LP 6 MICROBIOLOGIE

MEDII DE CULTURA
Clasificare
Prezentare
Tehnici uzuale de insamantare
 MEDII DE CULTURA:
DEFINITIE, COMPOZITIE
Mediul de cultura: reprezinta substratul energetic si biologic
necesar dezvoltarii, multiplicarii si asigurarii functiilor metabolice ale
microorganismului.
* Compozitie: Mediul de cultura trebuie sa asigure prin compozitie
substantele nutritive necesare dezvoltarii oricarui microorganism:
- sursa de azot (N2), carbon (C),
- saruri minerale,
- apa,
- vitamine,
- zaharuri,,
- aminoacizi,
- factori de crestere: sunt substante esentiale, a caror prezenta este
obligatorie, absolut necesare in dezvoltarea bacteriana
 CONDITII DE INDEPLINIT

Conditii pe care trebuie sa le indeplineasca mediile de cultura:

- pH- ul: optim 7,
- izotonia mediului: se refera la continutul in NaCl optim 7,5 g ,
- potentialul redox (Rh) diferit pentru izolarea bacteriilor aerobe si
anaerobe,
- umiditatea: cantitatea de H2O, suficienta pentru dezvoltarea
bacteriilor,
- sterilitatea mediului: conditie esentiala, pentru ca dezvoltarea
bacteriilor provenite din mediul extern (bacterii de contaminare), inhiba
izolarea microorganismelor patogene, din prelevatele patologice
(bacteriile patogene sunt, in general, mai sensibile). De asemenea,
intervine concurenta bacteriana pe acelasi substrat nutritiv.
 Principiile care stau la baza prepararii
mediilor de cultura:
1. aspectul calitativ (respectarea retetei, a calitatii
ingredientelor),
2. aspectul cantitativ (respectarea concentratiilor optime
ale componentelor),
3. solubilitatea in apa a componentelor mediului de cultura.
Coeficientul scazut de solubilitate sau formarea de
complexe insolubile, pe parcursul prepararii mediilor de
cultura (datorita unor reactii chimice, bazate pe hidrofilie,
hidrofobicitate) pot contribui la limitarea cresterii
microorganismelor.
 Clasificarea mediilor de cultura:

1. In functie de consistenta:
- solide,
- lichide,
- semisolide
2. In functie de compozitie:
- medii de cultura naturale (elemente componente de origine animala,
vegetala, mixte),
- medii de cultura sintetice (fiecare componenta a mediului este o
substanta chimica bine definita),
- medii de cultura semisintetice (combinatii substante de provenienta
naturala + sintetice).
 Clasificarea mediilor de cultura

3. In functie de tipul respiratiei:

- medii pentru izolare bacterii aerobe,
- medii pentru izolare bacterii anaerobe.
4. In functie de scopul utilizarii:
a) medii de cultura pentru izolare bacteriana:
uzuale, nediferentiale,
diferentiale, care diferentiaza pe baza unui singur caracter, grupe
taxonomice (geloza sange, CLED, AABTL, MacConkey cu sorbitol,
Chapman etc)
medii selective: inhiba dezvoltarea bacteriilor asociate cu germenul a
carui izolare se urmareste,
 Clasificarea mediilor de cultura

* efectul selectiv este obtinut prin urmatoarele metode:

- cresterea presiunii osmotice (concentratii de saruri crescute),
- actioneaza prin valori diverse de pH (apa alcalina peptonata, pH=
8),
- actiunea bacteriostatica sau bactericida a unor substante,
- adaugarea de coloranti (cristal violet, eozina, albastru de metilen,
verde briliant), diverse substante organice (acizi biliari, saruri
biliare).
* medii slab selective (Levine, MacConkey),
* medii moderat selective (ADCL, Hektoen, SS),
* medii inalt selective (Wilson Blair)
 Clasificarea mediilor de cultura

b) medii de imbogatire:
Def: asigura dezvoltarea unei specii in detrimentul altora
- mediul Selenit acid de sodiu- favorizeaza dezvoltarea tulpinilor
din genul Salmonella, dintr-un prelevat pluribacterian, cum sunt
materiile fecale,
- mediul Chapman lichid (imbogatire pentru Staphylococcus
aureus- insamantarea alimentelor nr mic de bacterii, necesita
multiplicare),
- apa peptonata alcalina (pH-8): imbogatire Vibrio cholerae
- intotdeauna lichide
 Clasificarea mediilor de cultura

c) medii de conservare si transport:

- sunt, in general, sarace in substante nutritive,
- au capacitatea si rolul de a mentine viabilitatea limita a
microorganismelor, timp de 24- 48 ore.
- mediu Stuart, Amies, Cary Blair, apa peptonata alcalina etc.
 Clasificarea mediilor de cultura

c) medii de cultura pentru identificare bacteriana:

- contin anumite substante chimice cu rol de substrat pentru
evidentierea actiunii unor enzime specifice speciei, precum si un
indicator de culoare, care vireaza la modificari de pH,
- contin indicatori care permit evidentierea unor caracteristici
biochimice ale germenului,
- medii sintetice,
- medii semisintetice,
 Clasificarea mediilor de cultura

c) medii de cultura pentru punerea in evidenta a toxigenezei

bacteriene:
- ofera conditii optime pentru elaborarea de catre bacterii a
diverselor toxine si apoi evidentierea lor.
 Principii generale de preparare a
mediilor de cultura

se foloseste apa demineralizata (bidistilata),

sterilizarea mediilor de cultura inante de repartizare:
- timp cat mai scurt (timpul indelungat produce schimbari in biochimia mediului de cultura),
- prin autoclavare :
* pentru mediile care se prapara in laborator: volum< 500 mL/ recipient: 15 min la 121C,
volum de 500 mL/ recipient: 30 min la 121,
daca folosim componente care se degradeaza la caldura (ureea, zaharuri), se sterilizeaza
componentele respective prin filtrare, la temp de 115 C,
aparitia de precipitate, este un semn ca: fie apa nu a fost demineralizata, sau mediul de
cultura contine in exces fosfati, fier (Fe2+), calciu (Ca2+),
- se evita formarea precipitatelor, sterilizand separat componentele, apoi se adauga aseptic in
mediu

 Ingrediente folosite in mediile de

cultura
* mediul de cultura natural, contine:
- peptone (proteine animale: carne, organe, sange si proteine vegetale: soia),
- hidrolizate acide de cazeina,
- extracte de carne, vegetale, drojdie, bogate in vitamine si factori de crestere,

* agenti de solidificare:
- agar,
- gelatina.

# geloza tare: contine 30g agar/ L

# geloza moale : contine 3 g agar
# pentru gelifiere optima cu agar, pH- ul trebuie sa fie neutru (sub pH = 6, nu se mai
solidifica mediul).
 Tehnici de insamantare pentru izolarea
si identificarea bacteriilor
Insamantarea prelevatelor patologice, in functie de natura lor, se face,
direct sau dupa o prealabila prelucrare:
- prelevate lichide, provenite din situsuri normal sterile (LCR, lichide
de punctie pleurala, peritoneala, articulara etc): concentrare prin
centrifugare, din sediment se insamanteaza pe medii de cultura solide
sau lichide, pentru cultivarea agentului etiologic,
- prelevate fluide sau emulsionabile (exudate purulente, materii
fecale): se insamanteaza direct,
- decontaminare prin spalare in ser fiziologic steril (sputa) pentru
indepartarea florei de asociatie; dintr- un fragment purulent se
efectueaza culturi pe medii de izolare solide,
 Insamantarea produsului patologic
cu ansa
Se are in vedere ca:
- mediul de cultura sa fie proaspat turnat (24- 48 ore),
- sa fie verificat din punct de vedere al sterilitatii (martori de sterilitate),
- sa fie verificat din punct de vedere al calitatii mediului (tulpini de referinta),
- suprafata mediului de cultura solid sa nu prezinte condens (risc de
contaminare),
- pe fundul placii se noteaza: data turnarii mediului, simbol referitor la data
insamantarii probei, numarul probei, tipul prelevatului (niciodata pe capac),
- se tine placa Petri in mana stanga, inclinata, iar cu dreapata, se
manipuleaza ansa bacteriologica,
- ansa se sterilizeaza prin ardere la rosu- incandescenta la baza flacarii
becului Bunsen, inainte de incarcare a buclei cu produs, dupa terminarea
dispersiei pe mediu si intre cadrane:
 Insamantarea unui produs patologic
recoltat cu tamponul
tamponul se descarca prin rasucire pe mediul de cultura, la
aprox. 0,5 cm de la marginea placii Petri;
se continua dispersia cu ansa bacteriologica, respectand
cele 4 cadrane, cu arderea ansei intre cadrane, racire in
mediul de cultura,
in cadranul 4, urmeaza sa se dezvolte colonii izolate, pentru
a efectua identificarea bacteriana din cultura pura.
 Insamantarea in medii lichide

- cu seringa (inocularea sangelui in baloane de hemoculturi),

- cu pipeta Pasteur (sedimentul LCR),
- cu ansa (produs patologic sau cultura bacteriana),
 Insamantarea cu ansa a mediilor
solidificate in panta
- se recomanda pentru mentinerea (stocarea) pe durata limitata
(zile, 2 saptamani) a culturilor pure: tulpini de identificat, tulpini
de referinta).
- se preleva cu ansa o colonie izolata pe un mediu agarizat,
- se depune inoculul in partea inferioara a pantei, imediat
deasupra lichidului de condens,
- se retrage ansa spre partea superioara a pantei, descriind
miscari in S pe suprafata mediului de cultura.
 . Insamantarea cu firul (ansa - ac) drept a
mediilor solidificate
in coloana si panta

- este indicata pentru testarea unor activitati biochimice:

- se incarca firul cu inocul din cultura pura si se inteapa
coloana mediului,
- se retrage apoi acul si se insamanteaza panta prin miscari
in S, pana la partea sa superioara.
 Insamantarea cu firul drept a coloanei
de agar nutritiv moale
- este indicata pentru testarea mobilitatii bacteriilor sau pentru
conservarea pe perioade mai lungi (1 6 luni), a tulpinilor
bacteriene,
- se incaraca firul cu inocul din cultura pura si se inteapa central
coloana de mediu, pana aproape de fundul tubului,
- la testarea mobilitatii de retrage acul cat mai exact pe acelasi
traiect, pentru a evita dilacerari suplimentare ale mediului in care
cresterea poate da impresia falsa de mobilitate a bacteriei.