OBTINEREA ENZIMELOR AMILOLITICE

În topul preparatelor enzimatice utilizate în biotehnologiile contemporane, primul loc este

ocupat de hidrolaze (în special, enzimele amilolitice şi proteolitice), care au înlocuit treptat
hidroliza chimică din multe procese industriale.
Enzimele amilolitice implicate în hidroliza completă a amidonului sunt de 4 tipuri:
- -amilaza, care acţionează asupra legăturilor 1,4--glicozidice interioare din molecula
de amidon;
- -amilaza, care atacă legăturile 1,4--glicozidice marginale;
- amiloglucozidaza (glucoamilaza), care desfac legăturile 1,3--glicozidice;
- glucozidazele (pullulanaza, izoamilaza), care atacă legăturile 1,6 -glicozidice.
O sursă importantă de preparate amilolitice o constituie microorganismele, care
sintetizează enzime cu numeroase aplicaţii în: industria alimentară (siropuri de amidon, fabricarea
alcoolului, berii, vinificaţie, în alte fermentaţii şi panificaţie), industria textilă, a detergenţilor,
farmaceutică iar în zootehnie la furajarea animalelor (preparatele MKC Amylase LT, MKC
Glucoamylase, Diazyme).
Cea mai stabilă sursă de amilaze este Bacillus subtilis, care a fost primul microorganism
cultivat la nivel industrial în scopul producerii de enzime amilolitice, la început în culturi de
suprafaţă şi apoi pe medii lichide, în fermentaţii submerse (sistemul “batch”). În prezent, se cunosc
mai multe microorganisme producătoare de enzime care hidrolizează amidonul, aparţinând
diferitelor clase sistematice: bacterii (B. stearothermophilus, B. licheniformis, Halobacterium
sodomense), drojdii şi fungi (Aspergillus niger, A. oryzae, Rhizopus niveus). Biosinteza amilazelor
bacteriene începe în faza de sporulare şi este influenţată de particularităţile morfo-fiziologice ale
tulpinilor bacteriene.
Biosinteza amilazelor bacteriene este influenţată de compoziţia mediului nutritiv şi
condiţiile de cultivare a microorganismului (temperatură, pH, aerare, agitare, durata fermentaţiei).
Mediile industriale conţin diverse varietăţi de amidon (amidon de cartofi, din porumb, orz), surse
de azot organic sau anorganic, săruri minerale (în special ionii de calciu şi amoniu, datorită
implicării lor în sinteza acidului dipicolinic) şi factori de creştere. Procesul este intens aerob, dar
oxigenul insuflat prin procesul de aerare nu poate fi utilizat direct în fază gazoasă, ci numai ca
oxigen dizolvat. Din acest motiv, bioreactoarele sunt echipate cu sisteme de agitare eficiente pentru
a asigura un transfer de masă al oxigenului cât mai bun.
Pentru exemplificare, prezentăm în continuare tehnologia de obţinere a amilazelor alcaline,
care sunt folosite cu preponderenţă în industria detergenţilor şi în procesele de epurare a apelor
reziduale provenite din diverse industrii alimentare ori de la prelucrarea pieilor de animale.

Microorganism şi medii de cultură

- tulpină selectată de Bacillus sp. ICCF 290 pe mediu de întreţinere Horikoshi II (H II);
Caracterizarea microbiologică a tulpinii alcalitolerante şi termotolerante de Bacillus sp. ICCF
290:
 • caractere morfologice: bacili Gram-pozitivi, dispuşi în lanţuri, mobili, sporogeni - produc
endospori;
• caractere fiziologice: aerobi, prezintă activitate amilolitică, se dezvoltă în mediu cu pH
neutru şi alcalin (7,0-10,0), atât la temperatura camerei cât şi la 550C;
• caractere de cultură şi de colonie: colonii albe, mari (  2 mm) neuniforme, cu formă
rotundă, margine întreagă, profil plat, suprafaţă nedetă, lucioasă, mată, mucoidă, nu prezintă
fenomenul de disociere (R → S, P, M).
- mediul pentru preinocul şi inocul: mediu Horikoshi II (H II), care conţine (g/v):
- Amidon solubil 1,0%
- Peptonă bacteriologică 0,5%
- Extract de drojdie 0,5%
- KH2PO4 0,1%
- MgSO4 x 7H2O 0,02%
- Agar 2,0%
pH (corectat cu soluţie Na2CO3 10%) 10,0
Se prepară 100 ml mediu H II agarizat, care se repartizează în eprubete, se solidifică în
poziţie înclinată. Mediul astfel preparat reprezintă substratul pe care se va dezvoltă preinoculul.
Se prepară 150 ml mediu H II lichid, care se repartizează în două flacone Erlenmayer de
500 ml (75 ml mediu/flacon).
Se sterilizează ambele medii la 1210C, timp de 10-15 minute. Se adaugă în condiţii sterile
carbonatul de sodiu până când pH-ul mediului ajunge la valoarea 10,0. Soluţia de Na2CO3 10% se
sterilizează separat prin filtrare, folosind filtrul Millipore cu diametrul de 0,45 . Se verifică
sterilitatea mediului prin incubare la 28oC timp de 48 ore.
- mediul de biosinteză are următoarea compoziţie (g/v):
- Amidon (granule) 1,0%
- Făină de soia 1,0 %
- Extract de drojdie 0,5%
- KH2PO4 0,1%
- CaCl2 sicc. 0,1%
- MgSO4 x 7H2O 0,02%
- ZnSO4 0,001%
- MnSO4 0,0001%
pH (corectat cu soluţie de Na2CO3 10%) 10,0
Amidonul sub formă de granule se dizolvă separat într-un litru de apă caldă, la cald,
amestecînd continuu cu o baghetă de sticlă, până când se obţine o probă omogenă. Peste această
probă de amidon se adaugă restul de apă încălzită şi celelalte substanţe chimice.
Se prepară 4 litri mediu de biosinteză şi se sterilizează la 1210C, timp de 15-20 minute.
Înainte de inoculare mediul se răceşte la temperatura de lucru 300C, se ajustează pH-ul la valoarea
10,0 şi se verifică sterilitatea mediului.
Faza de bioproces
Preinocul: Tulpina de Bacillus sp. ICCF 290 dezvoltată pe mediu de întreţinere, timp de
18-20 de ore, la 300C (8 tuburi).
Inocul: În condiţii aseptice se recoltează cu ansa sterilă cantitatea de biomasă din cultura
preinocul aflată în 4 tuburi şi se suspendă în unul din flacoanele cu mediu pentru inocul. Se agită
flaconul până când cultura bacteriană se dispersează uniform în mediu. Se repetă operaţiile pentru
celălalt flacon. Dezvoltarea inocului se realizează la 300C, timp de 18-20 de ore, în condiţii de
agitare (280 rpm).
Inoculul şi preinoculul se verifică microscopic înainte de însămânţare, pe preparate
lamă/lamelă. Inoculul este reprezentat de o cultură bine dezvoltată, formată din celule aflate în
faza logaritmică de creştere.
Inocularea: Se realizează în mod aseptic, chiar dacă biosinteza se desfăşoară în condiţii
foarte selective, nefavorabile dezvoltării microorganismelor contaminante (pH alcalin).
Parametrii de cultivare:
• Raport de inoculare: 5%;
• Temperatură: 300C;
• pH iniţial 10,0 (nu se corectează pe parcursul bioprocesului);
• Agitare: 280 rpm;
• Debit de aer: 180 l/h;
• Timp: 48 de ore.
Controlul analitic al bioprocesului: Pe parcursul bioprocesului se recoltează aseptic probe
din 8 în 8 ore, iar după 24 ore de fermentaţie probele se diluează 1/10, pentru a efectua preparate
microscopice şi a stabili acumularea biomasei bacteriene.
Pe toată durata bioprocesului se verifică:
- menţinerea purităţii culturii microbiene şi stadiile de dezvoltare a acesteia, prin
efectuarea de preparare microscopice lamă/lamelă sau fixe;
- acumularea biomasei în timp, care se determină spectofotometric, măsurînd
densitatea optică la 650 nm şi se trasează curba de creştere;
- evoluţia pH-ului în timpul biosintezei şi se reprezintă grafic;
- biomasa umedă - WCW (g/l);
- variaţia concentraţiei de amidon din mediu; Concentraţia amidonului din mediu se
determină atât printr-o metodă calitativă (cu reactiv iod), dar şi cantitativ prin metoda Schoorl
pentru diglucide.
- Testul cu reactiv iod: Se preiau într-o eprubetă curată 2 ml de probă filtrată, peste
care se adaugă cu ajutorul unei pipete o picătură de reactiv iod. Iodul din soluţie formează în
combinaţie cu amidonul un compus caracteristic, colorat în albastru. Dispariţia culorii albastre
evidenţiază absenţa amidonului în mediul de cultură.
 - Pe parcursul procesului de biosinteză cantitatea de amidon din mediu scade treptat
datorită sintezei de amilaze de către microorganisme. Acest fenomen este evidenţiat prin reacţia
cu iodul, care la sfârşitul procesului este negativă.
- activitatea amilazică, determinată prin metoda Hostettler (vezi capitolul Metode de
analiză).
- Se notează rezultatele şi se completează în fişa procesului tehnologic de biosinteză.

Prelucrarea mediului de biosinteză

La sfârşitul procesului de biosinteză lichidul de cultură se supune prelucrării în vederea
extracţiei produsului biologic activ biosintetizat - enzimele amilolitice.
Pentru separarea biomasei, mediul de biosinteză este repartizat în eprubete de centifugă
(care apoi sunt echilibrate la balanţa tehnică) şi centrifugat la 5000 rpm, timp de 10 minute. În
urma centrifugării se obţine supernatantul limpede (supernatantul s-a reunit din toate eprubetele),
care va servi la precipitarea cu solvenţi organici iar sedimentul ce conţine biomasa este
îndepărtat.
Lichidul perfect limpede obţinut în urma separării biomasei şi a celorlalte componente
solide din mediu prin centrifugare, este supus precipitării cu acetonă în raport de 2:1. Adaosul
de acetonă se face la rece, sub agitare continuă. Pentru depunerea precipitatului, acesta este lăsat
la frigider, la +4C timp de 24 de ore. După acest interval de timp se recuperează precipitatul
umed prin centrifugare la 5000 rot/min, 10 minute. Acesta se usucă la temperatura camerei
obţinându-se precipitatul uscat. Pentru efectuarea mai rapidă a operaţiei de uscare, după
separarea precipitatului de lichid se usucă produsul în aer liber, pe o sticlă de ceas, timp de câteva
ore.
Pentru a caracteriza preparatul enzimatic parţial purificat obţinut se studiază factorii
care în mod obişnuit influenţează activitatea catalitică a unei enzime:
- pH-ul se studiază în intervalul 6,0-12,0;
- temperatura optimă de acţiune se stabileşte în intervalul 20-800C;
- concentraţia de substrat;
- efectul unor aditivi, agenţi de înălbire, surfactanţi (EDTA, NaCl, CaCl2 etc.).

Evaluarea procesului biotehnologic

Se calculează:
- cantitatea de biomasă umedă - WCW (g/l);
- activitatea amilolitică determinată prin metoda Hostettler (vezi capitolul Metode de
analiză);
- gradul de hidroliză (GH), definit ca raportul între cantitatea de amidon transformată în
glucide reducătoare şi cantitatea totală de amidon supusă hidrolizei enzimatice, aflată în
materia primă.
g
GH(%)=  100
gtotal
unde:
g - conţinutul în glucide reducătoare al mediului de biosinteză (g);
gtotal - conţinutul în amidon din materia primă supusă hidrolizei (g).