Totalizarea nr.

2
TEMA2:

PRINCIPIILE DE CULTIVARE A BACTERIILOR.

MEDIILE DE CULCTURA

1. Cresterea si multiplicarea bacteriilor. Ciclul celular.

Creterea mrirea coordonat a masei i volumului structurilor bacteriene ca rezultat al proceselor de sintez
Multiplicarea creterea numrului de celule pe o unitate de suprafa sau de volum
- Diviziune binar
- nmugurire (levuri, ciuperci levuriforme)
- Autoreproducere (virusuri)
- Spori (micete)
- Fragmentare (actinomicete)
Ciclul celular procesele care au loc de la formarea celulei pna la urmtoarea diviziune
1. Faza C replicarea ADN
2. Faza G de laten, segregarea cromozomilor
3. Faza D de diviziune, formarea septului
Replicarea ADN depinde de masa critic a celulei, iar separarea cromozomilor i diviziunea intervin n momentul cnd
celula atinge o lungime - limit

Perioada dintre 2 diviziuni reprezint timpul (perioada) de generaie (TG).

Durata TG depinde de specie i de condiiile de cretere (condiii optime vitez maxim)

Bacteria

TG in vitro
(min)

TG in vivo
(ore)

Escherichia coli

20-40

Staphylococcus aureus

40

3-5

Vibrio cholerae

10

2-3

Mycobacterium
tuberculosis

120-240

24-48

2.Cultivarea bacteriilor. Conditiile de cultivare.

Creterea bacteriilor n laborator cultivare. Se cultiv bacteriile pentru izolarea lor din medii naturale (prelevate
patologice, alimente, ap, etc).
Izolarea bacteriilor se realizeaz pentru:
1. Identificarea mi/o (scop de diagnostic)
2. Testarea sensibilitii lor fa de antibiotice
3. Obinerea unor produi de biosintez (antibiotice, AA), bioconversie (hormoni steroizi), fermentare (alcooli, acizi
organici, etc), producerea vaccinurilor, eubioticelor...
Pentru cretere bacteriile au nevoie de nutrieni i condiii fizico-chimice adecvate.
Condiiile (principiile) de cultivare
-

Surs nutritiv adecvat

Surs de energie
Ap
Temperatura potrivit
pH adecvat
Concentraie optim a oxigenului i a CO2
Presiune osmotic adecvat

Temperatura de cretere
Exist temperaturi minime, maxime i optime de dezvoltare a bacteriilor. n raport cu temperatura optim
deosebim:
1. Bacterii psichrofile t optim 10-20 C. Cresc i la 0 C.
2. Bacterii mezofile optimum 30-37 C (limite 15-45 C)
3. Bacterii termofile optimum 50-60 C (pn la 95 C)
4. Bacterii hipertermofile (cresc la 70110 C)

1.
2.
3.

pH
Bacterii neutrofile (majoritatea, inclusiv cele patogene) pH 6-7,5
Bacterii acidofile pH 2-6 (Lactobacillus)
Bacterii alcalofile pH >8 (Pseudomonas, Vibrio)

Presiunea osmotic
1. Bacterii halotolerante (osmotolerante) cresc n concentraii reduse de NaCl (mediu izotonic cu mediul intern al
gazdei) mi/o patogene
2. Bacterii halofile prefer concentraii mari de NaCl (1-30%) stafilococi, vibrioni (Vibrio parahaemolyticus)
Oxigenul
1. Bacterii strict aerobe cresc doar n prezena O2 molecular. Obin energia prin respiraie aerob
2. Bacterii microaerofile necesit concentraii reduse de O2 i 2-10% CO2. Obin energia prin respiraie sau
fermentaie (Neisseria, Brucella, Campylobacter)

3. Bacterii strict anaerobe cresc doar n absena O2. Obin energia prin fermentaie sau uneori respiraie anaerob.
Toxicitatea O2 formarea H2O2,, a radicalilor superoxizi O2-, sau peroxizi O22- pe care anaerobii nu le pot
descompune (absena catalazei, superoxid dismutazei, peroxidazei) Clostridium, Bacteroides
4. Bacterii anaerobe aerotolerante pot crete n prezena O2, obin energia prin fermentaie, posed peroxidaz
(Lactobacillus, streptococi)
5. Bacterii facultativ anaerobe cresc n orice condiii, obin energia prin respiraie sau fermentaie

3.Mediile de cultura p-u bacteriile chemoheterotrofe si cerintele fata de ele.

Mediile de cultur soluii sau substrate solide care asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice necesare cultivrii
bacteriilor. Ele pot fi utilizate pentru cultivarea (izolarea) bacteriilor, testarea sensibilitii la antibiotice, stocarea sau
transportul culturilor bacteriene.

Cerinele fa de mediile de cultur

S asigure necesitile nutritive i energetice ale bacteriilor
Umiditate optimal
pH optimal (7,2-7,4) i constant (caracter de tampon)
Potenial de oxido-reducere optimal (anaerobi - rH2<5, aerobi rH2>10)
S fie izotonice (0,5% NaCl)
S fie sterile i transparente

4. Clsificarea mediilor de cultura

Dup provenien
1. Empirice, naturale. Au la baz produse de origine animal sau vegetal (snge, ser, lapte, ou, cartof, extracte din
carne, cord, creier, ficat, pete, levuri, etc). Compoziia lor chimic precis nu poate fi controlat
2. Sintetice includ ingrediente chimice pure, compoziia chimic este cunoscut cu exactitate
3. Semisintetice
Dup consisten
1. Medii lichide (bulion) utilizate pentru obinerea biomasei bacteriene i a produselor lor (antibiotice, enzime, toxine)
2. Medii solide conin 10-15% gelatin sau 2-3% agar-agar (polizaharid extras din alge roii, t topire 80-100 C,
solidificare 42 C). Placa de geloz n cutii Petri este utilizat pentru izolarea culturilor pure, geloza nclinat (n pant)
pentru acumularea culturilor pure
3. Medii semisolide 0,2 0,5 % agar-agar. Se utilizeaz pentru studierea activitii biochimice sau a mobilitii bacteriilor.
Dup compoziia chimic (complexitate) i destinaie
A. Medii uzuale (universale, simple)
1. Ap peptonat (ap+1% pepton+0,5% NaCl)
2. Bulion peptonat BP (extract apos din carne + 1% pepton+0,5% NaCl)
3. Geloza nutritiv (BP + 2-3% agar-agar)
4. Gelatina nutritiv (BP + 10-15% gelatin)
Sunt utilizate pentru creterea bacteriilor nepretenioase la cultivare
Sterilizarea prin autoclavare: 120 C, 20 min
B. Medii complexe
I. Medii elective formate din medii simple cu adaos de componente care permit creterea mi/o pretentioase nutritiv
(bulion-seric, bulion glucozat, geloz-snge streptococi, neisserii; ser coagulat corinebacterii, etc)
II. Medii selective medii solide cu adaos de componente sau cu condiii fizico-chimice particulare care stimuleaz
creterea unor specii i inhib creterea altor specii (geloza salin - stafilococi, geloza alcalin - vibrioni, mediul Ploskirev Salmonella, Shigella, etc)
Mediile de mbogire reprezint medii selective lichide, utilizate pentru mbogirea florei patogene i inhibarea florei de
asociaie dintrun prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale). Etap premergtoare nsmnrii pe medii selective.

- Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit )

- Mediul Kauffmann (mediul Muller+bil+verde de briliant) Salmonella
- Bulion cu selenit Shigella, Salmonella
- Ap peptonat alcalin (pH=8) Vibrio cholera
- Kitt-Tarrozzi (BP+0,5% glucoz+buci de ficat) pentru anaerobi
III. Medii diferenial-diagnostice (DD) permit diferenierea speciilor bacteriene n baza activitii lor biochimice
(zaharolitice, proteolitice, lipolitice, de oxido-reducere)
Sunt construite dup urmtoarea schem:

Baz nutritiv+substrat+indicator (la necesitate)

Medii DD pentru izolarea culturii pure

Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure i identificare preliminar
Medii DD pentru identificarea final a culturii pure
IV. Medii speciale
pentru izolarea unor anumite bacterii (Finn, Popescu, Loewenstein-Jensen pentru agenii tuberculozei, Sabouraud
fungi)
V. Medii de transport
destinate transportrii sau stocrii unui material (prelevat), care va fi examinat ulterior.
Menine n via bacteriile, fr a favoriza multiplicarea lor.
- Mediul cu glicerin 30%
- Soluie tampon-fosfat
- Soluie NaCl 3%
- Mediul Cary-Blair
- Mediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de Na, albastru de metilen) pentru anaerobi,
neisserii, etc

Mediile uzuale. Componenta. Tehnica de preparare si sterilizare

Medii uzuale (universale, simple)

1. Ap peptonat (ap+1% pepton+0,5%NaCl)
2. Bulion peptonat BP (extract apos din carne+ 1% pepton+0,5% NaCl)
3. Geloza nutritiv (BP + 2-3% agar-agar)
4. Gelatina nutritiv (BP + 10-15% gelatin)
Sunt utilizate pentru creterea bacteriilor nepretenioase la cultivare
Sterilizarea prin autoclavare: 120 C, 20 min

Sterilizari prin caldura umeda:

Se fac in autoclave prin vapori sub presiune, care realizeaza 115 C la 0,5 atmosfere, 121 C la o atmosfera si 134 C Celsius
la 2 atmofere. Important este ca procedura se realizeaza numai intr-o incinta lipsita de aer, aerul comprima sterilizarea.
Autoclave este un cazan cu pereti rezistenti, in care , dupa inchiderea etansa cu un capac masiv, preset cu buloane sau cu
un sistem cabestan, vaporii de apa se comprima la presiunea necesara sterilizarii.

In autoclave la temperature de 120 C Celsius, timp de 15 minute, mediile de cultura uzuale ( geloza, bulionul peptonat),
solutia izotonica de natriu clorid , vesela de laborator cu materialul infectat. La aceasta temperature nu se sterilizeaza
mediile cu protein native, glucide si alte substante care se modifica usor la incalzire. Mediile cu glucide se sterilizeaza la
110 C Celsius, timp de 5-10 minute.
Pentru controlul functionarii sterilizatorului cu vapori intre obiectele ce se sterilizeaza se pune un tub de sticla sudat, care
contine o substanta cu punctul de topire cunoscut (benzonaftol)-110 C Celsius, (acid benzoic)- 120 C Celsius, si o cantitate
mica de colorant anilinic praf. La topirea acestor substante are loc colorarea lor uniforma.
Eficacitatea sterilizarii se controleaza, introducind in autoclave materialul intentionat infectat cu spori de bacterii, strilizarea
in autoclave fiind cea mai perfecta pentru ca asigura distrugerea sporilor.
Prepararea:
Vesela: mediile de cultura se prepara in cratite emailate sau din otel inoxidabil. Mediile de cultura pregatite se repartizeaza
in flacoane , eprubete, cutii.
Vesela din sticla neutilizata se fierbe in solutie de HCl 1-2 % pentru neutralizarea bazei solubile, apoi se spala minutios cu
apa curgatoare si se usuca. Vesela uzata , se sterilizeaza apoi se spala cu sapun sau alti detergent cu ajutorul unei perii,
se clateste bine si se usuca. Flacoanele , retortele, eprubetele se inched cu tampoane de vata.
Bulionul peptonat:
1. Intr-un litru extras apos de carne se dizolva, incalzind si amestecind, 10g peptona 1%, 5g(0,5%) natriu clorid. Se
recomanda de luat 3 parti de clorura de natriu si 2 parti difosfat acid de natriu. Fosfatul acid de natriu, stabilizeaza reactia
mediului si serveste ca o sursa suplimentara de fosfor. Se ajusteaza pH al mediului la 7,6-7,8, se fierbe 30-40 minute pina
la depunerea sedimentului.
2. Se raceste, se filtreaza prin filtru de hirtie, se adauga apa pina la volumul initial, se controleaza pH.
3. se repartizeaza in eprubete, flacoane si se sterilizeaza 15-20 min in autoclave la 120 C Celsius.
Bulionul peptonat concentrat se prepara pe baza unui extras apos din carne special ( 1 kg de carne in 1l de apa). Acest
bullion serveste pentru cultivarea anaerobilor si altor microorganisme.
Geloza (G):
1 La bulionul peptonat, pentru a-I reda o consistenta solida, se adauga 2-2,5% agar spalat si taiat marunt.
2 Se fierbe amestecind pina la lichefierea complete a agarului. Uneori pentru limpezirea mediului se adauga un albus de
ou, amestecat cu o cantitate dubla de apa rece. Mediul se introduce in autoclave pe 45 min la 115 C Celsius. Flacoanele
de proteina coagulate absorb particulele suspendate si le sedimenteaza la fund.
3 Se determina reactia mediului. Se mentine un timp pentru sedimentare si se filtreaza prin filtre de tifon si vata in stare
fierbinte, folosind o pilnie metalica speciala cu pereti dubli, intre care circula apa fierbinte.
4 Mediul se toarna printr-o pilnie de sticla cu cleme in eprubete si flacoane, se sterilizeaza in autoclave la 120 C Celsius ,
15-20 min.
5 Geloza sterile lichefiata se repartizeaza in eprubete pentru pregatirea gelozei inclinate si in coloana ( geloza in stilp). In
primul caz eprubetele se aranjeaza in pozitie inclinata, in al doilea- e in stativ.
***Agarul se obtine printr-o prelucrare speciala a algelor de mare. El prezinta o substanta de natura polizaharidica, contine
o cantitate neinsemnata de azot si nu prezinta un substrat nutritive. Gelul format de agar se lichefiaza la temperature de
70-100 C Celsius si se solidifica la temperature camerei. Pentru prepararea mediilor nutritive solide se poate folosi
materialul sintetic din polimeri.

6. mediile complexe , clasificarea lor, destinatia, component, sterilizarea

Medii complexe
I. Medii elective formate din medii simple cu adaos de componente care permit creterea mi/o exigente nutritiv (bulionser, bulion glucozat, geloz-snge streptococi, neisserii; ser coagulat corinebacterii, etc)
II. Medii selective medii solide cu adaos de componente sau cu condiii fizico-chimice particulare care stimuleaz
creterea unor specii i inhib creterea altor specii (geloza salin - stafilococi, geloza alcalin - vibrioni, mediul Ploskirev Salmonella, Shigella, etc)

Mediile de mbogire reprezint medii selective lichide, utilizate pentru mbogirea florei patogene i inhibarea florei de
asociaie dintrun prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale).
Etap premergtoare nsmnrii pe medii selective.
- Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit )
- Mediul Kauffmann (mediul Muller+bil+verde de briliant) Salmonella
- Bulion cu selenit Shigella, Salmonella
- Ap peptonat alcalin (pH=8) Vibrio cholerae
- Kitt-Tarrozzi (BP+0,5% glucoz+buci de ficat) pentru anaerobi

III. Medii diferenial-diagnostice (DD) permit diferenierea speciilor bacteriene n baza activitii lor biochimice
(zaharolitice, proteolitice, lipolitice, de oxido-reducere)
Sunt construite dup urmtoarea schem:

Baz nutritiv+substrat+indicator (la necesitate)

Medii DD pentru izolarea culturii pure

Studierea proprietilor zaharolitice
Endo (geloz+lactoz+fucsin+hiposulfit de Na)
Levin (geloz+lactoz+eozin+albastru metilen)
Ploskirev (geloz+lactoz+rou neutru+sruri de acizi biliari+verde de briliant)
Coloniile lactozo-pozitive vor fi colorate (roii pe Endo, Ploskirev, albastru-violete pe Levin)
Studierea proprietilor de oxido-reducere
Mediul cu sulfit de Bismut pentru Salmonella (colonii negre reducerea sulfitului n sulfura de Bi)
Mediul Klauberg (geloz-snge cu telurit de K) pentru Corynebacterium diphtheria (colonii negre)
Studierea proprietilor lipolitice
Geloza cu glbenu de ou bacteriile cu lecitinaz formeaz un halou opac n jurul coloniei

Studierea proprietilor hemolitice

Geloza-snge (geloza+5-15% snge defibrinat)
n cazul hemolizei n jurul coloniilor apare o zon clar
Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure i identificare preliminar
Russel geloz+1% lactoz, 0,1% glucoz, indicator
Kligler identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H2S)
Olkeniki identic Kligler+1% zaharoz+uree
Indicatorul Andrede fucsin+NaOH
Scindarea glucidelor (acid - A, acid i gaz - AG) duce la modificarea pH i virajul culorii mediului din rou n galben.
n pant se apreciaz lactoza/zaharoza (oxidare), n coloan-glucoza (fermentare).
Producerea H2S nnegrirea mediului

Medii DD pentru identificarea final a culturii pure

- irul pestri Hiss (lichid sau semi-solid) un ir de tuburi ce conin soluii 0,5% de diferite glucide i indicator.
Aprecierea dup modificarea culorii (acid - A)i apariia bulelor de gaz (acid i gaz - AG)
- Medii cu AA (lizin, arginin, ornitin) i indicatori.
IV. Medii speciale
pentru izolarea unor anumite bacterii (Finn, Popescu,Loewenstein-Jensen pentru agenii tuberculozei, Sabouraud
fungi)
V. Medii de transport
destinate transportrii sau stocrii unui material (prelevat), care va fi examinat ulterior.
Menine n via bacteriile, fr a favoriza multiplicarea lor.
- Mediul cu glicerin 30%
- Soluie tampon-fosfat
- Soluie NaCl 3%
- Mediul Cary-Blair
- Mediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de Na, albastru de metilen) pentru anaerobi, neisserii, etc
Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate mica de material ce conine bacterii (inoculum) se ntroduce ntr-un mediu de
cultur (nsmnare, inoculare), care ulterior va fi incubat n termostat (pentru asigurarea temperaturii optime).
n timpul incubrii (18-24-48 ore..) bacteriile cresc i se divid, formnd o cultur bacterian (totalitatea bacteriilor
accumulate prin multiplicare intr-un mediu).
M.tuberculosis 3-5 sptmni
V.cholerae 6-12 ore

7. Manifestarea cresterii si multiplicarii bacteriilor in medii solide si lichide. Coloniile de

bacterii, metodele de studiere. Tipurile de colonii si caracteristica lor.
Manifestarea creterii i multiplicrii bacteriilor
n mediu lichid
- Turbiditate uniform
- Formarea unei pelicule la suprafaa mediului (vibrioni, yersinia)
- Formarea unui sediment la fundul tubului sau pe perei (streptococi, Bacillus anthracis)
n mediu solid
formarea coloniilor Colonie o aglomerare de bacterii care se dezvolt dintr-o singur celul sau un grup de celule
(UFC unitate formatoare de colonii) pe suprafaa unui mediu solid
Fiecare specie bacterian formeaz colonii specifice (caracter util n identificare)

Caracteristica coloniilor
Dimensiuni colonii mici (0,1-1mm), medii (1-2mm), mari (2-3mm)
Contur (margini) neted, ondulat, zimat, lobat,etc
Suprafa plat, bombat, convex, ombilicat,etc
Form punctiform, circular, filamentoas,neregulat

Culoare (pigmentaie) alb, galben, aurie, etc

Densitate opac, transparent, etc
Consisten cremoas, untoas, uscat, mucoid
Hemoliza- prezenta si tipul ( pe medii de singe)
Tipurile de colonii
Colonii S (smouth) rotunde, netede, umede,lucioase. Bacterii cu incarcatura electronegative puternica si hidrofile ,
proprietati asigurate de structura de invelis, tulbura omogen mediile de cultura lichide, formeaza suspensii stabile.
Colonii R (rough) Bacteriile cu incarcatura electronegativa si hidrofilie mai redusa se autoaglutineaza, cultiva sub forma
de Bulgari, lasind mediul supernatant clar si formeaza colonii cu margini neregulate, suprafata uscata, rugoasa.
Studierea coloniilor
1.Studierea macroscopica in lumina directa si reflectata:
Cutia se intoarce cu fundul spre sine si se studiaza coloniile in lumina directa. Daca sint mai multe tipuri de colonii , ele se
numeroteaza si fiecare se descrie aparte.
In lumina reflectata coloniile se studiaza din partea capacului fara a-l deschide si in protocol se fixeaza: culoarea,
suprafata, pozitia pe mediul nutritiv.
2.Examenul microscopic al coloniilor
Cutia se instaleaza cu fundul in sus pe masuta microscopului, se coboara condensatorul si cu obiectivul 8X se studiaza
coloniile, fixind in protocol strucyura lor si caracterul marginilor.

8.Notiuni de specie, cultura pura si mixta, tulpina si clona.

Specie- unitatea fundamentala a evolutiei.
Cultura pura- este o populatie formata din bacterii de aceeasi specie (indispensabila identificarii).
Cultura mixta- este o populatie compusa din bacterii de specii diferite.
Tulpina-este o populatie microbiana constituita din descendentii unei singure izolari in cultura pura, pe care o manipulam
pentru studiu.
Clona- populatie care rezulta din multiplicarea unei singure celule.

9. Fazele evolutiei culturilor periodice de bacterii. Dinamica multiplicarii bacteriilor in

cultura continua si discontinua. Importanta practica.
Exista 2 tipuri principale de culturi bacteriene:

Culturi discontinue (in mediul de cultura nereinnoit) care pot fi realizate:

-asincron
-sincron
Culturi continue (in medii de cultura reinnoite continuu)

Culturile discontinue- se obtin la cultivarea bacteriilor in volum limitat de mediu

Fazele dezvoltarii unei culture discontinue asincrone sunt:
1. Faza de lag- faza de adaptare la conditiile mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc in dimensiuni, dar nu se
divid.
Durata este variabila (2-4 ore) si depinde de starea bacteriei, conditiile mediului.
2. Faza logaritmica- bacteriile cresc si se divid cu viteza maximala constanta, curba evolueaza exponential. Bacteriile
sunt foarte sensibile la agenti antimicrobieni (culture utile pentru testarea sensibilitatii antibiotice).
Durata 8-10 ore.

3. Faza stationara- rata celulelor care se multiplica scade treptat, numarul celulelor vii ramine constant mai multe ore.
Cauza- consumarea nutrientilor, acumularea metabolitilor toxici.
Morfologia bacteriilor este tipica specie, apar incluziuni, spori (culture utile pentru identificare).
Sensibilitatea la agenti antimicrobieni scade.
Durata 10-12 ore.
4. Faza de declin (letalitate)-bacteriile mor progresiv.
Consecinta acestor actiuni conduce, in final, la sterilizarea mediului si la moartea tutror celulelor, respective la
pierderea culturii.

Culturi discontinue sincrone- culturi in care bacteriile se divid in acelasi timp.

Sunt selectionate din culture asincrone si contin organisme foarte asemanatoare deoarece apartin aceleiasi
categorii de virsta si/sau de dimensiuni si ca urmare se divid aproape simultan.
Procesul de diviziune sincrona dureaza numai 2-3 generatii deoarece diferentele individuale determina procesul de
defazare in ritmul de crestere, chiar intre descendentii unei singure celule.
Tehnicile de obtinere a culturilor sincrone sunt:
-Tehnici bazate pe selectie dupa dimensiuni de virsta
-Tehnici bazate pe modificari ale mediului.

Culturi continue- se realizeaza cind mediul de cultura este continuu reinnoit si imbogatit cu oxigen cu evacuarea
unei cantitati de cultura. Se realizeaza in chemostate sau turbidostate, cultura aflindu-se permanent in faza exponentiala.
Chemsotatele- sunt sisteme de cultivare deschise, in flux continuu, in care mediul proaspat este adaugat in mod
continuu, in timp ce o cantitate egala, reprezentind surplusul de microorganism si de mediu este indepartat.
n chemostat densitatea populaiei bacteriene i rata de cretere pot fi controlate prin intermediul a doi factori de
reglare:
-rata diluiei
- concentraia unui nutrient limitant.
Chemostatul asigur n mod continuu o cultur care crete indefinit, cu o vitez constant, n condiii constante,
furniznd celule cu proprieti uniforme i activiti fiziologice optime.
Culturile continue se folosesc n practica industrial pentru:
obinerea biomasei microbiene bogate n nutrieni;
extragerea unor principii active de la diferite specii de microorganisme (vitamine, enzime etc.).