TEHNICI DE STERILIZARE A OBIECTELOR ÎN LABORATORUL DE

MICROBIOLOGIE

Distrugerea microorganismelor sau sterilizarea este indispensabilă pentru pregătirea materialului

de lucru şi a mediilor de cultură.
Un produs este considerat steril când nu mai conţine forme de microorganisme ce pot fi
revitalizate. Există mai multe procedee de sterilizare care corespund diferitelor tipuri de materiale ce
trebuie tratate. În laboratorul de microbiologie de analize de rutină, căldura reprezintă modalitatea de
sterilizare cea mai întrebuinţată.

STERILIZAREA PRIN CĂLDURĂ

Căldura “umedă” Sterilizarea prin căldură “umedă” se efectuează în autoclavul cu aburi prin
procedeul de autoclavare.
Principiu: În atmosfera de vapori de apă sub presiune, toate bacteriile (inclusiv formele sporulate)
sunt omorâte după 20 minute la 1210C. Aceasta este metoda cea mai eficientă de sterilizare.
Autoclavul permite:
- pregătirea materialului (medii de cultură, diferite obiecte) în vederea utilizării în laborator, prin
distrugerea microorganismelor;
- decontaminarea materialelor după folosirea în laborator (cel puţin 30 minute la 1210C).
Microorganismele din produsele patologice, eşantioanele de apă şi produse alimentare analizate, din
culturile microbiene de laborator etc, trebuie neapărat distruse.
Aceste două operaţii ar trebui efectuate de preferinţă în două autoclave diferite sau, cel puţin,în
mod separat.
Timpul de sterilizare
Duratele de sterilizare sunt date doar pentru obiecte, medii de cultură sau alte substanţe ce
trebuie sterilizate în autoclav pentru analizele de rutină.
Materialul sterilizat Temperatura (0C) Presiunea (barr) Timp (minute)
Sticlărie curată 121 1 20
Apă , ser fiziologic 121 1 20
Parafină 121 1 20
Săruri minerale 121 1 20
Medii curente (bulion nutritiv, 121 1 15 - 20
geloză nutritivă)
Lapte degresat 115 0,7 15
Medii conţinând substanţe 110 0,5 20
termolabile (ex. glucide)
Glucoză în soluţie 110 0,5 20
 Controlul eficienţei sterilizării prin autoclavare este realizat adesea cu ajutorul unor indicatori de
sterilizare cum sunt hârtiile indicatoare: sunt comercializate benzi de hârtie special imprimate pentru a
vira culoarea dacă au fost îndeplinite condiţiile de sterilizare.
Pasteurizarea
Sterilizarea trebuie să fie deosebită de pasteurizare, care reprezintă doar un procedeu de
conservare utilizat în industria alimentară. Pasteurizarea constă în tratarea produsului la o temperatură în
domeniul 560C - 850C, o durată variabilă de la câteva minute până la o oră, în mediu umed, în funcţie de
produs.
În aceste condiţii, majoritatea celulelor vegetative bacteriene sunt distruse, dar nu şi formele
sporulate.
Tyndalizarea
Tyndalizarea constă în 2 - 3 pasteurizari repetate, alternate cu perioade în care proba este
menţinută în condiţii favorabile pentru germinarea endosporilor bacterieni, care devin vulnerabili
trecând în stare vegetativă şi sunt distruşi prin pasteurizare. Tyndalizearea se poate realiza în baie de
apă, de exemplu, în următoarele condiţii: încălzire la 560C (până la 800C) timp de 1 oră, 3 - 7 zile
consecutiv, cu un interval de 24 de ore.
Tyndalizarea se poate folosi pentru distrugerea microorganismelor în mediile ce conţin substanţe
termolabile.
Căldura “uscată”
Sterilizarea prin căldură “uscată” se efectuează în sterilizatoarele cu aer cald (etuve).
Căldura “uscată” nu poate distruge bacteriile şi în special sporii bacterieni, decât la o temperatură
mai ridicată ca în cazul căldurii “umede”. Tratamentul pentru sterilizare cu căldură “uscată” este de 4
ore la 1400C sau 1 oră la 1800C.
Un alt procedeu de sterilizare prin căldură “uscată” este flambarea, care se efectuează în flacăra
becului de gaz pentru: extremitatea firului ansei, exteriorul pipetelor, gâtul eprubetelor şi al flacoanelor.

ALTE PROCEDEE DE STERILIZARE

Sterilizarea prin filtrare

Filtrarea constă în trecerea unui produs lichid printr-un perete poros sau o membrană care reţine
bacteriile. Se pot utiliza filtre de portelan (Chamberland), de sticlă poroasă sau membrane tip
“Millipore”, cu pori de diferite dimensiuni.

Sterilizarea prin gaze toxice

 Oxidul de etilen, de exemplu, este foarte utilizat pentru sterilizarea materialului medico-
chirurgical, a materialelor din plastic numite “sterile, de unică folosinţă” din industrie.
Sterilizarea cu ajutorul radiaţiilor
Radiaţiile ultraviolete - sunt radiaţii cu utilizare curentă în laboratorul de microbiologie; ele sunt
bactericide, dar nu distrug sporii bacterieni. Acest tip de radiaţii acţionează în mod direct şi au putere de
penetraţie scăzută (câţiva milimetri). Lămpile “germicide” al căror efect se bazează pe acţiunea
radiaţiilor UV cu lungimea de undă de 254 nm sunt utilizate :
- pentru sterilizarea apei
- pentru sterilizarea incintelor şi a aerului ambiant
Radiaţiile gamma
Radiaţiile gamma fac parte din categoria radiaţiilor ionizante şi au un efect puternic microbicid.
Sunt dificil de produs şi de utilizat şi foarte periculoase datorită efectelor pe care le au asupra materiei
vii.
Acest tip de radiaţii poate fi utilizat în sterilizarea materialului medical şi microbiologic de
folosinţă unică sau pentru sterilizarea unor deşeuri.

PREGĂTIREA ŞI STERILIZAREA STICLĂRIEI ÎN LABORATORUL DE

MICROBIOLOGIE

Pregătirea şi sterilizarea materialului în vederea utilizării în laboratorul de microbiologie este o

operaţie deosebit de importantă deoarece exactitatea rezultatelor precum şi reuşita desfăşurării
proceselor microbiologice depind în mare măsură de rigurozitatea cu care se efectuează.
Principalele operaţii de pregătire a sticlăriei de laborator sunt:
- spălarea
- uscarea
- executarea dopurilor şi ambalarea - recipientele pot fi pregătite cu dop din vată hidrofobă
pentru a nu păstra umezeala după autoclavare. Din ce în ce mai folosite sunt dopurile din celuloză
comprimată (comercializate), sterilizabile pană la 2000C. Pentru înlocuirea eprubetelor cu dop de vată,
în scopul păstrării optime a culturilor, se pot utiliza tuburi prevăzute cu capsule care se montează prin
înşurubare.
Pentru evitarea contaminării mediilor de cultură utilizate în analiza microbiologică sau în
obţinerea culturilor microbiologice, sticlăria de laborator trebuie ambalată şi sterilizată corespunzător.
Sterilizarea se efectuează la etuvă (sau pupinel), iar materialele supuse acestei operaţii trebuie să fie
curate şi împachetate în hârtie sau aşezate în conteinere metalice închise. Sterilizarea uscată se poate
aplica pentru articole din sticlă (plăci Petri, baloane, pipete, eprubete), obiecte din porţelan, instrumentar
metalic fără suduri în cositor, pulberi uscate etc. Aerul fiind slab conducător de căldură, sterilizatorul
trebuie să uniformizeze temperatura şi să asigure pătrunderea aerului fierbinte în obiectele de sterilizat.
În calcularea timpului de sterilizare uscată trebuie avute în vedere următoarele etape:
 perioada de încălzire la temperatura de sterilizare, socotită în general o oră;
 perioada de menţinere a temperaturii de sterilizare;
 perioada de răcire în care scăderea temperaturii trebuie realizată treptat pentru evitarea spargerii
obiectelor de sticlă prin şoc termic, aprox. 2 ore.
În practică se procedează la alegerea unei temperaturi de sterilizare de 180o C şi a unei durate de o
oră. Din exces de prudenţă se practică sterilizări la temperaturi mai ridicate sau de durate mai mari. În
unele cazuri această practică este dăunătoare deoarece, de exemplu, vata ordinară - la durate şi
temperaturi mari de sterilizare uscată - eliberează gudroane ce pot inhiba creşterea microbiană.
Materiale utilizate:
- pipete;
- plăci Petri;
- eprubete;
- flacoane Erlenmayer;
- vată hidrofobă;
- tifon;
- hârtie ambalaj;
- etuvă.
Mod de lucru:
Se execută dopuri de vată hidrofobă pentru eprubete, astfel încât să poată fi extrase uşor în timpul
inoculării, iar densitatea materialului să asigure sterilitatea. Eprubetele se introduc in coşul de sârmă şi
se acoperă cu hârtie.
Pipetele se astupă la partea opusă vârfului, cu un dop subţire de vată care să reţină
microorganismele ce ar putea pătrunde în pipetă pe la partea superioară. Pipetele se ambalează într-o
fâşie de hârtie care se răsuceşte în jurul tubului de sticlă, începând de la vârf.
Plăcile Petri se ambalează în hârtie de ambalaj, în funcţie de numărul necesar.
Flacoanele Erlenmayer pentru medii de cultură se astupă cu dop de vată înfăşurat în tifon.
Toată sticlăria se sterilizează 1 oră la 180 oC la etuvă, timp socotit din momentul atingerii
temperaturii. După această perioadă etuva se opreşte şi se aşteaptă răcirea materialului.
 EXAMENUL MICROSCOPIC AL MICROORGANISMELOR

Studiul morfologiei microbiene nu poate fi conceput fără utilizarea microscopului; examenul

microscopic joacă un rol important în studiul şi identificarea germenilor, precum şi în determinarea
numărului acestora.

100 m
domeniul microscopiei
optice celule epiteliale
10 m globule roşii din sânge

bacterii tipice
1 m domeniul
microscopiei
micoplasme electronice
100 nm
virusuri

10 nm (100)
proteine

1 nm (10) aminoacizi

atomi
0,1 nm (1)