INTRODUCERE ÎN CULTURILE DE CELULE ŞI Ţ

E S U T U R I VEGETALE

Sfârşitul mileniului doi se caracterizează printr-o

puternică implicare a biotehnologieiîn viaţa omului, în
toate domeniile de activitate. Cu ajutorul metodelor
biotehnologice s-aufăcut progrese uriaşe în crearea
de noi genotipuri de plante şi rase de animale cu
însuşirifavorabile şi cu randamente sporite faţă de
materialul de la care s-a plecat.Dezvoltarea biologiei
moleculare din ultima jumătate de secol s-a făcut, în
principal,  p e   o r g a n i s m e   s i m p l e   c a   m o d   d e   o r g a
nizare (bacterii, drojdii, alge, etc.), organis
m e unicelulare. Odată cu abordarea organismelor
pluricelulare trebuia verificat dacă
noţiunileacumulate anterior erau valabile şi dacă
existau şi alte procese specifice modului complex
deorganizare. Cunoscându-se comportamentul
organismelor simple, cercetătorii au început să
segândească la cultura pe medii artificiale a unor
porţiuni de plante sau chiar celule. Problemacare a
apărut a fost aceea a menţinerii viabilităţii acestor
celule, de la prelevarea de pe plantamamă până la
trecerea pe mediu nutritiv artificial sau mai
departe până la regenerarea (refacerea) unei noi
plante.Ajungerea la cultura
1
in vitro
nu a fost aşa de simplă cum s-a presupus
fiind necesar mult timp şi multe cercetări, la început fără
succes, dar apoi totul s-a clarificat.În 1882, Sachs a fost
cel care a elaborat teoria conform căreia plantele îşi
sintetizeazăsubstanţele ce determină formarea
organelor, substanţe ce au o dispunere polară, iar
primeleîncercări de culturi de ţesuturi au fost făcute în
1902, de către Haberland, din nefericire, fărărezultatele
dorite. Primele rezultate privind cultura de celule şi
ţesuturi încep să apară din anul1922, când Knudson
reuşeşte germinarea seminţelor de orhidee
in vitro
iar Robbins obţine prima cultură de ţesut de rădăcină în
condiţii
artificiale.Pe baza conceptului de totipotenţă celu
lară, conform căruia fiecare celulă conţineinfor
maţia genetică necesară obţinerii prin regenerare a
unui organism vegetal complet, înanul 1952 Morel
şi Martin au stabilit şi au perfecţionat
o metodologie de cultivare pe mediiaseptice a
explantelormeristematicecaulinare, obţinând prin
creşterea
in vitro
a acestora plante sănătoase, libere de viroze, pornind de
la plante mamă contaminate cu diferite viroze.În acest
mod se produce material de plantat devirozat, cu o rată
de multiplicare într-un ritmimposibil de imaginat prin
utilizarea tehnicilor tradiţionale de înmulţire vegetativă,
evitându-se şi degenerarea soiurilor din cauza infecţiilor
2
virale, transmisibile prin înmulţire vegetativă.În anul
1962, după mulţi ani de studii şi încercări,
Murashige şi Skoog, au reuşit săelaboreze un mediu
de cultură considerat ca fiind de bază , care – cu mici
modificări – poate fiutilizat pentru aproape toate tipurile
de culturi de ţesuturi.Reuşita experienţelor lui Coking în
1960 privind izolarea enzimatică a protoplaştilor
dinmezofil foliar, a făcut posibilă obţinerea
unor populaţii mari de protoplaşti iar apoi producereade
hibrizi somatici.Anul 1966 este considerat drept
începutul etapei moderne a cercetărilor privind
culturadeexplante vegetale
in vitro
. Această etapă s-a caracterizat, în primul rând prin
elaborarea detehnici eficiente în generarea,
cultivarea şi fuzionarea protoplaştilor vegetali. Cu
ajutorul protoplaştilor, odată cu descoperirea noilor
tehnici (electrofuziune, vectori virali transmiţătoride
gene izolate) s-au obţinut plante rezistente la
acţiunea unor agenţi stresanţi cum ar fi: pesticide,
linii celulare rezistente la stres hidric, termic etc.Atât pe
continentul american cât şi pe cel european sau asiatic,
culturile
in vitro
suntfolosite în special pentru multiplicarea speciilor
floricole ornamentale, urmat de multiplicareaspeciilor
arboricole ornamentale şi fructifere, dar şi pentru
realizarea de noi genotipuri saumai ales pentru
regenerarea celor create prin inginerie genetică.

3
1.1.1 Definiţie
În sens general, prin cultura
in vitro
se înţelege creşterea pe medii artificiale, încondiţii
de asepsie deplină şi de factori ambientali bine
controlaţi, a unor organe, părţi deorgane, ţesuturi sau
celule vegetale. Reuşita culturii depinde de
o multitudine de factori şi estevizibilă în momentul în
care explantulcreşte.Explantul, numit şi inocul,
este porţiunea de plantă (organ, ţesut, celulă)
care sedesprinde de pe planta donor (planta mamă), şi
se inoculează în condiţii sterile pe un mediuartificial de
cultură. Evoluţia explantului este dirijată de operator în
funcţie de scopul urmărit.Acesta poate evolua
formând o nouă plantă (sau mai multe plante -
neoplantule), prinstimularea dezvoltării organelor
aeriene (tulpina şi frunzele) şi a rădăcinii, sau poate
formacalus, prin stimularea înmulţirii nediferenţiate a
celulelor.Explantul constituie unitatea vie ce conţine
în celule întreaga informaţie genetică a plantei
mamă şi pe baza totipotenţei este capabil de a
regenera una sau mai multe planteidentice cu planta
donor.Totipotenţa, este însuşirea celulelor vegetale de a
se divide, de a se reproduce şi de aforma o plantă
identică cu planta mamă. Teoretic fiecare celulă vie
este totipotentă, însă în practică s-a observat că nu
toate celulele au capacitatea de a-şi exprima acest
caracter, datorită pe de o parte diferenţierii
celulare şi îmbătrânirii, iar pe de altă parte
gradului mare despecializare al acelor
4
celule.Astfel, s-a demonstrat practic că, într-o 
plantă matură, celulele specializate careconstitui
e ţesuturile, de exemplu: traheidele, fibrele libero-
lemnoase, sclereidele, etc, la carelipseşte citoplasma şi
nucleul, nu sunt totipotente. Acest aspect este explicat
chiar prin faptulcă întreaga informaţie genetică a celulei
totipotente se află în cromozomii din nucleu.La
plantele cormofite, odată cu înaintarea în
vârstă, o parte din celule îşi pierd capacitatea de
totipotenţă sau aceasta se reduce foarte mult. Rămân,
însă, anumite zone în careactivitatea celulelor este
intensă, având loc diviziunea şi formarea aproape
continuă de noicelule. Aceste celule sunt mici în
dimensiuni, poligonale, bogate în citoplasmă, au
vacuolămică şi nucleu mare dispus central şi
prezintă o membrană celulozică, formând ţesutul
cudenumirea de meristem.Meristemele sunt zonele
generatoare de celule necesare creşterii în lungime şi
grosimea plantelor, fiind dispuse terminal atât în tulpină
cât şi în rădăcini.

1.1.2 Caracteristicile culturilor in vitro

5
Spre deosebire de multiplicarea tradiţională, unde se
operează cu seminţe sau porţiunimari de plantă
(marcote, butaşi, altoi), la multiplicarea
in vitro
se folosesc explante mici, deordinul milimetrilor sau
chiar microscopice (celule, protoplaşti), explante
care în
condiţiin o r m a l e   d e   c u l t u r ă   n u   a r   r e u ş i   s ă   c r e a
scă opunând rezistenţă agenţilor patogeni şi
sintetizându-şi singure substanţele nutritive
necesare.D i n   a c e s t   m o t i v ,   p e n t r u   r e u ş i t a   c u l t u
r i i   d e   c e l u l e   ş i   ţ e s u t u r i   s e   c e r   r e s p e c t a t e urmă
toarele condiţii:-prepararea unui mediu de creştere care
să asigure o bună nutriţie heterotrofă a explantului, prin
asigurarea sursei de carbon organic uşor accesibil
explantelor;
 
-asigurarea şi controlarea factorilor de mediu
(temperatură, lumină, umiditate) în limiteleoptime
pentru fiecare specie, soi şi fază de creştere, în funcţie
de cerinţele acestora şi scopulurmărit;-
stimularea creşterii şi diferenţierii sau d
e d i f e r e n ţ i e r i i   o r g a n e l o r   p r i n   u t i l i z a r e a cor
espunzătoare a substanţelor stimulatoare de creştere;-
asigurarea unei asepsii depline pe tot fluxul de
producere a plantelor 
in vitro
, prin dezinfecţiamaterialului vegetal, sterilizarea
mediului şi a vaselor de cultură, precum şi efectuarea

6
tuturor operaţiilor în hota cu flux de aer laminar steril,
folosind instrumentar sterilizat prin flambare.

1.1.3 Domenii de aplicare a culturilor in vitro

7
Datorită spectrului larg de probleme la care culturile
in vitro
au răspuns afirmativ, suntutilizate în prezent în
agricultură, silvicultură, farmacie, industria alimentară,
industria uşoară,etc. În agricultură, în general şi în
horticultură în special, culturile de ţesuturi şi celule
suntfolosite pentru multiplicarea unor
specii, soiuri sau clone valoroase, pentru ameliorar
easpeciilor cultivate, pentru conservarea germoplasmei
horticole, pentru obţinerea de
metaboliţisecundari.Avantajele culturii
in vitro
sunt multiple, dintre care amintim:-asigură multiplicarea
clonală rapidă a unor soiuri, hibrizi sau clone valoroase
pornindde la cantităţi mici de material vegetal. Teoretic,
se asigură o multiplicare exponenţială, princare în circa
6 luni se pot obţine 1 milion de plante;-se poate produce
material săditor liber de viroze şi micoplasme, material
mai viguros, precoce şi productiv;-necesită spaţii mici
de cultură şi se valorifică bine spaţiul din laborator prin
cultura peverticală pe 3-5 nivele suprapuse;-obţinerea de
plante haploide, prin cultura de polen, antere sau alte
explante de ţesuturigenerative (cu n cromozomi);-dă
posibilitatea obţinerii hibrizilor interspecifici prin
fecundarea
in vitro
, hibrizi careîn condiţii normale sunt imposibil de
obţinut;-selecţia de plante rezistente la stres, boli şi
dăunători;-se evită efectul sezonier de pepinieră;-se pot
obţine seminţe artificiale;-se pot obţine plante pe
8
rădăcini proprii evitând astfel cheltuielile de altoire;-
asigură multiplicarea clonală a portaltoilor care nu
înrădăcinează în condiţii normalede cultură;-asigură
păstrarea materialului în faza de plantulă până la
primirea unor comenziferme de multiplicare.Cu toate
aceste avantaje, există specii care nu răspund bine la
cultura
in vitro
şi care,deocamdată rămân să fie înmulţite
tradiţional.Există însă şi câteva impedimente în
utilizarea acestei metode pentru înmulţirea înmasă a
plantelor, cum ar fi:-necesitatea unui laborator cu
dotările minime: instalaţii şi aparate
indispensabileactivităţilor de micropropagare, care
sunt costisitoare;-necesitatea unui personal specializat în
multiplicarea clonală şi manipularea
in vitro
;-utilizarea fitohormonilor, care sunt scumpi şi
puţin accesibili tuturor unităţilor de producţie;-nu se
poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau
soiuri, care nu răspundla metodele cunoscute de
multiplicare;-există riscul apariţiei şi multiplicării
mutaţiilor recesive, cu afectarea
autenticităţiisoiurilor;