Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Metode care utilizeaz ageni fizici: cldura ( uscat, umed), radiaii UV, filtrarea, ultrasunetele.
Metode care utilizeaz ageni chimici: substane antiseptice, substane dezinfectante.
Metode care utilizeaz cldura uscat: incinerarea, nclzirea la rou, flambarea, sterilizarea cu
ajutorul aerului cald.
Metode care utilizeaz cldura umed: fierberea, pasteurizarea, tindalizarea, autoclavarea
Principul metodelor care se bazeaz pe cldur- n cursul operaiei are loc degradarea proteinelor
microbiene pn la calcinarea materialului biologic. Cldura realizeaz distrugerea formelor vegetative la
temperatura de 50- 60o C cam n 30 de minute. Dac se crete temperatura la 70o C formele vegetative sunt
distruse n 10 minute. La 20o C cu cldur umed i la 100o C cu cldur uscat sunt distrui sporii.
Incinerarea const n arderea materialului biologic n cuptoare speciale sau crematorii. Prin aceast
metod sunt distruse cadavrele animalelor scoase din exploatare ca i vata i tifoanele infectate.
nclzirea la rou este folosit pentru ansele bacteriologice care sunt meninute n flacra becului de
gaz pn la rou, mai nti la baza flcrii, apoi la vrf. Ansa se sterilizeaz obligatoriu nainte i dup
utilizare.
Flambarea const n trecerea prin flacra becului de gaz de cteva ori a obiectului care se
sterilizeaz- lame de sticl, pipete gradate, pipete Pasteur, nainte de sterilizare, idem mnerul ansei i gtul
eprubetelor i baloanelor nainte i dup utilizare.
Sterilizarea cu aer cald este cea mai eficient msur de sterilizare cu cldur uscat. Carbonizarea
materiei vii se face n etuve la 180o C timp de o or. Este o metod de sterilizare complet: se sterilizeaz
sticlria de laborator, instrumentarul chirurgical. Nu se pot steriliza seringile cu armtur metalic i
obiectele de cauciuc. Obiectele se pregtesc pentru sterilizare astfel: sticlria s fie bine splat i perfect
uscat. Se mpacheteaz n hrtie de ambalaj fiecare obiect n parte. Toate eprubetele i baloanele se astup
cu dopuri de vat nvelite n tifon, se leag cu sfoar i li se aplic un capion de hrtie. Pipetele se
ambaleaz individual, sau n cilindrii metalici. Vata, compresele, pansamentele se sterilizeaz n casonete
speciale (cutii de tabl cu perei dubli) peretele intern prezint orificii i peste el se afl o centur metalic
ce astup orificiile dup ncetarea sterilizrii. Controlul sterilizrii la etuv se face amplasnd pe lng
materialele de sterilizat, tubuoare de sticl care conin zaharoz al crei punct de topire este de 170o C Dac
zaharoza este caramelizat nseamn c s-a atins temperatura necesar. Temperatura nu trebuie depit
pentru c vata i hrtia ard producnd substane inhibitoare pentru microorganisme.
Cldura umed are o putere de penetrare mai mare- distruge microorganismele hidratate n timp
mai scurt i la o temperatur mai sczut dect cldura uscat.
Fierberea const n fierberea instrumentelor chirurgicale, seringilor la 100o C timp de 20- 30 minute.
Fierberea nu este o metod complet, sporii nu sunt distrui. Se face n fierbtoare electrice sau cu gaze i se
recomand s se foloseasc ap distilat pentru a evita depunerea srurilor. Se recomand adugarea a 4- 5%
carbonat de sodiu sau borax care ridic cu cteva grade punctul de fierbere i mpiedec ruginirea. Teoretic
obiectele sterilizate pot fi utilizate 24 de ore. Se recomand folosirea lor imediat.
Pasteurizarea este sterilizare incomplet, sunt distruse numai formele vegetative, nu i sporii. Este
folosit la stilizarea laptelui i a berii. Se face prin nclzirea produsului la 56- 90o C timp de 30 minute.
nclzirea se face pe baie de ap. Produsele astfel sterilizate se pstreaz ambalate ermetic la 4o C pn la
momentul folosirii pentru a mpiedeca germinarea sporilor.
-streptococ
- stafilococi
Bacterii cilindrice ( bacili )- celule alungite- bastona, dar sunt i forme de tranziie, ntre coci i
bastonae- cocobacili. Capetele bacililor pot fi:
- rotunjite
-
tiate drept
ascuite
picot
-izolai
grupai cte-doi
Pot fi:
- n palisad
-streptobacili
- n rozet
diplococi
Corynebacterium diphteriae
Lactobacillus sp.
Agrobacterium stellatum
-grupri neregulate
Vibrio cholerae
Spirillum volutans
Treponema pallidum
Leptospira sp.
5. Bacterii ptrate.
Descoperite n 1980 n Sinai de Walsby. Aparin genului Qadra, grupul Arhebacteriilor.
n afara tipurilor de baz sunt i forme rare de bacterii: bacterii pedunculate, bacterii care
nmuguresc, bacterii cu apendici acelulari rezultai din produi de excreie, bacterii care formeaz trichoame
(lanuri de bacterii reunite de o teac polizaharidic comun, dar pot tri i izolat).
Minicelulele- sunt corpusculi mici, sferici care nu cresc, ei se formeaz printr-o septare neobinuit a
celulelor bacteriene. Se formeaz la extremitatea unor bacterii- Escherichia coli, Bacillus subtilis,
Salmonella i Vibrio. Aceste minicelule nu au material nuclear, nu cresc i nu se divid, au totui metabolism
propriu (cu enzime) sunt rezistente la radiaii ionizante. Sunt importante pentru cercetare, vor fi folosite ca
vaccinuri vii.
Dop
Sarcina lutea
15.08.2001
Geloz
Temperatura optim
timp de 24 de ore
Mediu
lichid
Dup inoculare se observ tulburarea mediului de cultur datorit multiplicrii celulelor bacteriene.
Se obine o cultur bacterian n mediu lichid.
nsmnarea mediilor solide.
Sunt dou variante:
nsmnarea mediilor solide nclinate cu o cultur microbian dezvoltat n mediu lichid.
nsmnarea se face cu pipeta.
nsmnarea mediilor solide nclinate, cu o cultur microbian dezvoltat pe mediu solid se face cu
ansa bacteriologic
Tehnica de lucru. Se recolteaz aseptic n bucla ansei o poriune de cultur (inocul) . Se introduce ansa
n mod aseptic n eprubeta cu mediu nclinat steril, pn la fundul eprubetei unde este o pictur de ap de
condensare. Se omogenizeaz inoculul n aceast pictur, apoi se traseaz pe suprafaa gelozei striuri n
zigzag de la fundul spre gura eprubetei.
inocul
pictur de lichid
de condensare
striuri n zig-zag
Se incubeaz la temperatura de
dezvoltare a germenului 24-48 ore
cultur bacterian
- Tehnica nsmnrii n pnz prin inundare: se aspir cu pipeta 2-3 ml din suspensia bacterian
dens, se las s se scurg tot volumul de lichid pe suprafaa gelozei astfel ca s fie acoperit toat suprafaa
inocul
exces de
inocul
mediu
suspensie bacteriologic dens
n ap fiziologic steril
cu inocul, se nclin placa i cu aceeai pipet se extrage excesul de inocul. Se noteaz pe capacul plcii
numele culturii i se incubeaz la temperatura optim 24- 48 ore.
-nsmnarea cu ajutorul tamponului de vat
Se mbib tamponul n suspensia bacterian, se preseaz de pereii interiori ai eprubetei pentru a
ndeprta excesul de inocul pe suprafaa plcii cu geloz se traseaz striuri foarte apropiate n zig- zag pe
toat suprafaa plcii nti pe o direcie, se rotete placa cu 90o, se traseaz din nou striuri foarte apropiate,
apoi un striu marginal. Dup incubare se va observa c ntreaga suprafa a mediului de cultur este
acoperit cu un strat uniform de celule- se obine o cultur n pnz. nsmnarea n pnz se face pentru
obinerea de mas celular bogat, pentru realizarea tehnicii autobiogramei i n cazul culturii
bacteriofagilor.
Tampon
de vat
pasive- datorate nclinrii platinei- sunt micri ntr-un singur sens. Dup examinare preparatul se pune ntrun cristalizor cu soluie desinfectant- clorur mercuric 2 %.
II. Germeni omori prin diferite procedee de fixare i colorare pe preparate fixe numite frotiuri.
Examinarea frotiurilor permite studierea morfologiei germenilor, evidenierea unor structuri intra i
extraparietale. Frotiul este un preparat microbiologic etalat pe lame microscopice. Pot fi executate din culturi
microbiene dezvoltate pe mediu solid cu ajutorul ansei, sau din cultur lichid cu pipeta Pasteur.
Materiale necesare : Culturi microbiene, ap fiziologic steril, ans bacteriologic, stative de
colorare, creion de scris pe sticl, lame curate i degresate. nainte de efectuarea frotiului lamele se
flambeaz pe faa pe care se va efectua frotiul.
Timpii de lucru.
1. Etalarea. ntr-o pictur de ap fiziologic steril luat n bucla ansei i pus pe lam se omogenizeaz o
cantitate mic de cultur recoltat n bucla ansei. Etalarea se face cu ajutorul ansei prin micri
circulare concentrice. Frotiul trebuie s fie subire i uniform pentru a mpiedica suprapunerea
germenilor. Suprafaa de etalare se mrete, frotiul nu trebuie s depeasc marginile lamei.
2. Uscarea. Se face la temperatura camerei, nu se recomand agitarea n aer .
3. Fixarea. Se face cu cldur sau ageni chimici. Se trece lama cu faa opus frotiului prin flacra becului
de gaz de cteva ori. Fixarea este ncheiat cnd lama frige. Se controleaz temperatura trecnd-o pe
dosul palmei stngi. Fixarea cu ageni chimici- metanol, etanol, sau alcool- eter. n cursul operaiei de
fixare, germenii sunt omori. Se nltur posibilitatea infectrii, preparatul ader mai bine la lam, se
mrete i afinitatea pentru colorani. Pentru efectuarea frotiului din mediu lichid se procedeaz la fel,
dar se folosete pipeta Pasteur.
4. Colorarea. Se datoreaz reaciei de combinare ntre anumii colorani i unii constitueni ai celulelor
bacteriene. Coloranii utilizai sunt substane organice din grupul anilinei, extrai din gudroanele de
huil sau substane chimice de tipul srurilor cu caracter bazic sau acid: fucsina bazic, violet de
genian, albastru de metilen, fucsina acid, eozina
Metode de colorare utilizate.
Simple, cnd se folosete aciunea unui singur colorant.
Difereniale, cnd acioneaz 2 sau mai muli colorani
Speciale sau selective, se utilizeaz colorani selectivi care evideniaz anumite structuri celulare.
Coloraia simpl cu fucsina. Frotiul se fixeaz la flacr. Colorarea cu soluie de fucsina bazic
soluie 1% hidroalcoolic fenicat din care se prepar soluia de lucru 1/10. fucsina se menine pe lam un
minut. Se spal cu ap de robinet, se usuc la aer, se examineaz la microscop cu obiectivul de imersie ntr-o
pictur de ulei de cedru. Bacteriile sunt colorate uniform, ceea ce constituie un artefact datorat faptului c
diferite componente celulare, dei au structuri diferite au afinitate aproape egal pentru coloranii bazici.
coloraia simpl se face n scop orientativ. Dac e vorba de o cultur pur se poate observa tipul morfologic
al germenilor i confirmarea puritii culturii. Dac frotiul este fcut din preparat natural se poate constata
prezena, microorganismelor, tipul i densitatea lor.
Coloraia Gram.
A fost introdus n practica microbiologic de Gram. Se utilizeaz aciunea a doi colorani: fucsin
bazic i violetul de genian, este o coloraie diferenial- difereniaz toate bacteriile n dou grupe: Gram
pozitive i Gram negative, care se bazeaz pe diferenele structural biochimice i biologice, dar n special pe
structura diferit a peretelui celular. Este o coloraie cu valoare taxonomic, descrierea ncepnd cu
caracterul Gram .Descrierea metodei. Frotiul este fixat la flacr. Se coloreaz cu soluie de violet de genian 1%
care se menine pe lam 1-2 minute, apoi colorantul se scurge i preparatul se spal cu ap. Toate bacteriile
se coloreaz n violet.
Mordansarea cu soluie Lugol 1:2:300 iod, iodur de potasiu, ap distilat. Soluia se menine pe
lam 2-3 minute. Preparatele nu se spal. n timpul acestei operaii iodul formeaz cu violetul de genian un
complex iodat cu greutate molecular mare care la unele bacterii este stabil, la altele este instabil.
Decolorarea cu alcool aceton (3-1) se menine 5- 7 secunde pe lam, apoi se face o splare
abundent cu ap pentru a opri aciunea decolorantului.
Recolorarea cu soluie de fucsin bazic 1%, 1/10. se menine pe lam un minut. Preparatul se spal
cu ap, sunt uscate i se examineaz la microscop cu obiectivul de imersie. Celulele la care complexul este
instabil se decoloreaz i vor fi recolorate cu fucsin n rou, celelalte rmn colorate n violet .
Interpretarea observaiilor. Dac preparatul este dintr-un amestec de germeni- unele bacterii vor fi
colorate violet- Gram +, altele n rou- Gram .
Principiul coloraiei Gram. Coloranii bazici au mare afinitate i reacioneaz cu componentele
acide din citoplasma bacteriilor, iar dup tratarea cu soluia Lugol se formeaz un complex iodat stabil. La
Gram pozitive i instabil la Gram negative care trebuie colorate apoi cu un colorant de contrast pentru
evideniere. Ipoteza acceptat este c un rol esenial n colorare l are peretele celular. Coloraia Gram
depinde foarte mult de vrsta culturii bacteriene. Numai culturile tinere permit o coloraie i o interpretare
corect. Pe msur ce mbtrnesc i schimb comportamentul- bacteriile Gram pozitiv se coloreaz ca i
cele Gram negativ.
Bacterii Gram pozitive. Bacilii sporulai- Bacillus subtilis, Bacillus aureus, specii ale genurilor
Staphylococcus, Streptococcus, bacteriile lactice- Lactobacillus.
Bacterii Gram negative. Escherichia coli, Proteus, Salmonella, gonococul- Neisseria, se comport
la fel toate celulele eucariote, cu excepia drojdiilor.