EVIDENŢIEREA MICROORGANISMELOR PRODUCĂTOARE DE ENZIME

PROTEOLITICE

Proteinele constituie unul din substratele nutritive pentru microorganisme. Ele nu sunt
direct asimilabile, datorită mărimii moleculei lor şi, de aceea, trebuie degradate în peptide cu
masă mai mică şi apoi în aminoacizi, cu ajutorul enzimelor extracelulare. Proteinele conţinute în
materia organică nevie, care se acumulează în sol şi ape, prin moartea plantelor, animalelor,
microorganismelor, pot fi hidrolizate sub acţiunea proteazelor extracelulare produse de către
bacterii şi mucegaiuri -agenţi ai putrefacţiilor (degradarea proteinelor de origine animală) şi ai
putrezirii (degradarea proteinelor de origine vegetală). Spre deosebire de bacterii şi mucegaiuri,
drojdiile nu pot folosi proteinele din mediu în procesul de nutriţie deoarece ele conţin proteaze
intracelulare, care nu se pot elibera în mediul extern decât prin dezintegrarea învelişurilor
celulare sau moarte prin autoliză.
Proteazele sunt produse de un număr de bacterii ale genului Bacillus, Streptomyces,
Proteus, Clostridium, Pseudomonas şi de mucegaiuri din genul Aspergillus, Rhizopus,
Penicillium, Mucor.

A. Hidroliza cazeinei

Principiul metodei: Coloniile producătoare de enzime proteolitice determină în jurul lor o zonă
clară de liză a cazeinei din mediul de cultură.

Materiale utilizate:
- cutii Petri
- cultura microbiană (Bacillus subtilis)
- ac de inoculare
- bec de gaz
- termostat
- autoclav
- mediu de cultură - cazeină ………………2,5g
- Ca(OH)2…………… 0,15g
 - CaCL2……………….0,05g
- agar-agar……………15g
- apă distilată ………1000ml

Mod de lucru: Mediul de cultură se repartizează câte 200 ml în flacoane Erlenmeyer de 500
ml şI se sterilizează prin autoclavare la 121oC timp de 20 minute, apoi se toarnă câte 15 - 20
ml în plăcile Petri şi se lasă să se solidifice. Însămânţarea plăcilor se efectuează din cultura de
lucru prin înţepare centrală sau din diluţii decimale şi se incubează la 30oC, timp de 48 -72 ore.
Se măsoară diametrul zonei în care se observă dispariţia turbidităţii mediului de cultură ca
urmare a hidrolizei cazeinei, precum şi diametrul coloniei şi se face raportul acestora pentru a se
determina indicele proteolitic:

diametrul zonei de hidroliză a cazeinei

IP =
diametrul coloniei

B. Hidroliza gelatinei

Principiul metodei: Microorganismele producătoare de proteaze extracelulare pot hidroliza

gelatina din mediul de cultură, care îşi pierde astfel proprietatea de a se solidifica la temperaturi
scăzute.

Materiale utilizate:
- cultura microbiană (Bacillus subtilis)
- eprubete cu mediul de cultură conţinând gelatină
- ac de inoculare
- bec de gaz
- termostat
- frigider
- autoclav
- mediul de cultură: - peptonă de carne………….5g
- extract de carne……………3g
- gelatină……………………120g
- apă distilată ………………1000ml

Mod de lucru: Mediul de cultură se repartizează câte 10 mililitri în tuburi prevăzute cu dop de
vată şi se sterilizează în autoclav, timp de 20 minute la 121 oC. După solidificarea mediului
nutritiv (păstrat peste noapte în apă rece), tuburile se inoculează prin înţepare centrală cu tulpina
bacteriană cercetată, apoi se incubează la 37oC timp de 48 ore. După acest interval, culturile se
plasează aproximativ o oră la +4oC, pentru solidificarea gelatinei în cazul în care nu a fost
hidrolizată. Dacă tulpina a prezentat activitate proteolitică, mediul de cultură rămâne lichid după
păstrarea în frigider.
Imagini colonii de Bacillus subtilis producatoare de enzime proteolitice (testul cu cazeina)