Facultatea de Stiinta si Ingineria Alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale, Anul III

TEHNICI DE EXTRACTIE SI RECUPERARE A ENZIMELOR

Tehnici de recuperare a enzimelor in functie de localizare

Pentru obtinerea unei enzime microbiene, fie ca este produsa de celule

procariote (eubacterii, streptomicete) sau eucariote (fungi filamentosi, drojdii), este
foarte important sa se cunoasca mecanismul de biosinteza al enzimei cat si localizarea
acesteia tinand cont ca microorganismele pot produce enzime endogene associate cu
structurile celulare si enzime exogene, care dupa biosinteza sunt eliberate in mediul
extracelular.
Enzimele extracelulare (exogene) sunt enzimele care trec din interiorul
celulei in mediul ambient, difuzand prin invelisurile celulare. Sunt enzime exogene
diferite hidrolaze, care dupa eliberare din celula producatoare, actioneaza asupra unor
substraturi cu masa moleculara mare, care nu pot fi folosite de celula decat dupa
hidroliza la compusi asimilabili.
Enzimele endogene (intracelulare) se gasesc de obicei sub forma unor
asamble, legate de diferite organite. De exemplu, invertaza produsa de fungi
filamentosi (Aspergillus niger) este biosintetizata intracelular apoi, o mare parte este
eliberata exogen in mediul de biosinteza.
Nota: In cazul fermentatiilor derulate in sistem submers, enzimele extracelulare se regasesc
in lichidul cultural dupa operatiile de separare a biomasei prin centrifugare/
filtare, iar enzimele intracelulare se regasesc in biomasa

Tehnici de recuperare a enzimelor in functie de sistemul fermentativ

Fermentatia submersa (SmF) presupune cultivarea microorganismelor in

medii lichide, cu aerare si amestecarea componentelor solide, lichide si gazoase ale
mediului de fermentatie, cand toate celulele prezente in sistemul de fermentare au
acces uniform la nutrientii si oxigenul din mediul fermentativ. In aceste conditii de
cultivare, microorganismele unicelulare cresc si se multiplica modificand proportional
turbiditatea mediului de cultura, iar microorganismele filamentoase formeaza peleti
caracteristici.
In laborator, cultivarea submersa se realizeaza de obicei in vase Erlenmayer,
de diferite capacitati, plasate pe agitator prevazut cu regulator al vitezei si
amplitudinii de agitare.
Fermentatiile submerse au o larga aplicabilitate in biotehnologia preparatelor
enzimatice, mai ales in cazul enzimelor exogene, care sunt eliberate in mediul
fermentativ.
Fermentatia in sistem stationar presupune cultivarea microorganismelor in
culturi statice, de suprafata, pe medii lichide sau semisolide. In functie de natura
mediului de cultura si particularitatile morfologice sau fiziologice ale
microorganismelor prin cultivare stationara pot fi realizate urmatoarele tipuri de
culturi:
Culturi de suprafata obtinute prin cultivarea microorganismelor aerobe, pe
medii de cultura lichide, in vase cu inaltime redusa si suprafata mare de
extindere a culturii ( vase Roux, pentru cultivarea mucegaiurilor, vase Fernbach,
Lucrari practice_Enzimologie aplicata

L1_Tehnici de recuperare si extractie a enzimelor

Facultatea de Stiinta si Ingineria Alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale, Anul III

pentru cultivarea bacteriilor aerobe), cand in functie de particularitatile

morfologice ale culturii se dezvolta la suprafata mediului fermantativ formand
voal subtire (bacterii aerobe, drojdii oxidative), sau derma groasa, cutata, care
sporuleaza caracteristic (mucegaiuri).
Culturi pe substrat solid (SSF) presupune cultivarea microorganismelor pe
substrat solid umed, granulat. In acest caz microorgamismul cultivat se dezvolta
atat la suprafata, cat si in interiorul mediului de cultura. La cultivarea pe medii
semisolide, celulele microorganismului cultivat sunt in contact continuu si direct
cu oxigenul din aer, eliminand astfel inconvenientul major al fermentatiilor
submerse si anume solubilizarea continua si la nivele optime a oxigenului
necesar proceselor de biosinteza celulara. Pe medii solide, celule de bacterii si
drojdii cresc aderand la suprafata particulelor solide, in timp ce fungii
filamentosi sunt capabili sa penetreze adanc in particulele substratului solid
pentru absorbtia nutrientilor. In laborator cultivarea in sistem SSF se realizeaza
in placi Petri, raportul solid:lichid din compozitia mediului fermentativ fiind
optimizat la valori ale aw-ului optime pentru microorganismele cultivate.

Tehnici de extractie a enzimelor

Enzimele extracelulare enzimele exogene sunt eliberate progresiv in

mediul de cultura. Principalele modalitati de separare a biomasei si particulelor
grosiere de lichid cultural in care se afla enzima sunt:
o Centrifugarea se aplica in general pentru culturile de drojdii si bacterii.
Celulele de drojdii, datorita taliei lor mai mari se separa usor la 3000-4000
rotatii/minut, in timp de 20-30 minute. In cazul bacteriilor, regimul de
centrifugare recomandat este de 9000-12000 rotatii/minut, timp de 10 minute.
o Filtrarea se aplica pentru culturile de mucegai, la care centrifugarea este
ineficienta. In laborator, separarea biomasei de mucegai se realizeaza prin
filtrare prin sita textila, cu ochiuri mici.
Enzimele intracelulare se obtin in cantitati corelate cu cantitatea de biomasa,
care se poate separa usor de mediul de cultura lichid si, dupa uscare menajata, la
temperaturi care sa nu conduca la inactivarea enzimei (40-45C), poate fi folosita ca
preparat enzimatic brut. In functie de cantitatea de enzima per gram de biomasa si de
specificitatea enzimei, biomasa poate fi supusa unor operatii fizico-chimice sau
biochimice in scopul eliberarii enzimei si separarea de celelalte componente
neenzimatice.

Lucrari practice_Enzimologie aplicata

L1_Tehnici de recuperare si extractie a enzimelor

Facultatea de Stiinta si Ingineria Alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale, Anul III

Pentru eliberarea si separarea enzimelor intracelulare pentru biomasa obtinuta

prin centrifugare sau filtrare se aplica urmatoarele procedee de rupere a peretilor
celulari:
o Procedee mecanice - cea mai simpla modalitate de rupere a peretilor celulari o
reprezinta, in laborator, mojararea biomasei cu materiale abrazive: nisip fin de
cuart, praf de sticla, pudra de aluminiu. Dupa eliberare enzima se recupereaza
intr-o solutie tampon specifica, care sa-i asigure protectia fata de denaturare.
Pentru dezintegrarea mecanica a peretilor celulari se utilizeaza si mori cu
abrazive ( moara Dyno-Mill cu bile din sticla fara plumb) sau tratamentul
biomasei la presiuni ridicate in prese tip Manton, Gaulin, French.
o Procedee fizice dezintegrarea peretilor celulari prin cicluri repetate de
congelare-decongelare ca urmare a efectului de forfecare provocat de cristalele
de gheata formate. Vibratiile ultrasonice, cu frecventa de cca 20000 Hz,
determina dezagregarea celulelor si eliberarea enzimelor ca urmare a
fenomnului cavitatie, cu fluctuatii de presiune insotite de formarea de
microbule, care oscileaza rapid si implodeaza generand unde de soc, temperaturi
ridicate si radicali liberi. Temperaturile ridicate produse local determina
inactivari termice, iar radicalii liberi determina modificarea ireversibila a
structurii chimice a enzimelor.
o Procedee chimice componentele lipoproteice ale membranelor celulare sunt
hidrolizate sub actiunea detergentilor anionici ( SDS-sodiu dodecil sulfat),
cationici ( cetilpiridinclorid), sau a solventilor (toluen), determinand trecerea in
faza lichida a unora din componentele echipamentului enzimatic.
o Procedee enzimatice - pentru solubilizare pe cale enzimatica a peretilor
celulari se utilizeaza adesea enzime citolitice: -glucanaze, lizozim. Procedeele
enzimatice sunt costisitoare si se utilizeaza pentru cantitati reduse de enzime.
Atunci cand enzima studiata este rezistenta la proteoliza se aplica autoliza
indusa, tratament care ofera rezultate foarte bune pentru separarea invertazei din
celulele de drojdii.
Lichidele de extractie pentru enzime sunt in general solutii care asigura
mentinerea constanta a pH-ului si a unei tarii ionice.
Cele mai eficiente medii pentru extractia enzimelor sunt in ordinea crescatoare
a eficientei lor: NaCl 0,15 M, tampon fosfat sau acetat 0,02 M sau 0,05 M.

Lucrari practice_Enzimologie aplicata

L1_Tehnici de recuperare si extractie a enzimelor

Facultatea de Stiinta si Ingineria Alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale, Anul III

PROTOCOL DE LUCRU
EXTRACTIA INVERTAZEI INTRACELULARE DIN
BIOMASA DE DROJDIE
Material de studiu: biomasa de drojdie de panificatie Saccharomyces cerevisiae

Varianta de lucru 1
Solutie 0,02 M tampon
pH=4,6

Drojdie comprimata
(1g)

Nisip
(1 g)

Mojarare energica

(10 cm3 )
Omogenizare

Extractie

10 minute

10 minute

Completare volum
pana la 25 ml

Centrifugare

6000 rot/min, 10 min

Biomasa reziduala
EXTRACT ENZIMATIC

Determinare continut de proteine in extract,

spectrofotometrie, =280 nm

Lucrari practice_Enzimologie aplicata

L1_Tehnici de recuperare si extractie a enzimelor

Facultatea de Stiinta si Ingineria Alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale, Anul III

Varianta de lucru 2
Solutie 0,02 M tampon
pH=4,6

Drojdie comprimata
(1g)

Nisip
(1 g)

Mojarare energica

(10 cm3 )
Omogenizare

Extractie

10 minute

10 minute

Completare volum
pana la 25 ml

Ultrasonare

Centrifugare

Biomasa reziduala

15 minute

6000 rot/min, 10 min

EXTRACT ENZIMATIC

Determinare continut de proteine in extract,

spectrofotometrie, =280 nm

Lucrari practice_Enzimologie aplicata

L1_Tehnici de recuperare si extractie a enzimelor

Facultatea de Stiinta si Ingineria Alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale, Anul III

Varianta de lucru 3
Solutie 0,02 M tampon
pH=4,6

Drojdie comprimata
(1g)
Mojarare energica

(10 cm3 )
Omogenizare

Completare volum
pana la 25 ml

Ultrasonare

Centrifugare

Biomasa reziduala

30 minute

6000 rot/min, 10 min

EXTRACT ENZIMATIC

Determinare continut de proteine in extract,

spectrofotometrie, =280 nm

Lucrari practice_Enzimologie aplicata

L1_Tehnici de recuperare si extractie a enzimelor

Facultatea de Stiinta si Ingineria Alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale, Anul III

Varianta de lucru 4
Apa distilata

Solutie 0,02 M tampon

pH= 4,6

Drojdie comprimata

Benzen

(5g)
Mojarare energica

(10 cm3 )

pana la 100 cm

5%
Omogenizare

Autoliza

37 C, 1 ora

Centrifugare

6000 rot/min, 10 min

Biomasa reziduala
EXTRACT ENZIMATIC
Determinare continut de proteine in extract,
spectrofotometrie, =280 nm

Calcul
Continut de proteine/g substanta uscata biomasa =

DO280 1
k
Cb su

unde:
DO280= extinctia extractului enzimatic la =280 nm
Cb = cantitatea de biomasa umeda luata in analiza
su = substanta uscata a biomasei
k = coeficient de dilutie (25 sau 100, in functie de volumul total de extract)
Nota: Substanta uscata a biomasei se determina prin uscare la termobalanta

Lucrari practice_Enzimologie aplicata

L1_Tehnici de recuperare si extractie a enzimelor

Facultatea de Stiinta si Ingineria Alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale, Anul III

Centralizare rezultate
Procedeul de
recuperare a
invertazei
intracelulare

DO280 nm

Continut de
proteine/g
substanta uscata
biomasa

Varianta I
Tratament mecanic mojarare biomasa cu
nisip de cuart
Varianta II
Tratament mecanic
(mojarare biomasa cu
nisip de cuart)
combinat cu tratament
cu ultrasunete
Varianta III
Tratament cu
ultrasunete
Varianta IV
Autoliza indusa

Lucrari practice_Enzimologie aplicata

L1_Tehnici de recuperare si extractie a enzimelor

Observatii