oC.
- Proba este însoţită de buletinul de analize corespunzător, completat.
- Timpul de la recoltare până la efectuarea examenului virusologic va fi

scurtat la maximum. Recipientele cu probe
se transportă în casolete metalice, închise ermetic.
- Pe perioada transportului şi până la examinare, probele vor fi congelate.
Produse patologice:
- Secreţiile faringiene şi nazofaringiene se prelevează cu tampoane prin

spălare naso-faringiană are valoare şi pentru virusul rujeolic.
- Secreţia salivară este importantă pentru Citomegalovirus, Virusul urlian

imediat după debutul bolii.
- Sputa, aspiratul traheobronşic în cazul virusurilor gripale, paragripale şi

rhinovirusurilor.
- Secreţia conjunctivală pentru adenovirusuri, v. coxsakie, v. rujeolic.
- LCR în meningite, meningoencefalite; se recolteaza prin puncţie în zona

lombară pentru v.rubeolei, rujeolei,
EBV, Herpes Simplex Virus, Citomegalovirus.
- Sângele sau ser pentru punerea în valoare a anticorpilor anti virusurile

infectante.
- Materiile fecale recoltarea în coprocultoare pentru enterovirusuri (când

boala se manifestă)şi rotaro virusuri,
recoltarea se face cu sonde şi tampoane care se decarcă în soluţie nutritivă

sau de transport.
- Crustele şi lichidul din vezicule şi pustule prin puncţie sterilă cu seringa,

pipeta Pasteur sau tampoane pentru
herpes virus, varicella zoster, vaccina.
- Urina se recoltează din emisia spontană după igiena riguroasă a zonei, sau
cu sonde iar transportul în
urocultoare, pentru virusul urlian la sfârşitul bolii.
- Secreţiile uretrale cu tampoane sterile sau pipete Pasteur şi secreţiile de

col uterin recoltatea cu tampoane
sterile pentru papiloma virus şi v. herpetice
- Probe biopsice din ggl. limfatici, maduva osoasă, ficat, recoltarea se face
prin puncţie sterilă de către persoanele
calificate pentru a pune în evidenţă agentul viral implicat.

- Probe necroptice fragmente de organ ficat, splină, pulmon, ganglion, rinichi
se introduc în recipiente de
Conservare, transportul se face cât mai rapid la 40C sau se păstrează la -

700C.
12. 2. Metode de cultivare a virusurilor.Virusurile se replică numai în

celula vie, cele trei sisteme care permit replicarea virusurilor sunt culturile
celulare, oualele embrionate şi animalele de laborator.
A. Izolarea virusurilor pe Culturi Celulare. Culturile celulare sunt

reprezentate de celule dispersate obţinute cu ajutorul unor enzime
proteolitice şi care sunt plasate într-un mediu nutritive sunt capabile să
supravieţuiască şi să se multiplice.
Elementele esenţiale ale unei culturi celulare sunt celulele vii şi mediul
nutritiv.
Celulele vii -se obţin din ţesuturi umane adulte normale, ţesuturi embrionare
şi neoplazice.
-Ţesutul adult dă culturi de tip epitelial, cu celule poligonale care formează

de obicei placarde;
-Tesutul embrionar care dă de obicei culturi de tip fibroblastic – cu celule

alungite, fusiforme, paralele, orientate regulat.
- Tesutul neoplazic dă culturi celulare de tip epitelial cresc cu uşurinţă şi nu

formează placarde.
Metoda prin care celulele sunt disociate dintr-un ţesut se face cu

ajutorul unor enzime proteolitice (tripsina) şi care în asociere cu agitarea
mecanică se numeste tripsinizare. Tripsina rupe legăturile intercelulare,
eliberând celulele vii ca unităţi separate. Celulele sunt suspendate într-un
mediu. Mediul nutritiv conţine în general aceleaşi elemente de bază: soluţie
salină tamponată (sol. Hanks), soluţie izotonă cu pH constant (7,4), săruri
minerale, aport proteic asigurat prin serurile animale în special ser de viţel
5-6 % (reprezentând un factor de creştere)şi amino acizi esenţiali (din care
nu trebuie să lipsească glutamina). Aminoacizii esenţiali sunt fie ca atare sau
ca hidrolizat proteicşi vitamine în special cele din grupul B.
Mediile cele mai obişnuite sunt: HANKS, EAGLE, IC-16, IC-65, celulele se
incubează pe aceste medii la 24-48 ore, la 370C conducând la dublarea
numărului.
Aceste celule pe un mediu adecvat din punct de vedere al nutrienţilor, pH-

lui, t0 rămân viabile şi continuă să se înmulţească.
Clasificarea mediilor de cultură în funcţie de provenienţa materialului

biologic.
1. CULTURI DE ORGAN
Constituite din fragmente mici de : trahee, bronhii, intestin subţire
proximal, trompe uterine etc. menţinute în mediu adecvat îşi păstrează
structura şi funcţia timp de câteva zile.
- Acestea au rol în studiul mecanismelor patogenice ale unor: virusuri

enterice (rota virusuri), virusuri respiratorii (corona virusurile)
2. CULTURI (PRIMARE) DE CELULE

Se obţin prin dispersia enzimatică (tripsină) urmată de dispersia mecanică
cu ajutorul agitatorului electromagnetic. Suspensia celulară ajustată la 150
000-200 000 celule/ml, se pune în mediu de creştere şi se repartizeză în
tuburi sau plăci sterile. Celulele aderă de sticlă, se înmulţesc, formează un
film continuu de celule în monostrat, după care multiplicarea încetează
datorită inhibiţiei de contact. Urmată apoi de infectarea cu virusuri, pot fi
subcultivate de 5-6 ori.
3. CULTURI DE CELULE DIPLOIDE

Reprezintă culturi de celule omogene (un singur tip de celule) cele mai
utilizate sunt cele obţinute din fibroblastele stabilizate pornind de la
embrionul uman. Pot fi subcultivate între 20-50 de pasaje. Caracteristic
prezintă cariotip cromozomial diploid propriu ţesutului de origine. Exemplu
cultura de celule WI-38, aceasta este obţinută din pulmon de embrion uman.
4. LINII DE CELULE (PERMANENTE, HETEROPLOIDE)
Reprezintă o populaţia celulară care derivă direct din ţesuturile tumorale

sau din celulele diploide infectate cu virusuri oncogene. Pot fi cultivate serial
sau un număr indefinit de pasaje. Aceste celule nu mai seamănă cu cele din
care au provenit. În general garnitura cromozomială este poliploidă. Ex.
HeLa obţinută din carcinom epitelial, VERO-rinichi de maimuţă verde
africană, KB - carcinom epidermoid. Pot fi şi conservate un timp îndelungat
prin congelare.
Inocularea şi identificarea virusurilor în culturi celulare
Se aleg culturile celulare adecvate cu susceptibilitatea cea mai mare la

virusul presupus ca fiind în probă. Cultura trebuie să fie proaspătă,
confluentă, fiecare cultură se examinează macroscopic şi microscopic.
Produsul patologic înainte de inoculare este prelucrat pentru

îndepărtarea debriurilor şi bacteriilor prin centrifugare diferenţială şi tratat cu
antibiotic. Produsul patologic se inoculeză direct pe celulele aflate în
monostrat după ce mediul de creştere a fost îndepărtat. Se lasă 1 ora la
370C pentru absorţia virusurilor pe celule, se adaugă mediu de întreţinere şi
se incubează la 370C. În orice experiment se păstrează cultura martor
neinoculată.
Urmărirea replicării virale
1. Efect citopatic (ecp) reprezintă ansamblul modificărilor mofologice celulare

induse de prezenţa virusurilor în culturile celulare. Se observă la microscop,
acest efect variază în funcţie de tipul de virus şi tipul de celulă pe care este
cultivat virusul astfel :
- degenerscenţă celulară şi liză, celulele sunt rotunjite, refringente, cu

desprindere de pe sticlă la enterovirusuri.
- formarea de sinciţii la Paramixo virusuri şi Herpes virusuri
- agregarea celulelor şi leziuni ale nucleului la Adenovirusuri
Grad de manifestare a efectului citopatic se notează cu (+)
- + 24% din monostrat efect citopatic
- ++ 50% din monostrat efect citopatic
- +++ 75% din monostrat efect citopatic
- ++++ 100%din monostrat efect citopatic
2. Fenomenul de hemadsorbţie constă în fixarea hematiilor pe celulele

infectate cu virusuri, este un fenomen caracteristic mixo şi
paramixovirusurilor, acestea sunt virusuri care nu produc modificări
caracteristice în culturile celulare.
3. Apariţia hemaglutininelor în supernatant, aglutinarea hematiilor în

supernatant ca urmare a acţiunii de aglutinare a aglutininelor virale. Ex. V.
Gripale, V. Paragripale şi Arbo virusurile.
4. Interferenţa virală apare la virusurile care asemenea virusurilor

hemadsorbite nu produc modificări morfologice caracteristice în culturile
celulare, însă au capacitatea de a interfera cu replicarea unui al 2-lea virus,
inoculate în aceeaşi cultura şi pe care îl inhibăîn multiplicare.
Ex. Virusul Rubeolic, nu produce efect citopatic în linia VERO astfel că la 10

zile de la inoculare se adaugă un enterovirus ECHO11 care în mod normal ar
trebui să producă efect citopatic dar acesta este inhibat de prezenţa virusului
rubeolic (apare degenerescenţa urmata apoi de liza celulară).
5. Incluziunile virale sunt acumulularea paracristalină de virioni şi

componente virale în aria de replicare şi asamblare a virionilor se colorează
Giemsa sau hemalaun-eozină.
Localizarea, forma, afinitatea tinctorială sunt criterii de diagnostic pentru

infecţiile cu virusuri
Ex.- Herpes virus: Incluziuni intranucleare, celulele infectate formează

sinciţii.
- Reo virusurile: Incluziuni intracitoplasmatice acidofile perinuclear.
- virusul Rujeolic: Incluziuni intracitoplasmatice şi intranucleare, celulele

infectate formează sinciţii.
6. Colorarea Imunofluorescentă se depistează Ag Viral în celulele infectate.
7. Transformarea celulelor normale în celule canceroase (transformare

malignă) prin virusuri Oncogene (SV40, V. Sarcom Rous): pierderea inhibării
de contact, focare de aglomerări celulare.
B. Embrionii de găină (oua embrionate de găină-OEG)

Unele virusuri se multiplică şi se izolează preferenţial în ouă
embrionate, o serie de virusuri produc leziuni patognomonice (leziuni
specifice pentru anumite virusuri). Ouălele embrionate se folosesc pentru
izolarea şi identificarea virusurilor dar şi pentru prepararea de vaccinuri şi
reagenţi de diagnostic.
Oualele trebuie să fie de la găini specific pathogen free(SPF) care sunt

crescute în condiţii de sterilitate pentru a nu influenţa reacţii fals pozitive.
Ouălele sunt puse la incubat 6-14 zile după cere sunt controlate la ovoscop,
care prin transluminare se poate observa viabilitatea embrionului.
Căile de inoculare:
- Membranachorioalantoidă: ziua 11-12, v. vaccinia, v. herpetice, v.

oncogene, pox v.;
- Cavitatea alantoidiană: ziua 9-12, v. gripale;
- Cavitatea amniotică: ziua 9-10, v. gripale, ziua 5-7,v. urlian;
- Sacul vitelin (ataşat embrionului, rezervă nutritivă): rickeții, chlamidii, v.

herpetice (ziua 5).
Incubare : 350C, 3-5 zile, 40C, peste noapte a doua zi se recoltează: lichide,
membrane, ţesuturi
Efecte observate :
- Moartea embrionului la v. urlian, herpes v.
- Acumularea Ha în lichidul alantoid şi amniotic la v. Gripale
- Pustule pe membrana chorio-alantoidă la pocks virusuri.
C. Animale de experienţă
-Când receptivitatea celorlalte gazde este nesatisfacătoare în cazul v. Rabic,

Arbo v., v. Coxsackie A, HIV
- Replicarea virală este demonstrată prin:- boala manifestă cu sau absența
decesului
- Urmărirea virusului în organul ţintă se face prin:- hemaglutinare: arbo v.
- infecţiozitatea
omogenatelor: v.coxsackie
- examen histo–
patologic:- leziuni inflamatorii
- leziuni degenerative
- incluzii virale (ex.

Corpusculii Babeş-Negri în neuronii infectaţi
cu v. Rabic)
Animalele de laborator se folosesc în :
-diagosticul Virozelor;
-obţinere reagenţi biologici;
- în prepararea vaccinurilor (ex. V. Antirabic pe creier de şoarece);
- studii de patogeneză şi imunitate antivirală.
Surse de animale – specii folosite experimental:
- Mamifere mici (şoareci, şobolani, hamsteri, cobai, iepuri,

maimuţe, dihori) →în experienţele curente;
- Mamifere mari (capre, oi, cai, viţei) → pentru preparate

biologice;
- Păsări : găini, prepeliţe, porumbei, raţe, curcani.
Selecţionare în funcţie de:
- susceptibilitatea la virusuri (şoarece - v. Coriomeningitei limfocitare;

cimpanzeu- HIV; maimuţă- v. Rujeolic, VHB)
- vârstă
- stare de sănătate
- omogenitatea lotului experimental
Dezavantaje- cost crescut
- receptivitatea variază în funcţie de: specie, linia genetică, vârsta animalului
- existenta virusuri latente care interferază cu cel inoculat sau se pot

reactiva.
1. Animale SPF (specific pathogen-free) - fără floră patogenă
- crescute în regim de barieră sanitară: condiţii de mediu (hrană, aer) ce

previn contaminarea cu germeni patogeni
2. Animale germ-free (fară floră asociată contaminantă)
- hranite în condiţii de creştere restrictive în izolatoare speciale (aer + hrană

sterilă)
3. Animale inbred, izogene
- se obţin prin înmulţiri consangvina(după 20 de generaţii)
- identice din punct de vedere genetic cu perechea de strămoşi comuni

- împerecheri controlate soră – frate (minimum 20 generaţii)
- în studii de - imunitate antivirală, transplant,oncogeneză.
4. Animale trangenice
- au în genom o genă transfectă (straină) ce se va exprimă

fenotipic(injectarea unei gene în pronucleul unui ou fecundat provenit de la
parentalii izogeni urmată de implantarea oului în oviduct)
5. Şoarecii nuzi - absenţa congenitală a timusului
Cultivarea pe animale de laborator
1.Pregătirea animalelor pentru inoculare
2. Inocularea: alegerea căii optime de acces la ţesuturile şi organele pentru

care virusul are afinitate (subcutan, intramuscular, intravenos,
intraperitoneal, intracerebral, digestiva etc.)
-Virusurile Neurotrope (v. Rabic, arbo v.) →intracerebral
-Virusurile Respiratorii (v. Gripal) → intranazal
-VirusurileDermotrope (v. Vaccinia) →intradermic
3. Supravegherea animalelor inoculate : temperatura corpului, stare

generală (anorexie, blană zburlită), pierderi în greutate, semne clinice
caracteristice (paralizii, tremurături).
4. Recoltarea produselor patologice
-Animale moarte: - ex. Macroscopic se prelevează ţesuturi, organe.
- ex. Microscopic frotiuri din amprente (histopatologic)
- Animale fără semne de boală, se fac 3 pasaje oarbe la alte animale

12.3. Metode de diagnostic virusologic și serologic.
Diagnosticul propriu-zis:
Examen direct prin microscopie electronică sau imunofluorescenţă.
Examenul indirect prin cultivarea, izolare şi identificarea virusului. Pentru

diagnosticul indirect se utilizează culturi de provenienţă diferită aproape de
la toate speciile de vertebrate şi unele nevertebrate, insecte, artropode.
Oul embrionat pentru virusul gripal, animalele de laborator servesc pentru

izolarea unor virusuri cu afinitate specifică pentru unele specii de şoareci
nou-născuţi pentru virusul Coxsackie.
Identificarea virusurilor se face în urma unor modificări morfologice,

exemplu culturile celulare efectul citopatogen etc., incluzii celulare agregate
intracelulare de virusuri. Pe oualele embrionate leziuni tip pox, pe membrana
corioalantoidă la Virusurile vaccina şi variolic.
Detectarea antigenelor virale prezente în lichidul de cultură, lichidele

alantoidiene, amniotice. Testarea se face cu seruri imunospecifice şi se
folosesc reacţii de: neutralizare, hemoaglutinoinhibarea, RFC, ELISA.
Diagnosticul serologic detectează răspunsul imun specific faţă de infecţiile

virale prin evidenţierea anticorpilor din serul bolnavilor, acestea se realizeaza
cu Ag standard.
Se testeaza tipul de răspuns imun; primar, secundar exprimat prin

preponderenţa unui anumit tip de Ig. IgM precoce la 2-3 zile de la debutul
bolii scade după 2-3 săptămâni urmată de apariţia IgG la o săptămâna de la
debut cu un maxim la 3-4 săptămânişi care se menţine. Răspunsul secundar
însoţit numai de prezenţa IgG. Diferenţierea se face prin tratarea serului cu
mercapto etanol, detectarea cu conjugatul anti IgM.
Anticorpii care blochează activitatea specifică virală sunt anticorpi
seroneutralizatori cu rol de a bloca infecțiozitatea, anticorpii
hematinoinhibanţi şi anticorpii fixatori de complement.
12.4. Diagnosticul de laborator în infecția produsă de virusurile

gripale.
II. Diagnosticul direct de laborator
1. Recoltarea produselor patologice
Se pot preleva:
- secreţii nazale
- lichid de spălătură nazofaringiană
- aspirat traheal, lichid de spălătură bronşică, piese necroptice.
2. Examenul direct al produsului patologic
Pot fi detectate direct în produsul patologic:
- Virionul, cu ajutorul microscopiei electronice.
- Antigenele virale, cu ajutorul:
• IFD - realizată pe amprente de mucoasă nazală şi frotiuri efectuate din
secreţii nazale.
• ELISA - folosită în special pentru identificarea antigenelor de tip.
- Acidul nucleic viral poate fi detectat prin:
• hibridizare cu sonde nucleotidice.
• PCR, aplicată după obţinerea ADN-ului complementar ARN-ul viral prin
reverstranscriere
RT-PCR (reverstranscriere-PCR).
3. Izolarea virusului
Produsele patologice sunt prelucrate şi sunt inoculate pe:
-Ouă embrionate de găină
Izolarea pe ouăle embrionate este metoda de elecţie şi este
accesibilă tuturor laboratoarelor de virusologie. Produsele patologice sunt
inoculate pe ouăle de găină fecundate, cu embrioni de 8-12 zile.
Examinând oul în poziţie orizontală la ovoscop se stabileşte locul
inoculării în regiunea unde distanţa dintre cochilie şi embrion este cea mai
mică, iar după badijonarea cu tinctură de iod, se realizează un orificiu de
dimensiuni mici în cochilie, fără să se perforeze membrana proprie a oului.
La acest nivel, se pătrunde cu un ac cu bizou scurt, ataşat la o seringă de
1ml, prin membrana proprie a oului şi membrana corioalantoidiană.
În momentul când se întâmpină o rezistenţă prin atingerea
embrionului, se retrage foarte uşor acul şi se inoculează o cantitate de 0,1ml
din produsul patologic. Apoi, se retrage acul brusc şi se obturează orificiul cu
o picătură de parafină topită, sterilă.
Ouăle inoculate sunt incubate la temperatura optimă de cultivare a
virusurilor gripale, respectiv 33-34oC. Ouăle se deschid după omorârea
embrionului prin refrigerare, respectând normele de lucru aseptic. Se
recoltează lichidul amniotic şi lichidul alantoidian, ce urmează a fi inoculate
pe alte ouă embrionate, în vederea obţinerii virusului gripal în cantitate
mare, în urma a 2-5 treceri succesive.
-Culturi de celule
Virusurile gripale cultivă mai greu în culturi celulare. Cel mai bine
cultivă virusul gripal de tip B, urmat de tipul A, în timp ce cel de tip C cultivă
extrem de dificil sau deloc. Produsele patologice tratate cu antibiotice pot fi
inoculate în culturi primare de rinichi de maimuţă sau linii celulare de rinichi
de câine (MDCK).
-Animale de laborator
Şoarecele alb şi dihorul sunt foarte sensibili la infecţia cu virusurile
gripale, iar inocularea se practică în general intranazal. Şoarecii dezvoltă o
pneumonie letală. Din trituratul pulmonar obţinut după sacrificarea acestora,
în urma inoculării altui lot de şoareci pe cale nazală, se poate obţine
adaptarea virusului la organismul animalului, după 3-8 astfel de pasaje
oarbe.
4. Identificarea virusurilor gripale cultivate în sistemele biologice
-După cultivarea pe ouăle embrionate de găină, acestea sunt deschise
aseptic, recoltându-se lichidul amniotic şi alantoidian. Pentru identificarea
antigenelor virale se recurge la reactiile de hemaglutinare (HA),
hemaglutinoinhibare(HAI) şi reactia de fixare a complementului (RFC).
Printre aplicaţiile HA se numără şi detectarea şi titrarea virusurilor gripale.
Principiul HA: în contact cu o suspensie de hematii, virusurile
hemaglutinante, precum virusurile gripale, provoacă aglutinarea hematiilor.
Virusurile gripale se adsorb pe suprafaţa hematiilor prin intermediul
hemaglutininei şi se desprind de pe acest substrat cu ajutorul
neuraminidazei.
- În cazul culturilor celulare, identificarea se bazează pe evidenţierea
efect citopatic (ECP). Leziunile citologice în cazul virusului gripal de tip A
sunt de tip vacuolar, fiind însoţite de desprinderea celulelor din monostrat.
Virusul gripal de tip B produce ECP de tip granular, cu fragmentarea
celulelor, picnoză şi distrugerea monostratului celular.
- În cazul animalelor de laborator, trituratul din plămâni conţine
cantităţi mari de virus gripal, ce poate fi identificat prin: HA, HAI şi RFC.
II. DIAGNOSTICUL SEROLOGIC
Se investighează dinamica anticorpilor specifici pe perechi de seruri,
prima probă fiind recoltată cât mai precoce de la debutul bolii, iar cea de-a
doua după aproximativ 10-14 zile, în convalescenţă. Diagnosticul de gripă
este susţinut indirect, prin detectarea seroconversiei sau a unei creşteri
semnificative, de cel puţin 4 ori a titrului de anticorpi în proba a doua de ser,
comparativ cu prima.
Ca tehnici sunt utilizate în mod curent HAI şi RFC, recomandându-se şi
ELISA atunci când este posibil, datorită sensibilităţii crescute a acestei
metode.
HAI – reacţia de hemaglutinoinhibare
Prin HAI se investighează apariţia şi creşterea titrului anticorpilor

hemaglutinoinhibanţi. HAI este o reacţie de seroneutralizare, având ca
principiu inhibarea aglutinării hematiilor de către hemaglutininele virusurilor
gripale, atunci când acestea s-au unit cu anticorpii complementari.
Materiale necesare
-cele două probe de ser de cercetat, tratate pentru îndepărtarea inhibitorilor
specifici, inactivate la 56oC, timp de 30’ şi diluate 1/7 cu soluţie salină
izotonă;
-suspensiile de antigen gripal cu o concentraţie de 8 ori mai mare decât titrul
hemaglutinant stabilit prin HA;
-soluţie salină izotonă;
-o suspensie de hematii de cocoş 0,5%;
-microplăci cu godeuri;
-pipete automate şi conuri adecvate etc.
Tehnica de lucru
Se execută diluţii binare din serurile de cercetat, începând cu diluţia
1/7, în plăci sau microplăci de plastic cu godeuri, peste care se pipetează un
volum egal din suspensia de antigen ce conţine 8 UA. Plăcile se agită, se
acoperă cu un capac şi se lasă la temperatura camerei timp de 30’. După
aceea se adaugă un volum egal din suspensia de hematii de cocoş 0,5% şi
se lasă plăcile la temperatura camerei timp de 30-45’. Concomitent cu
probele de cercetat, se lucrează şi martorul antigen, martorul hematii,
martorul ser sigur pozitiv şi martorul ser sigur negativ.
Schema reactia HAI:
- Ac (ser pacient) + HA (hemaglutinine)= Ac-HA + Hematii bănuţ de
hematii R(+)
- 0 (absent Ac din ser) + HA= HA (libere) + H HA-H aglutinarea
=umbreluţă de hematii R(-)
Citirea şi interpretarea rezultatelor
Titrul de anticorpi hemaglutinoinhibanţi este dat de cea mai mare
diluţie de ser de cercetat la care mai apare o inhibare completă a HA.
Diagnosticul de gripă este susţinut de detectarea unei creşteri în dinamică de
cel puţin 4 ori a titrului de anticorpi HAI.
13. 1. Diagnosticul de laborator în hepatita B.
Diagnosticul de laborator în infecţiile cu virusul hepatitic B
I. Diagnosticul virusologic
1. Recoltarea produselor patologice: sânge, plasmă, ser etc.
2. Examenul direct al produsului patologic
Virion: microscopie electronică
Antigenele virale: agHBs şi agHBe, în ser, prin ELISA; agHBc în nucleul

hepatocitelor
DNA-polimeraza HBV
DNA-HBV
II. Diagnosticul serologic
ELISA: Anticorpii anti-HBs, anti-HBc (IgM) , anti-HBe
13.2. Diagnosticul de laborator în infecția produsă de virusul

imunodeficienței imune/SIDA.
Diagnosticul de laborator în infecţia cu HIV
I. Diagnosticul virusologic
1. Recoltarea produselor patologice: sânge, plasma, LCR, secreţie vaginală,

spermă, lacrimi, lapte, urină.
2. Evidenţierea directă a unor componente ale virionului în produsul

patologic:
- Antigene virale: p24 apar la 2 săptămâni după infecţie şi este confirmată

până în a 3-a lună de la infecţie dispar proteinele corespunzătoare
momentului când genomul viral este integrat în genomul umancel T4H
- RNA-HIV, DNA proviral, Reverstranscriptaza
3. Inocularea pe sisteme biologice şi izolarea tulpinii virale
Izolarea HIV în urma cultivării celulelor mononucleare din sângele

periferic sau secreţiile vaginale. Tehnica cea mai sensibilă este de cocultivare
a probelor cu celule mononucleare şi sângele periferic stimulat mitogenic.
După incubarea supernatantelor culturile celulare sunt evaluate pentru
activităţile revers transcriptazei şi prezenţei Ag P24
4. Identificarea HIV
În cultura de celule infectate cu HIV, ECP de tip sinciţial sau apar
celule balonizate.
Detectarea: antigenului p24 şi DNA proviral
II. Diagnosticul indirect - Serodiagnostic

Teste screening: ELISA pentru anticorpii anti-HIV
Teste de confirmare:Western Blot
ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) se bazează pe faptul că

elementul cunoscut este imobilizat pe suportul solid, iar elementul
necunoscut este depistat cu ajutorul reactantul marcat enzimatic
(conjugatul), reacţia fiind vizualizată prin adăugarea substratului
corespunzător enzimei folosite, prin dezvoltarea unei reacţii de culoare.
Tehnica de lucru în cazul serodiagnosticului prin ELISA indirectă:
Etapa I: Se introduce serul de testat în godeul ce conţine Ag cunoscut

(acesta este fixat pe godeu).
- Incubare urmată de spălare cu soluție tampon
Etapa II:
- Se adaugă conjugatul (anticorpi anti-anticorpi umani marcaţi cu o

enzimă)
- Incubare urmată de spălare cu soluție tampon.
Etapa III:
- Se adaugă substratul pentru enzima respectivă.
- Incubarea apoi Stoparea reacţiei.

Martorul + (realizat cu un ser ce sigur conţine elementul pe care îl căutam)
trebuie să fie colorat.
Martorul - (realizat cu un ser ce sigur nu conţine elementul pe care îl

căutam) trebuie să fie incolor.
Dacă martorii sunt buni, se citeşte şi se interpretează proba propriu-zisă

(serul de cercetat).
Citire: Aspect macroscopic: lichid colorat (galben), proba este pozitivă şi

deci, în serul de cercetat există elementul căutat (ex. Ac. anti-HBs, dacă s-
au folosit plăci cu AgHBs fixat pe godeu).
Aspect macroscopic: incolor, proba este negativăşi în serul de cercetat nu

există elementul căutat(Fig. 13.1).
Fig. 13.1 Schema reacţiei ELISA
13.4. Diagnosticul de laborator în candidoza bucală.

Candidoza este dată de Candida albicans, care poate face parte din
flora normal, produce pseudohife prezente atât în produse patologice cât şi
în cultură.Diagnosticul poate fi micologic (direct) sau imunologic (indirect)
Diagnosticul direct de laborator
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic

Se recolteaza cu tamponul steril -de pe limbă,
- de pe mucoase,
- de pe pilieri,
- din şantul gingival cu ajutorul vârfurilor

de hârtie,
2. Examenul direct de laborator

Macroscopic tamponul -în special cel recoltat de pe limbă poate să fie ceva
mai încărcat cu o masăalbă.
Microscopic: Frotiul colorat Gram prezintă formaţiuni rotunde uşor ovalare

G(+)(blastoconidii)(vezi Fig.13.2.) hife de lungimi diferite, sau stadii diferite
ale formării tubilor germinativi din blastoconidii. Se potface şi frotiuri AM
şinative lamă- lamelă.
Fig.13.4. Candida frotiu din produs

patologic colorat gram,
blastoconidii G (+) (foto C. Defta)

3. Insămânţarea
Se face pe mediu Sabouraud (cu cloranfenicol, gentamicina şi
ciclohexidina) fie în placă sau pe mediu în plan înclinat. Incubarea se face la
28 de grade între 48-96 de ore
4. Identificarea se face prin examinarea caracterelor:

- Macroscopice colonii de tip S rotunde, bombate, netede, albe, cu miros
caracteristi de lapte acru;
- Microscopic hife G
- \]6(+)lungi care se 5;
- Biochimic fermentează glucoza, maltoza, zaharoza, trehaloza, galactoza;
- Teste antigenice: aglutinarea pe lamă, latex-aglutinarea.
5. Antifungigramă.
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN AFECȚIUNILE ORALE –

PARODONTOPATII, INFECȚII DE CANAL etc
1. Recoltarea și transportul produselor patologice:

Se face de la pacienții examinați clinic și care nu urmează nici un
tratament medicamentos sau chirurgical în sfera orală. Prelevările se
efectuează ținând cont de anumite norme de recoltare a probelor, care
încălcate pot influența celelalte etape ale examenului microbiologic.
1.1. Recoltarea probelor din leziuni de pe suprafaţa gingiei și din pungile

parodontale:
a) Recoltarea cu tamponul steril, astfel se îndepărtează debriurile alimentare
urmată de izolarea zonei cu rulouri și aspiratorul de salivă, se dezinfectează
zona din jurul leziunii. Cu tamponul steril se şterge zona lezată prin rotirea
tamponului, în finalacesta este introdus într-un tub steril care se notează.
Dacă leziunea este profundă, se recoltează două probe, în acelaşi mod, una
pentru identificare bacteriilor aerobe, alta pentru identificare bacteriilor
anaerobe.
Tuburile sunt însoțite de o fișă de identificare care cuprinde date despre

pacient: nume, prenume, vârstă, sex, regiunea de recoltare a probei,
elemente legate de istoricul bolii. Transportul la laborator se face în interval
de maxim 1/2 oră.
b) Recoltarea cu conuri de hârtie de filtru sau meșe foarte subțiri. Etapa

preliminară de igienizare și izolare a zonei este identică cu cea prezentata
anterior.Apoi se scoate, cu o pensă sterilă, conul de hârtie de filtru sau meșa
foarte subțire din tubul Eppendorf steril, se introduc în pungile parodontale,
având grijă să se evite contaminarea suplimentară prin atingerea fie de
dinte, fie de peretele gingival al pungii parodontale, cu vârful ascuţit, în
regiunea incriminată pentru recoltarea probei patologice, se menține un
minut pentru o bună îmbibare cu produs patologic.Apoi conul de hârtie/meșa
se introduce într-un tub cu soluție Ringer. Obligatoriu se recoltează două
probe. Se noteaza tubul iar transportul se face în interval de maxim 1/2
orăla laborator.
1.2. Recoltarea probelor din canalul radicular
- Se deschide camera pulpară cu ajutorul unei freze sterile. Se introduc

succesiv conuri de hârtie sterile în canal până la nivelul regiunii apicale; se
lasă fiecare con pe loc timp de 30 de secunde. Se pompează 3 - 4 picături de
ser fiziologic cu ajutorul unei seringi pe canal în absența puroiului sau
exudatului și se absoarbe maximum de lichid cu ajutorul conurilor de hârtie.
Sau se introduc conurile de hartie în șanțul gingival se lasă 30 de secunde
pentru încărcare cu produs patologic.Se introduc aceste conuri de hârtie într-
un tub cu mediu de transport, de obicei mediu Ringer, transportul se face
rapid la laborator maxim ½ oră.
2. Examenul direct de laborator

Macroscopic – în cazul leziunilor conice se constată prezența urmelor
purulente și de cele mai multe ori sanghinolente însoțite și de miros neplăcut
Microscopic – se efectueazăfrotiuri colorate Gram, pe care se vor observa

numeroase aspect morfologice de la coci G + la coci G- dar și bacili G+ și G-
de mărimi și dimensiuni diferite. Preponderența unora sau altora va fi dată
de tipul și stadiul bolii parodontale. Astfel,în formele profunde a
parodontopatiilor cornice se vor observa frecvente forme spiralate alături de
flora preponderant gram negativă. De asemenea,pe frotiuri vor fi prezente și
leucocite de tipul PMN-relor dar și celule epiteliale.
3. Însămânţarea
Se face pe mediile speciale și medii selectiveTSA (triptic soy agar) cu ser,
vancomicina si bacitracina, Columbia cu 5% sănge de berbec și Schaedler cu
5% sânge de berbec suplimentat cu menadionă, Sabouraud, MacConkey și
mediu Chocolate. Tehnica de însămânțare folosită este cea a pentagonului cu
arderea și răcirea ansei înainte de începerea sectorului următor cu scopul de
a obtine colonii izolate.
Plăcile cu mediu Columbia și MacConkey se incubează aerob la

termostat,mediu Chocolate și Columbiasunt incubate în jar în atmosferă
îmbogățită cu 5% C02,jarul închis ermetic este introdus la termostattimp de
24-48 ore la 37°C. Plăcile cu Schaedler și cu TSA se incubează în atmosferă
anaerobă obținută cu amestecuri reducătoare care se introduc în jar înainte
de închiderea ermetică, incubarea se facela 37°C, timp de 2-7 zile la
termostat.MediulSabouraud se introduce la termostatul de 420C în condiții de
aerobioza, timp de 2-7 zile.
4. Izolarea și Identificarea se face prin examinarea

caracterelor:
-Izolarea: creșterea bacteriană se studiază cu ochiul liber și cu lupa, la 24
ore și 48 ore în cazul plăcilor cu mediu Columbia, MacConkey, iar pentru
Schaedler, la 48 ore și la 7 zile, estimându-se toate tipurile de colonii ce
apar. Subculturile se vor efectua în dubluastfel: de pe Columbia, MacConkey,
Chocolate se vor repica câte 2-3 colonii din fiecare tip, pe câte 2 plăci
Columbia în sectorcele două vor fi incubate una aerob și a doua anaerob, la
37°C, timp de 24-48 ore. De pe mediul Schaedlerse vor repica câte 1-3
colonii din fiecare tip, în sector, pe câte 2 plăci Columbia, una fiind incubată
în atmosferă îmbogățită cu 5% CO2, iar a doua anaerob, la 37°C, timp de 48
ore.
-Identificarea: se urmăresc trei caracteristici și anume macroscopice,

microscopice și biochimice.
Macroscopic saucaracterele de cultură,se urmărește aspectul coloniilor și

mirosul culturii pe mediile însămânțate, în cele trei condiții de incubare,
clasificându-se în aerobe, anaerobe și facultative anaerobe. Se face
descrierea coloniilor după: dimensiune, formă, margini, suprafață, relief,
consistență, miros, culoarea coloniilor și aspectul eventualei zone de
hemoliză.
Exemplu: Coloniile de Aggregatibacter actinomycetemcomitans (fostul

Actinobacillul actinomycetemcomitans) prezinta colonii translucide, netede,
nehemolitice,cresc foarte bine pe TSA cu vancomicinăși bacitracină.
Bacteroides fragilis crește greu da colonii gri sau translucide, Prevotella și
Porphyromonas acestea au colonii pigmentate cu negru. Fusobacteriile au
colonii medii cu pigment negru și miros puternic de sulf similar halenei
bucale.Coloniile de streptococci sunt mici cu hemoliză de tip alfa în jur, mai
rar beta în funcție de specie.
Speciile de Actinomyces dau colonii mici alb-cremoase, aderente pe

mediile cu sânge.
Speciile de streptococci orali (grupul mutans, salivarius, anginosua, mitis)

dau hemoliză de tip alfa dar sunt și tulpini nehemolitice și puține beta
hemolitice, coloniile sunt mici și plate.Unele dintre ele cu mirosuri
caracteristice.
Wolinella prezintă colonii uscate difuze sau ce corodeazămediul de

cultură. Genul Capnocytophaga pot fi colonii cu margini neregulate de
culoare: roze,galbene sau albe. Eikenella corodens dă colonii ce corodează
mediul de unde și numele
Stafilococii au colonii mari de culoare galbenă sau aurie, cresc în

aerobioză, cu hemoliză de tip beta.
Exemple de imagini microscopice: Streptococi orali sunt în lanțuri

G(+).Peptostreptococii coci G (+) anaerobi frecvent izolați din plăcile
subgingivale, parodontopatii și abcesele dentoalveolare. Lactobacilii sunt
bacilli G(+) izolați din plăci supragingivale. Propionibacteriile bacilli G (+)
numiți “difteroizi” datorită asemănării, se pot izolași din plăcile dentare.
Actinomyces sunt bacili filamentoși ramificați G(+)imobili, nesporulați izolați
din gingivite în număr mare și din cariile rădăcinii.Aggregatibacter
actinomycetemcomitansprezintă bacili mici scurți, drepți sau curbați cu
capete rotunjite. Eikenellacorodens izolata din parodontopatii, este un
cocobacil scurt G(-). Prevotella spp.bacilli imobili G (-) iar Porphyromonas
bacilli pleomorfi scurti G (-), Fusobacteriile forma de “trabuc” cu capetele
ascutite G (-)
Biochimic: Identificarea se face cu ajutorul sistemului Rapid ID32 Strep

(pentru grupul Streptococilor) și sistemului rapid ID 32 A (pentru anaerobi)
(Bio-Merieux)respectând tehnica de lucru recomandată de producător astfel:
Pregătirea inoculului:Cu ajutorul unui tampon de vată steril, se prelevează

colonii de pe plăcile cu colonii izolate, realizându-se o suspensie într-un tub
cu 3 ml de apa distilată turbiditate corespunzătoare din tub trebuie sa fie
conformă etalonului de 4 McFarland.
Inocularea godeurilor aparținând galeriei:Seiaucu o pipetă automată câte

55μl de suspensie bacterienă careintroduce în cele 32 godeuri ale galeriei,
iar după acoperirea cu capacul corespunzător, aceasta va fi incubată în
aerobioza,timp de 4h, la 37°C.
Citirea reacțiilor:Citirea galeriei se face cu ochiul liber, respectând indicațiile

din tabelul de interpretare a reacțiilor. Pentru unele dintre teste sunt
necesari reactivi suplimentari, citirea se efectuează dupa 5' de la adăugarea
acestora. Astfel, testul VP producerea de acetoină se va pune o picătură de
reactiv VP A (KOH 20%) și una de reactiv VP B (α-naftol 12%). Se adaugat
apoicâte o picătură de reactiv FB (Fast Blue BB 0,35%) cu scopul puneri în
evidență a eliberarii de: alanil-fenilalanil-prolin arilamidază -testul APPA, β-
galactozidază -testul βGAL, acid piroglutamic arilamidaza - testul PyrA, N-
acetil-β-glucozaminidază - testul βNAG și respectiv glicil-triptofan
arilamidaza -testul GTA. În final, reactivul NIN (ninhidrină 7%) câte o
picătură pentru hidroliza hipuratului (testul HIP).
Interpretarea reacțiilor: Producătorul furnizează formulare pentru notarea

rezultatelor reacțiilor, cele 32 de teste sunt grupate câte 3, cu excepția
ultimilor 2, care reprezintă un ultim grup. Dacă testul a fost negativ,
indiferent de poziția lui în cadrul grupului, a fost notat cu 0, iar daca a fost
pozitiv și totodata primul din grup s-a notat cu 1. În caz că era pozitiv, dar
era al 2-lea test din grup, a primit valoarea 2, iar dacă a fost al treilea din
grup s-a notat cu 4. Așa încât, valoarea oricărui grup a fost conferită de
suma valorilor celor 3 teste, iar în cazul grupului final, de suma valorilor
celor 2 teste. Se obține în finalun număr din 11 cifre (reprezentând valorile
grupelor) decodificarea se face cu programul APILAB Plus, identificându-se
specia.
5. Antibiogramă se efectueaza pe mediul Müller -Hinton in conditii de

anerobioza.

Carte 2023

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Carte 2023

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

LUCRAREA PRACTICĂ 1

1.1. Organizarea și funcționarea laboratorului de microbiologie.

Organizarea și dotarea laboratorului trebuie să satisfacă următoarele cerințe:

- Să usureze investigațiilenecesare recunoașteriimicroorganismului

Mobilierul aflate in laborator:

- mese de lucru din metal coperite cu plăci de faianță. Pe mesele cu faianță

- dulapuri din metal;

-becuri Bunsen, sursă de apăși de gaze;

-ansa bacteriologică pentru însământare, repicarea culturilor, prepararea

-găleți de metal cu capac pentru colectarea materialului infecțios;

- autoclav, etuvă termoreglabilă –pupinel, centrifugă, termostat reglabil,

- truse de reactivi necesar colorațiilor Gram, Ziehl-Neelsen, May-Grümwald-

- microscoape, balanțe, pompe de vid, stelaje, coșulețe metalice, trepiede cu

-aparat de preparat apa distilată;

Sticlăria de laborator: eprubete, tuburi, plăcii Petri de diametre

1.2. Normele de protecție a muncii în laboratorul de microbiologie.

- echipament de protecție (halat din material textil);

1.3. Metode de sterilizare.

În sterilizarea incompletă sau decontaminarea sunt omorâte numai

Rolul sterilizarii este de protecție atât a probelor câtși a personalului de

Moartea celulelor bacteriene reprezintă pierderea ireversibilă a

Clasificarea metodelor de sterilizare:A. Sterilizarea prin Agenți Fizici:

B. Sterilizarea prin Agenți

• Pregatirea materialului pentru sterilizat :

A. Prin Agenți Fizici

I.a. Căldură Uscată.Prin acest mecanism microorganismelesunt oxidate

instrumentarului metalic din laborator deoarece în timp acesta se

2. Flambarea –constăîn trecerea materialului prin flacară de câteva

I.b. CaldurăUmedă. Este cea mai eficientă metodă de sterlizare.

1. Fierberea constăîn încălzirea la 1000C timp de 30 de minute din

II. Filtrare. Metoda constăîn trecerea lichidului printr-o substanță poroasăîn

1. ionizante– radiații α,β,γ necesită instalații speciale împotriva radiațiilor, au

2. neionizante – radiații UV acestea sunt absorbite de acizii nucleici și

3. sterilizarile cu fascicole de neutroni, necesită instalații speciale, folosite în

IV. Ultrasunetele acestea sunt bactericide prin efectul lor de cavitație pe

Bactericid –agenți sau substanțe care omoară bacteriile.

Bacteriostatic –agenți sau substanțe care pot oprii dezvoltarea bacteriilor.

B. Sterilizarea prin Agenți Chimici:

I. gazoasăcu *etilenoxidul distruge bacteriile în formă vegetativă și unii

*clorul gazos dezinfectează apa potabilă,

* vapori de azot, β-propiolactona, aldehida formică sub forma

II. prin soluții

–dezinfectantesunt substanțele care în concentrațiile lor active sunt iritante

-antisepticesubstanțele chimice care în doze active nu sunt toxice pentru

Controlul sterilizării:Se face prin indicatori fizici, chimici şi biologici.

Indicatorii fizici: termometre, manometre,ce se vor aşeza în interiorul

Indicatorii chimici: se folosesc substanţe cu punct de topire cunoscut:

Indicatorii fizici și chimici ne ajută să verificăm dacă temperatura de

Indicatorii biologici: se folosesc sporii ce rezistă la temperaturi ridicate (spori

Fig. 1.7. Fiole de stearotest la sfârșitul sterilizării și

2.1.Norme privind recoltarea și transportul produselor patologice în

diagnosticului de laborator în infecțiile bacteriene.

Produs patologic :materialul biologic în care suspectăm existenţa unor

Exemple de produse patologice: sânge, urină, materii fecale,exsudat naso-

Examenul microbiologic va oferi un rezultat corect doar in condiţiile

Reguli privind recoltarea produsului patologic:

• recoltarea se face înaintea instituirii tratamentului cu antibiotic sau

• obligatoriu se folosesc recipiente şi metode sterile pentru prevenirea

• recoltarea trebuie efectuată cât mai aproape de debutul bolii, sau în

• produsul patologic trebuie recoltat într-o cantitate suficientă şi din

• în unele cazuri trebuie folosite medii de transport;

• produsul să fie însoţit de un bilet de trimitere completat corect;

• probele să fie etichetate şi transportate la laborator în cel mai scurt