Cultura de protoplasti cu regenerare de plante (in vitro)

Protoplaştii sunt celule somatice „nude” lipsite de membrane pectocelulozice rigide

(perete celular) care au capacitatea de a fuziona, de a se divide în continuare şi de a da nastere
la noi plante.

În sens general, prin cultura in vitro se înţelege creşterea pe medii artificiale, în

condiţii de asepsie deplină şi de factori ambientali bine controlaţi, a unor organe, părţi de
organe, ţesuturi sau celule vegetale. Reuşita culturii depinde de o multitudine de factori şi este
vizibilă în momentul în care explantul creşte.
Spre deosebire de multiplicarea tradiţională, unde se operează cu seminţe sau porţiuni
mari de plantă (marcote, butaşi, altoi), la multiplicarea in vitro se folosesc explante mici, de
ordinul milimetrilor sau chiar microscopice (celule, protoplaşti), explante care in condiţii
normale de cultură nu ar reuşi să crească opunand rezistenţă agenţilor patogeni şi
sintetizandu-şi singure substanţele nutritive necesare.
Din sistematica vegetală şi animală se cunoaşte faptul că speciile sunt delimitate prin
bariere de incompatibilitate sexuală, ceea ce reduce posibilităţile de încrucişări interspecifice.
Creşterea variabilităţii genetice, atât de necesară în lucrările de ameliorare şi selecţie,
implică găsirea unor metode de rupere a barierelor de incompatibilitate care izolează speciile
între ele. Aceasta a devenit realizabilă prin crearea de protoplaşti din celulele somatice izolate şi
fuziunea lor, ca unic mijloc de amestecare a genomurilor cloroplastice şi mitocondriale.
La ţesuturile vegetale, membrana celulozică şi stratul petic care asigură sudura dintre
celule face imposibilă manipularea directă a celulelor în scopul fuzionării lor. De aceea s-a
urmărit găsirea unor tehnici de dezagregare a membranei pectocelulozice, ajungând la forma
de
protoplaşti.
Primele încercări de rezolvare a protoplaştilor din ţesuturile vegetale au fost făcute de
Klercker (1892) care a elaborat metoda mecanică de separare a celulelor prin plasmolizare
totală şi microdisecţia membranelor. Această metodă era însă traumatizantă şi puţin eficientă.
 Mai târziu, în 1960, Cocking în Anglia, Otsuki şi Takebe (1969) în Japonia au elaborat
metoda enzimatică de producere a protoplaştilor, metodă în care se folosesc enzime extrase
din
microorganisme ce digeră peretele rigid al celulelor vegetale.
Metoda elaborată de Cocking, utilizată până în prezent, permite obţinerea unei cantităţi
mari de material biologic modificat, cu menţinerea viabilităţii şi structurii nealterate a celulelor.
Takebe (1971) a obţinut primii protoplaşti viabili, prin digerarea enzimatică a
membranelor celulozice de la celulele frunzelor de tutun. Au urmat realizări privind obţinerea
deprotoplaşti la Daucus carota (morcov) - Grambow (1972) şi la Petunia hybrida (Hess,1973).
Protoplaştii pot fi izolaţi din toate organele şi ţesuturile plantelor, mai ales din
mezofilul
frunzelor, ţesuturi epidermale, rădăcini şi nodozităţi ale rădăcinilor, muguri, petale,
grăuncioare de polen în curs de germinare, fructe, seminţe şi din ţesuturi cultivate „in vitro”.
Materialul cel mai utilizat este reprezentat de frunze de la care se ia epidermă inferioară
prin jupuire sau printr-un tratament enzimatic. Dintr-un gram de frunze proaspete se pot obţine
circa un milion de protoplaşti şi câteva milioane de plante noi.
Mai recent, au început să fie utilizate fragmente de calus, izolate din culturi de ţesuturi
„in vitro” (care au o creştere rapidă dacă sunt asigurate condiţii riguros controlabile).
Protoplaştii se obţin de obicei prin tratarea ţesuturilor vegetale genitoare, secţionate în
fragmente înguste, în condiţii aseptice, cu un amestec de enzime, capabile să degradeze
peretele celular, în soluţii care conţin stabilizatori osmotici (protectori) necesari pentru a păstra
structura celulară şi a menţine viabilitatea acestora. Principalii stabilizatori osmotici folosiţi în
doze reduse sunt: manitol, sorbitol, amestec de polivinilpirolidină (2%) cu zaharoză.

Tehnologia culturilor de protoplaşti

Tehnologia culturilor de protoplaşti necesită cunoaştera şi stăpânirea

completă a
diferitelor etape care pornesc de la explantul donor până la planta
regenerată:
 obţinerea de protoplaşti viabili;
 regenerarea pereţilor celulari;
 inţierea diviziunilor celulare;
 menţinerea diviziunilor până la obţinerea microcalusurilor;
 regenerarea plantelor din aceste calusuri.

Etape ale cultivării protoplaştilor

1. Izolarea protoplaştilor se poate realiza prin 2 metode:

- metoda mecanică (presupune tăierea ţesutului vegetal plasmolizat în
prealabil, în fâşii subţiri şi microdisecţia membranelor)
- metoda enzimatică

Izolarea protoplaştilor prin metoda enzimatică

 În compoziţia peretelui celular au fost identificate 3 componente de bază:
celuloză,hemiceluloză şi substanţe pectice. De aceea, după o plasmolizare uşoară, pentru
izolarea protoplaştilor se folosesc trei categorii de enzime: pectinaze, celuloze şi hemiceluloze
care sunt introduse în ţesuturi prin metoda infiltraţiei „in vacuum”.
Aceste enzime cu activitate hidrolizantă sunt extrase din microorganisme (Aspergilus
niger, Trichoderma viride) şi dispersate în soluţii apoase cu concentraţii cunoscute.
În prezent produsul comercial cel mai utilizat în tehnologia protoplaştilor este celuloza
Onazuka R-10, iar dintre pectinaze o largă utilizare o au preparatul Macerozyme R-10).
Tratamentul cu enzime se realizează timp de 4-18 ore, la temperatura de 25-27 0C, pentru a
asigura hidrolizarea pectinelor şi a moleculelor de celuloză din membrane.
Între factorii implicaţi în izolarea cu succes a protoplaştilor vegetali, pe lângă tipul şi
concentraţia enzimelor hidrolitice se menţionează: specia vegetală, explantul utilizat (frunze,
cotiledoane, rădăcini, calus), alegerea agentului plasmolizant corespunzător, metodele şi
condiţiile de incubare (durată, temperatură, lumină), metodele de purificare.
Izolarea protoplaştilor din mediul de incubaţie se face prin 2-3 centrifugări la viteze
reduse, timp de 7-10 minute (asigurând sedimentarea lor), după care urmează spălarea restului
de enzime cu soluţie de zaharoză (15-20 %) şi NaCl.
2. Purificarea. Procesul de izolare a protoplaştilor este urmat de etapa de purificare,
care este necesară pentru obţinerea unor suspensii celulare pure, necontaminate cu resturi de
celule distruse sau pereţi celulari nedigeraţi. Purificarea se realizează prin centrifugări şi
resuspendări succesive în soluţia cu stabilizator osmotic.
După centrifugare, la interfaţa dintre cele două soluţii se formează un inel de culoare
verde în care sunt concentraţi protoplaşti viabili, iar resturile nedigerate şi celulele moarte se
depun la fundul eprubetei.
3. Incubarea. Timpul de incubare variază în funcţie de natura şi vârsta materialului
biologic iniţial utilizat pentru izolare.
Protoplaştii în stare purificată sunt trecuţi în alte medii lichide. Mediul de cultură este
foarte complet, bogat în săruri minerale, vitamine, substanţe stimulatoare de creştere,
asigurând regenerarea unui nou perete celular.
La unele specii, protoplaştii regenerează peretele celular în 2-3 zile şi concomitent intră
în diviziune. După 20-25 zile se formează o colonie celulară, din care va apare un calus (30-45
zile). Din calus vor genera lăstari vegetativi sau rădăcini, în funcţie de suplimentarea mediului
nutritiv cu citochinine sau auxine.
Plantulele înrădăcinate (mature) se formează în 4-6 luni, după care sunt transplantate în
seră (pe perlit sau sol).
 Testarea viabilităţii protoplaştilor.

Înainte de a se efectua o cultură de protoplaşti este

necesar să se determine viabilitatea acestora. Se realizează prin examinarea suspensiei de
protoplaşti la microscopul optic. Protoplaştii viabili prezintă curenţi citoplasmatici, evidenţiaţi
prin deplasări ordonate ale mitocondriilor, au formă perfect sferică, iar cloroplastele sunt
aranjate ordonat în stratul citoplasmatic periferic. Protoplaştii morţi (distruşi) prezintă forme
neregulate, iar cloroplastele formează aglomerări la unul din polii celulei.
Testarea viabilităţii protoplaştilor se face şi prin metode colorimetrice. Analizarea
suspensiei de protoplaşti la microscopul optic cu fluorescenţă, permite distincţia între
protoplaştii viabili care prezintă o fluorescenţă galben-verzuie, datorită prezenţei clorofilei şi cei
neviabili care au o fluorescenţă roşie.
Aplicaţii la plantele floricole
Protoplaştii sunt celule vegetale folosite pentru manipularea materialului genetic. Pot fi
utilizaţi pentru fuzionare şi hibridare somatică, pentru transformare cu ADN exogen, pentru
transferul de cromozomi, nuclee şi diverse organite celulare, pentru studiul virozelor vegetale,
pentru elucidarea modului de acţiune al agenţilor patogeni bacterieni şi fungici.
Această tehnică permite:
 cercetări aprofundate asupra funcţionării celulei;
 aplicarea de tratamente mutagene la celule izolate;
 obţinerea unor plante rezistente la bacterii, ciuperci şi chiar dăunători;
 permite manipulări genetice ca introducerea sau substituirea de gene.
În momentul de faţă lista speciilor de plante floricole de interes economic la care s-a
realizat regenerarea de plante de la protoplaşti este destul de cuprinzătoare. Ex.: Digitalis
lanata, D. purpurea, Helianthus annuus, Ipomoea batatas, Lolium multiflorum, L. corniculatus,
Nicotiana sp., etc.
Tehnologia culturilor de protoplaşti necesită cunoaştera şi stăpânirea completă a
diferitelor etape care pornesc de la explantul donor până la planta regenerată: obţinerea de
protoplaşti viabili, regenerarea pereţilor celulari şi inţierea diviziunilor celulare, menţinerea
diviziunilor până la obţinerea microcalusurilor şi regenerarea plantelor din aceste calusuri.