CULTIVAREA BACTERIILOR,

VIRUSURILOR,
RICKETTSIILOR
SI
CHLAMYDIILOR

LP 4.
CULTIVAREA BACTERIILOR.

Mediul de cultura - un complex de

substante care permite cresterea si
multiplicarea bacteriilor sau mediu care
asigura nutrientii si conditiile fizico-
chimice necesare cresterii si multiplicarii
bacteriene.
Scop
 Identificare agentului etiologic al unei infectii;

 Determinarea farmacorezistentei
microorganismelor izolate

 Prepare seruri si vaccinuri

CARACTERE MEDIILE DE CULTURĂ
Să asigure cantităţi optime de hidratare şi substanţe nutritive necesare
creşterii şi multiplicării microorganismelor;
Să asigure sursa de carbon şi energie (compuşi organici – polizaharide,
proteine, lipide anorganice);
Să conţină săruri minerale, cu rol în menţinerea echilibrului ionic al celulei
(Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Mn, Fe2+, Co2+);
Să asigure factori de creştere necesari pentru dezvoltarea unor
microorganisme cu exigenţe de creştere (purine, pirimidine, aminoacizi,
vitamine etc.)
Să asigure sursa de azot necesară biosintezei acizilor nucleici şi proteinelor
(compuşi organici: proteine, peptone, aminoacizi sau anorganici - azotaţi,
azotiţi
Să ofere un pH optim pentru dezvoltarea microorganismelor: în general
microorganismele se dezvoltă optim la pH neutru = 7.2-7.4, cu unele excepţii:
Vibrio cholerae se dezvolta la un pH optim alcalin (pH=9.0-9.2), în timp ce
levurile şi mucegaiurile preferă un pH acid (pH=5-6);
 Să satisfacă necesităţile de aerobioză sau anaerobioză ale bacteriei, satisfacă
naerobioză ale bacteriei,
Să fie steril şi repartizat în recipiente sterile
Clasificarea mediilor de cultură se realizează în funcţie de
mai multe criterii, care se suprapun parţial, datorită
complexităţii şi diversităţii lor chimice:

după consistenţă:
 medii lichide(bulion, apa peptonata);
 medii semisolide
 medii solide (geloză dreaptă, înclinată, în plăci). Consistenţa
mediului de cultură este dată de includerea în compoziţie a unor
substanţe inerte: agar (geloză)

 - după provenienţă:
 medii naturale
- ichide: mediu cu lapte; ou;
- solidificate: cartof glicerinat
 medii artificiale care au o compoziţie chimică bine definită
şi nu conţin nici un produs natural ca sursa de factori de
creştere (in compozitia lor intra soluţii minerale, soluţii de
zaharuri, aminoacizi).
 Medii artificiale
a.Medii de bază
– pentru germeni nepretenţioşi
• bulion simplu – macerat de carne, peptonă, NaCl
0,5%.
•geloza simplă – bulion + agar-agar (un extract de alge
care asigură consistenţa solidă, nu are proprietăţi
nutritive)
b. Medii compuse
1) Medii complexe: mediu de bază + substanţe
organice (sânge, ser, glucoză), sunt folosite pentru
cultivarea germenilor pretenţioşi
• geloza sânge, geloza ser
• bulion sânge, bulion ser, bulion glucozat
 GELOZA SANGE
 Stafilococ hemolitic Stafilococ nehemolitic
 Medii artificiale
 2) Medii de îmbogăţire: destinate cultivării unor
bacterii cu necesităţi nutritive particulare şi
care sunt stimulate să crească în mod special,
deoarece numărul lor este redus în produsul
patologic în momentul recoltării
• mediul Pike pentru îmbogăţirea streptococilor:
bulion glucozat cu cristal violet (inhibă
dezvoltarea stafilococilor), azid de Na (inhibă
Gram negativii), +/- sânge
• mediul hiperclorurat pentru îmbogăţirea
stafilococilor: bulion + NaCl 7,5%
• bulionul selenit acid de sodiu- pt. salmonele
Medii artificiale
 3) Medii selective:
 care conţin elemente ce permit creşterea numai anumitor
bacterii dintr-un produs şi alte substanţe care inhibă
dezvoltarea altora - permit cultivarea unor bacterii
pretenţioase
 mediul Löwenstein-Jensen – pt. cultivarea micobacteriilor –
ou, cartofi, verde malachit, asparagină, glicerină
 mediul Sabouraud – pt. cultivarea levurilor: geloză +
maltoză/glucoză + antibiotice
 mediul Schaedler – pt. anaerobi – geloză sânge + glucoză
 mediul chocolat – neisserii, hemofili: geloză sânge, sângele
se adaugă la geloza topită şi răcită la 60-70°C
 Mediu Chapman – pt. stafilococi
GELOZA CHOCOLAT
 - mediul Löwenstein-Jensen – pt. cultivarea micobacteriilor
– ou, cartofi, verde malachit, asparagină, glicerină
- mediul Sabouraud – pt. cultivarea levurilor: geloză +
maltoză/glucoză + antibiotice
 
 MEDIU SABOURAUD
 ZYGOMICETE
LA 24 ORE LA 48 ORE
 MEDIUL SABOURAUD
LEVURI

CANDIDA KRUSEI CANDIDA ALBICANS

 MEDIUL SABOURAUD
FUNGI

FUSARIUM ASPERGILLUS FLAVUS

Medii artificiale
 4) Medii diferenţiale: permit identificarea bacteriilor pe baza unor
procese biochimice
• mediul TSI (triple sugar iron) conţine glucoză, lactoză,
zaharoză pentru studiul fermentării acestora, sulfat de
Fe pentru detectarea producerii de H2S
• mediul Simmons – mediu cu citrat pentru studiul folosirii
citratului ca unica sursă de carbon
• mediul cu uree – uree + roşu fenol pentru detectarea
ureazei
• mediul MIU, MILF
• mediu AABTL- pune in evidenta fermentarea lactozei
 5) Medii de transport (Stuart – pt. Neisserii, Cary –
Blair- pt enterobacterii din materii fecale;
 6) Medii de conservare
 MEDIUL TSI
TSI neinsamantat
Si
TSI bacili Gram negativi TSI cu hidrogen sulfurat
nonfermentativi
CITRAT SIMMONS MEDIUL UREE

negativ si pozitiv negativ si pozitiv

MEDIUL ABE

 Mediul ABE
negativ si ABE
pozitiv (reactie
de culoare
neagra) pentru
Enterococi
MEDII POLITROPE

 PSEUDOMONAS
FLUORESCENS (cf
Phoenix) pe TSI, MIU,
citrat Simmons si
fenilalanina .
MEDII POLITROPE

 PROTEUS MIRABILLIS
MEDII POILTRPOPE

 MORGANELLA
MORGANII
MEDII POLITROPE

 PROVIDENCIA
RUSTIGIANI
MEDII POLITROPE

 KLEBSIELLA spp.
 Condiţia esenţială reuşitei unei însămânţări constă în
respectarea regulilor de manipulare sterilă (aseptică),

 Lucrul în condiţii aseptice presupune desfăşurarea tuturor

operaţiilor la flacăra becului de gaz, care asigură o zona
sterila cu diametrul de 20 cm, sau în hote cu flux laminar, în
încăperi fără curenţi de aer sau în boxe special amenajate,
evitând vorbitul în timpul lucrului şi purtând echipament de
protecţie adecvat (halat, mască, bonetă, mănuşi).
 Tehnicile de însămânţare (şi materialele necesare)
variază în funcţie de scopul însămânţării, de consistenţa
inoculului şi a mediilor utilizate pentru însămânţare.

Inoculul utilizat pentru însămânţarea unui mediu de cultură

poate fi:
-lichid – reprezentat de culturi microbiene obţinute în
mediu lichid, produse normale sau patologice, lichide (apă,
lapte, sânge, LCR, urină, lichid de ascită, lichid pleural,
spermă, lichid de spălătură bronho-alveolară);
-solid - reprezentat de culturi microbiene dezvoltate pe
mediu solid, produse normale şi patologice solide ( materii
fecale, fragmente de tesuturi recoltate prin biopsie).
 Metode de insamantare
 Pe medii solide:
- însămânţare prin epuizare (se obţin colonii
izolate);
- însămânţare în sector (se obţin colonii
confluente);
- însămânţare prin înţepare.
 însămânţare prin încorporare
 Pe medii lichide
- omogenizarea unei colonii în mediu lichid.
Însămânţarea prin epuizare
 Obţinerea culturii primare:
 - se încarcă ansa de platină sterilizată cu produs patologic;
 - se descarcă ansa pe mediu de cultură:
 - se însămânţează un prim sector;
 - se sterilizează ansa;
 - din primul sector însămânţat se trasează câteva striuri paralele
în sensul acelor de ceasornic;
 - se continuă însămânţarea prin striuri paralele, terminându-se
printr-un striu în zig-zag. În ultimul sector bacteriile sunt
dispersate, astfel încât după incubare se vor forma colonii izolate.
Obţinerea culturii pure:
 - se repică o singură colonie din cultura primară pe un mediu de
cultură proaspăt,
 fie prin epuizare, fie prin însămânţare în sector.
Scop: obţinerea coloniilor izolate
Însămânţarea în sector:
 - se încarcă ansa de platină sterilizată cu produs patologic;
 - se descarcă ansa pe mediu de cultură sub forma unui sector de
cerc.
 Pe o placă pot fi însămânţate mai multe specii bacteriene. Prin
însămânţare în sector nu se obţin colonii izolate.
Însămânţarea pe medii în coloană înclinată:

 se descarcă ansa pe partea înclinată a mediului de cultură sub forma

unui striu. Nu se obţin colonii izolate, bacteriile cresc sub diferite
modele
Însămânţarea prin înţepare: - se practică pentru însămânţarea mediilor
solide turnate în coloană dreaptă;
 - se încarcă acul de inoculare cu produs;
 - se înţeapă mediul în direcţie verticală pe o distanţă de ¾ din înălţimea
coloanei;
INSAMANTARE INOCUL SOLID PE MEDII
SOLIDE SI LICHIDE

Numerotare eprubeta
 Flambare
eprubeta
 InsamantareTSI
(panta dreapta)
 Insamantare TSI
in zig-zag (panta
inclinata)
 Insamantreprin
inteparea coloanei
 Insamantare in zig-
zag (panta
inclinata) mediu
Simmons
Tehnica însămânţării prin
încorporare
 Se lichefiază mediul prin încălzire la 8O°C, se răceşte
la 50° C
 se introduce produsul de însămânţat cu o pipetă sterilă.
 Se omogenizează prin uşoara rotire a recipientului.
 Mediul astfel însămânţat, se toarnă după caz, în plăci
Petri sterile, sau se lasă ca atare în recipientul în care
s-a făcut însămânţarea.
Însămânţarea în medii lichide

-Se încarcă ansa de platină sterilizată cu

produs
-Se omogenizează produsul recoltat în
mediul de cultură lichid
 Prelevare
colonie izolata
 Omogenizarea
culturii in mediu
lichid pentru
antibiograma
TEHNICI DE INSAMANTARE ALE
PRODUSELOR PATOLOGICE
LICHIDUL DE ASCITA
INSAMANTAREA UNUI INOCUL LICHID PE MEDII
SOLIDE

 Flambarea
eprubetei cu
produs patologic
(lichid de ascita)
LICHID DE ASCITA

 Prelevare produs
patologic cu ansa de
unica folosinta
LICHID DE ASCITA

 Depunere produs
patologic pe medii de
cultura (geloza
lactozata)
LICHID DE ASCITA

 Dispersarea
produsului patologic
LICHID DE ASCITA

 (geloza sange)
LICHID DE ASCITA

 Dispersarea
produsului
patologic pe
geloza sange
LICHID DE ASCITA

 Flambarea lamei
pentru frotiu
LICHID DE ASCITA

 Depunere
produsului
patologic pe lama
INSAMANTAREA SPUTEI

 S.Fpentru spalarea
sputei.
INSAMANTREA SPUTEI

 Adaugare 2 ml
S.F.peste sputa
(placa Petri sterila)
INSAMANTAREA SPUTEI-SPALARE IN S.F.

 Sputa se spala in 2-
3 bai de S.F.,
succesiv;

 se aleg pentru
insamantare
portiunile
reprezentative .
SPALAREA SPUTEI

 Spalarea in a
doua baie.
INSAMANTAREA SPUTEI

 Mediu lactozat
INSAMANTAREA SPUTEI

 Mediu geloza sange

INSAMANTAREA SPUTEI

 Mediu Sabouraud
(levuri)
INSAMANTARE EX. FARINGIAN

 Descarcarea
tamponului
INSAMANTARE EX. FARINGIAN

 Epuizareaculturii
descarcate (ansa)
INSAMANTARE EX. FARINGIAN

 Insamantare ex.
faringian pe
mediul Sabouraud (
levuri)
INSAMANTAREA COPROCULTURII

 Coprocultoare
INSAMANTAREA COPROCULTURII

 Dispersarea
produsului
INSAMANTAREA COPROCULTURII

 Insamantarea
inoculului solid in
mediu lichid

 Insamantarea in
bulion selenit (mediu
de imbogatire)
INSAMANTAREA COPROCULTURII

 Efectuarea
frotiului
COPROCULTURA

 Insamantari pe mediu
SS
COPROCULTURA 2

 Insamantaripe
mediul ADCL
 CARACTERE DE CULTURĂ

a. colonii de tip S (smooth - netede): (S. aureus, S.

pyogenes, E. coli),
b. colonii de tip R (rough - rugos, aspru,
grunjos):Bacillus anthracis, Mycobacterium
tuberculosis, Corynebacterium diphtheriae;
c. forme intermediare: S-R, R-S;
d. colonii de tip M:capsulă (Klebsiella);
e.Colonii pufoase - mucegaiuri
f. fenomen de căţărare (invazie, migrare, roire):
CARACTERE BIOCHIMICE SI
DE METABOLISM
 a. Metabolismul glucidic
 - se studiază pe medii de cultură diferenţiale sau selectiv-
diferenţiale;
 - urmăreşte descompunerea diferitelor zaharuri de către
bacterii (glucoză, lactoză, zaharoză, manitol);
 - prin descompunerea zahărului de către bacterii mediul se
acidifică, iar indicatorul
 schimbă culoarea mediului de cultură.
CARACTERE BIOCHIMICE SI
DE METABOLISM

 b. Metabolismul proteic:
- se studiază pe medii de cultură diferenţiale;
- prin descompunerea proteinelor de către
bacterii se eliberează metaboliţi precum
 indol, H2S sau amoniac;
- indolul şi H2S se evidenţiază cu ajutorul unor
hârtii de filtru îmbibate în reactiv
 specific(reactiv Kovacs pentru indol şi săruri de
Pb pentru H2S);.
CARACTERE BIOCHIMICE SI
DE METABOLISM
 c. Enzimele bacteriene
1-hemolizinele:
 - enzime care lizează hematiile (alterează hemoglobina);
 - prezenţa acestei enzime se evidenţiază pe mediu geloză - sânge;
 - principalele tipuri de hemoliză:
 - alfa (α) - apare ca o zonă verzuie în jurul coloniei;
 - beta (β) - sângele este descompus total, în jurul coloniei este o
zonă clară, transparentă.
 α-Hemolizina sintetizată de Streptococcus viridans, Streptococcus
pneumoniae) produce liza incompletă a hematiilor, culoare verzuie;
 ß-hemolizina sintetizată de Streptococcus pyogenes, Bacillus
cereus, Listeria monocytogenes produce liza completă a hematiilor,
zona de hemoliza este clară;
 y-hemolizina produsă de Staphylococcus spp. lizează hematiile, dar
nu produce zone de hemoliza pe agar-sânge (la streptococi, "y-
hemoliza" indică absenţa hemolizei).
CARACTERE BIOCHIMICE SI
DE METABOLISM
2-catalaza (Staphylococcus spp):
 - descompune apa oxigenată în apă şi oxigen;
 - oxigenul eliberat se evidenţiază prin formarea bulelor de gaz;
coagulaza:
 - determină coagularea plasmei recoltate pe anticoagulant;
3-oxidaza (N. meningitidis, N. gonorrhoeae, Pseudomonas
aeruginosa, V. cholerae):
 - enzime oxidative;
 - acţionează asupra unor substanţe producând compuşi coloraţi.
gelatinaza (Clostridium perfringens):
 - lichefiază gelatina;
4-lecitinaza (Bacillus anthracis, Clostridium spp.);
5-nitrat-reductaza (Mycobacterium spp.);
CARACTERE BIOCHIMICE SI
DE METABOLISM

 d. Alte teste
Mobilitatea:
 - bacteriile flagelate sunt mobile şi migrează într-un mediu
de cultură semisolid, deviază de la locul de inoculare
(traiectul de înţepătură).
Mirosul:
 - la multe specii, coloniile au miros caracteristic:

Producerea de pigment:
 - pigmenţi nedifuzibili - nu difuzează în mediu, vor colora
doar colonia (Staphylococcus aureus - pigment auriu);
 - pigmenţi difuzibili - difuzează în mediu, colorează şi
mediul (Pseudomonas - pigment verde).
  
 Cultivarea Rickettsiilor

 microorganisme care se află la graniţa dintre bacterii şi

virusuri.
 Se aseamănă cu bacteriile prin: dimensiuni, morfologie,
compoziţie chimică, organizare celulară internă şi
multiplicare directă.
 nu cresc pe medii de cultură,
 se multiplică numai în ţesuturile vii, ca şi virusurile.
 Unele rickettsii sunt patogene pentru om, provocând bolile
febrile, rickettsioze, cu erupţii peteşiale pe tegumentele
bolnavilor.
Metode de cultivare a rickettsiilor
Au un echipament enzimatic destul de bogat care îi permite să-şi
întreţină un metabolism complet, dar insuficient pentru a se dezvolta
independent într-un mediu de cultură artificial, acelular.
fragmente de ţesuturi,
culturi celulare,
ou de găină embrionat (sacul vitelin).
pe animale de laborator -cobai, soarece (temperatura cobaiului infectat
creşte, urmează o evoluţie caracteristică, după care animalele se vindecă.
Concomitent apar şi alte semne de boală: zbârlirea părului, scăderea în
greutate, tumefierea scrotului. Şoarecii sunt inoculaţi intraperitoneal.
Rickettsiile pot fi puse în evidenţă pin: amprente făcute din splină, ficat, în
ser unde se pun în evidenţă anticorpii specifici.)
Cultivarea Chlamydiilor

 în sacul vitelin al embrionului de găină şi în culturi

celulare, pretratate cu ciclohexamidă.
 bacterii minuscule, cocoide, parazite obligatoriu
intracelular
 Au structură procariotă, cu perete de tip Gram(-)
 Se reproduc prin diviziune, într-un ciclu complex,
care le individualizează de celelalte bacterii.
 Forma extracelulară infecţioasă a chlamidiilor este
de corpi elementari (CE), care au aspect cocoid, cu
diametru de 300 nm şi perete rigid, multilaminat,
metabolic inactivi.
Cultivarea virusurilor
 sunt parazite intracelulare absolute,
 se cultivă numai în culturi celulare, embrioni de găină,
animale de laborator sensibile.
 Culturi celulare- celule provenite din ţesuturi animale sau
umane, adulte sau embrionare, normale sau neoplazice,
plasate intr-un mediu adecvat (nutrienţi, pH, temperatură)
rămân viabile şi se multiplică
 Aceste culturi de celule se clasifică în:
 culturi primare de celule,
 tulpini de celule diploide (obtinute din tes. embrionare)
 linii permanente de celule (provin din tumori canceroase sau
mutante).
 Medii pentru culturi celulare

 Sunt medii de creştere (Hanks, Eagle).

 Toate sunt soluţii apoase care conţin:
 nutrienţi (aminoacizi, vitamine, glucoza, săruri minerale);
 au un sistem tampon la pH- 7,4;
 un indicator, roşu fenol, pentru monitorizarea pH- lui, se incubează
la 37° C, 24-48 ore. [Pentru inocularea culturii de celule cu virus,
mediul de creştere este îndepărtat, iar pe filmul celular spălat, se
depune produsul patologic prelucrat (omogenizare, îndepărtarea
debriurilor celulare şi bacteriilor prin centrifugare şi apoi tratat cu
antibiotice). După absorbţia virusului pe receptorii celulari, surplusul
din inocul este îndepărtat, iar filmul celular va fi acoperit cu un
mediu de întreţinere.]
Culturi de organe
Sunt mici fragmente de trahee sau bronhii, intestin
subţire proximal, trompe uterine, etc., menţinute în
mediu de cultură adecvat , păstrându-şi structura şi
funcţiile mai multe zile.
 Embrionii de găină
 Ţesutul embrionar de găină în vârstă de 6-14 zile, ca şi membranele
embrionare permit cultivarea virusurilor, rickettsiilor, chlamidiilor,
după inoculare, pe membrana chorioalantoidă (poxvirusuri, v.
herpetice), în cavitatea alantoidiană sau în cavitatea amniotică (v.
gripale, paragripale, urlian, rujeolic), sau în sacul vitelin (rickettsii,
chlamidii). Viabilitatea embrionului este verificată cu ovoscopul în
cameră obscură.
 Embrionii vii se inoculează, se incubează la 35 C timp de 3- 5 zile şi
se refrigerează peste noapte la 4° C (pentru a se evita hemoragia în
cursul recoltării )
Creşterea virusului în embrion poate determina:
 moartea acestuia,
 apariţia de peteşii pe membrana chorioalantoidă,
 acumularea de hemaglutinmă in lichidul amniotic sau alantoidic (v.
gripale).
 Animale de laborator

 Se folosesc numai când receptivitatea celorlalte gazde de

laborator este nesatisfăcătoare (v. rabic, arbovirusurile).
Replicarea virală este demonstrată prin:
 boala manifestă a animalului, eventual decesul;
 urmărirea virusului în organele ţintă (bogate în celule
receptive pentru virusul inoculat);
 prin hemaglutinare (arbovirusurile);
 infecţiozitatea omogenatelor (v. Coxsackie);
 examene histopatologice care pot depista leziuni
inflamatorii, degenerative, dar mai ales incluzii virale,
uneori caracteristice (corpusculii Babeş-Negri, în neuronii
infectaţi cu virus rabic).