Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
1
formează picătura ce o conţine, aceasta este încărcată electric de către un inel cu sarcină
electrică (o sarcina pozitiva sau negativa este aplicata pe inel, iar sarcina de semn opus se
acumulează pe suprafaţa picăturii). Ulterior
picăturile sunt deflectate într-un vas de
colectare sau altul pe baza sarcinii electrice.
Culturile celulare
2
Linii celulare eucariote.
3
anticorpi şi vaccinuri. Aceste linii celulare prezintă avantajul reproductibilităţii faţă de
culturile celulare primare şi modelele animale, precum şi potenţial pentru producţia pe
scară largă. In plus, liniile celulare animale sunt capabile în general să secrete proteine
funcţionale active, pliate normal şi corect modificate posttranslaţional spre deosebire de
proteinele produse de bacterii sau drojdii. In cadrul sintezei proteinelor recombinate,
fidelitatea glicozilării acestora este un aspect esenţial care influenţiază secreţia,
degradarea şi activitatea lor biologică. Cercetările comparative privind glicozilarea
proteinelor recombinate în sistemele de expresie de la bacterii, insecte şi mamaliene au
evidenţiat diferenţe între acest proces şi profilul glicozilării din celulele umane.
Medii de cultură.
Iniţial, culturile celulare s-au realizat pe lichide tisulare coagulate cum ar fi sânge. In
prezent pentru majoritatea determinărilor de rutină se utilizează medii compuse dintr-un
amestec bine definit de săruri, aminoacizi, vitamine dar care conţin şi o proporţie
importantă de material biologic (ser de cal, ser bovin fetal1, extract embrionar de pui de
găină). Aceste medii sunt însă improprii pentru stabilirea factorilor specifici de creştere şi
diferenţiere ai unui anumit tip celular întrucât conţin multe substanţe necunoscute
provenite din materialul biologic adăugat în mediu. Pentru compensarea acestor
neajunsuri au fost puse las punct medii sintetice cu compoziţie chimică definită şi
specifică pentru creşterea unui tip celular dat. Aceste medii conţin săruri minerale,
aminoacizi, vitamine, monozaharide, antibiotice etc., dar şi unul sau mai mulţi factori de
creştere de natură proteică necesari creşterii şi proliferării celulelor în cultură. De ex.
unele celule necesită adăugarea în mediu a unor cantităţi infime de NGF (nerve growth
factor) pentru diferențierea şi supraviețuirea lor.
Adaptarea a numeroase linii celulare la creşterea în medii de cultură fără ser şi
proteine a facilitat nu numai cercetarea şi procesarea ulterioară a produşilor de secreţie ci
şi minimalizarea riscurilor potenţiale de contaminare cu virusuri şi micoplasme care
poate fi neintenţionat realizată prin adăugarea de seruri sau derivaţi de proteine animale
precum factorii de creştere. Totodată, liniile celulare mamaliene transfectate cu o
varietate de sisteme de expresie au fost utilizate pe larg pentru exprimarea proteinelor
recombinate cu uz comercial şi terapeutic. Pentru anumite linii celulare este necesar un
acord de licenţă în vederea utilizării lor în producţia comercială deşi un astfel de acord nu
este necesar, în general, pentru aplicaţiile de cercetare şi dezvoltare.
Eagle′s Basal Medium (BME). Acest mediu bazal este rezultatul unei serii de studii de
la sfârșitul anilor 50 ai secolului XX ce şi-au propus să stabilească nutrienţii esențiali şi
alţi factori necesari pentru creșterea celulelor animale în cultură. BME este un mediu
dezvoltat de Harry Eagle şi unul din cele mai utilizate medii de creștere sintetice. Eagle a
descris mai multe medii “bazale”, cu deosebiri minore între ele. Tissue Culture
Association recomandă utilizarea denumirii de Eagle′s Basal Medium doar pentru
formula dezvoltată pentru cultivarea celuleor HeLa. BME, suplimentat cu ser fetal bovin
(FBS) poate fi utilizat pentru creșterea în monostrat a unei game largi de celule normale
1
fetal bovine serum, prescurtat FBS
4
sau transformate. BME este predecesorul Eagle′s Minimum Essential Medium (EMEM)
şi Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM).
Eagle's minimal essential medium (EMEM). Încercările inițiale de a cultiva fibroblaşti
de mamifere și anumite subtipuri de celule HeLa a arătat că acestea au necesități
nutriționale ce nu puteau fi satisfăcute de Eagle's Basal Medium (BME). Cercetări ce au
utilizat aceste celule au arătat că BME poate fi suplimentat pentru a facilita creșterea
acestor culturi de celule mai pretențioase. EMEM este un mediu de cultură dezvoltat
de Harry Eagle ce conține aceste modificări. Principala modificare a EMEM faţă de BME
este o concentrație mai mare de aminoacizi pentru a aproxima mai bine compoziția
proteică a celulelor mamaliene. Suplimentarea opțională cu aminoacizi neesențiali în
formulele ce conțin săruri Earle (sau Hank) a lărgit mult plaja de utilizare a acestui
mediu. In formularea standard el este utilizat pentru creșterea celulelor în monostrat, dar
modificări suplimentare prin eliminarea ionilor de calciu din formula permit creșterea
celulelor în suspensie.
Acesta conține:
• aminoacizi
• săruri: clorură de calciu, clorură de potasiu, clorură de sodiu, fosfat monosodic şi sulfat
de magneziu; acest amestec de săruri poartă numele de Earle's Balanced Salts Solution
(EBSS)
• glucoză
• vitamine (acid folic, nicotinamidă, riboflavină, B12)
In loc de L-glutamină se poate adăuga L-alanil- sau L-glicil-L-glutamină, care sunt mai
stabile din punct de vedere chimic. Aceasta duce la scăderea cantităţii de amoniu
acumulat în mediu.
Roswell Park Memorial Institute medium, denumit uzual mediu RPMI, este un mediu
de cultură dezvoltat şi utilizat inițial pentru cultivarea limfocitelor umane. Acest mediu
conține o cantitate mare de fosfați şi este formulat pentru a fi utilizat într-o atmosferă cu
5
5% CO2. Varianta RPMI 1640 este utilizată pentru înmulțirea pe medii fără ser a
limfocitelor umane.
RPMI 1640 folosește ca sistem tampon sistemul bicarbonat şi se deosebește de celelalte
medii de cultură pentru celule animale printr-un pH de 8. Suplimentat cu FBS sau cu un
substitut de ser, RPMI 1640 permite cultivarea multor tipuri celulare, în special limfocite
T şi B, celule hibridoma şi celule medulare.
pH-ul mediilor de cultură. Majoritatea celulelor au nevoie de un pH de 7,2–7,4 şi un
control adecvat al pH-ului este esențial. Există deviaţii de la acest optimum. Fibroblaştii
preferă un pH mai ridicat, de 7,4–7,7, iar liniile celulare transformate au nevoie de
condiții mai acide, cu pH 7,0–7,4. Controlul pH-ului este foarte important în special după
inocularea culturii. Există două modalități de ajustare şi menținere a pH-ului:
• Sistemul "natural" în care CO2 gazos este în echilibru cu ionii carbonat şi
hidrocarbonat (CO32- / HCO3-) din mediul de cultură.
• Sisteme tampon chimice ce folosesc un amfion (zwitterion) numit HEPES.
Culturile celulare ce folosesc sistemul natural CO2/bicarbonat trebuie menținute într-o
atmosferă cu 5-10% CO2 obținută într-un incubator cu CO2. Costul bioxidului de carbon
şi al bicarbonatului este redus și acestea nu sunt toxice pentru celule. DMEM a fost
dezvoltat înaintea apariției incubatoarelor cu CO2, când mediile erau gazate prin pompare
de CO2 pur prin mediu. Ca rezultat se ajunge la 10% CO2 și 3,7 g/l bicarbonat de sodiu.
Mediile dezvoltate mai recent, cum ar fi Alpha MEM, conțin 2,2 g/l bicarbonat, cantitate
optimizată pentru 5% CO2, concentrație posibilă în incubatoarele cu CO2. DMEM este
frecvent folosit cu CO2 5% dar capacitatea sa optimă de tamponare este la 10%. In lipsa
CO2, ionul bicarbonat va prelua protoni de la acidul carbonic. Acesta va disocia
transformându-se în CO2. Ca rezultat, prin pierderea acidului carbonic mediul devine mai
alcalin.
HEPES are capacitate de tamponare superioară în gama de pH 7,2 – 7,4 dar este
mai scump și poate fi toxic pentru anumite tipuri celulare la concentrații mai mari.
Culturile celulare tamponate cu HEPES nu necesită o atmosferă controlată. HEPES poate
fi adăugat la DMEM pentru a reduce fluctuațiile de pH atunci când culturile sunt
manipulate în afara incubatorului. Concentrația uzuala este de 20 mM.
Majoritatea mediilor de cultură folosesc ca indicator de pH roșu fenol, pentru a
putea monitoriza oricând variațiile pH-ului. Culoarea mediului este roșiatică la un pH =
7,4. Mediul de cultură începe să vireze spre oranj la pH = 7 şi devine galben la pH = 6,5
(acid). Înainte ca mediul să devină complet oranj acesta trebuie schimbat. O virare
treptată a mediului de la roșu spre galben este un semnal pozitiv, întrucât indică creștere
celulară, metaboliții produși de celule acidificând mediul. O acidificare bruscă însă poate
indica contaminare cu bacterii, care se dezvoltă mult mai rapid decât celulele animale,
sau moarte celulară şi acidificare din cauza celulelor descompuse. O virare spre roz la pH
= 7,6 apoi fuxia (roşu-violet) la pH = 7,8 indică alcalinizarea mediului.
6
Modificarea culorii DMEM o dată cu schimbarea pH-ului (DMEM cu 40μM roşu fenol). Imaginea color
poate fi văzută la https://en.wikipedia.org/wiki/Phenol_red#/media/File:Phenol_red_pH_6,0_-_8,0.jpg
Este posibil ca două celule cu origini diferite să fuzioneze rezultând un heterocarion, care
este o celulă cu două nuclee distincte separate. Fuzionarea se realizează prin tratarea
suspensiei celulare mixte fie cu virusuri inactivate, fie cu PEG (polietilen glicol). Aceşti
agenţi modifică plasmalema celor două celule, permițând fuzionarea. Prin fuzionare are
loc amestecul componentelor celor doi parteneri de fuziune şi inclusiv transferul unor
proprietăți de la o celulă la cealaltă. De ex. un nucleu inert al unei hematii de pui de găină
poate fi activat, începând să sintetizeze ARN şi apoi să-şi replice ADN-ul, în urma
fuziunii cu o celulă cu creştere activă aflată în cultură. Următorul pas după formarea
heterocarionului este fuzionarea celor doi nuclei rezultând o celulă hibridă ce posedă un
nucleu voluminos ce conține în amestec cele două seturi de cromozomi de origini diferite.
Celulele hibride pot da naştere prin clonare la linii celulare hibride însă frecvent aceste
linii sunt instabile şi pierd preferenţial cromozomi care provin de la una dintre celulele
care au fuzionat. De exemplu celulele hibride om-şoarece, pierd preferenţial cromozomii
umani din motive necunoscute, rezultând o varietate de linii celulare hibride, fiecare
conţinând unul sau câțiva cromozomi umani. Acest fenomen a fost utilizat cu succes în
cartarea inițială a genomului uman, întrucât absența unui anumit cromozom duce şi la
absenţa genelor de pe acesta, iar liniei celulare respective îi lipsesc anumite caractere sau
prezenţa unui anumit cromozom conferă noi caractere liniei celulare. De ex. numai
celulele hibride care au cromozomul 11 uman sintetizează insulină, deci această genă este
plasată pe cromozomul uman 11.
7
Exemple de linii de celule animale.
Condiţii de cultură. Culturile în suspensie se realizează folosind mediul F12 cu 10% ser
fetal bovin (FBS) şi barbotând continuu CO2 5% în vasele de cultură. In aceste conditii,
timpul pentru a obţine o cultură în monostrat este obişnuit de 18 h. Mediile de cultură
pentru celulele CHO dhfr- trebuie să conţină adiţional hipoxantină (sau adenină), glicină
şi timină, faţă de celule CHO, care nu necesită decât prolină.
2. Linia celulară Sf 9
Celulele Sf 9 reprezintă un derivat obţinut prin clonarea liniei ovariene pupale ale
fluturelui Spodoptera frugiperda. Inalta susceptibilitate a linei Sf 9 la infecţia cu
baculovirus, capacitatea de creştere rapidă la 26oC şi rata înaltă de secreţie a proteinelor,
8
fac din aceste celule un sistem adecvat pentru producerea proteinelor recombinante,
utilizând sisteme de vectori de expresie bazate pe baculovirusuri manipulate genetic (de
ex. cel bazat pe virusul polidrozei nucleare de la Antographa californica (ACMNPV)
Sistemele de expresie pe baculovirusuri s-au dovedit a avea capacitatea de a sintetiza
proteine funcţionale cu rate înalte si întrucât aceste virusuri sunt incapabile sa infecteze
celule mamaliene ci doar un număr restrâns de specii înrudite de insecte, ele sunt
considerate ca o alternativa sigura comparativ cu alţi vectori virali. Forma sferică a
celulelor Sf9 le conferă acestora o rezistenţă crescută la şocurile mecanice care constituie
o condiţie importantă pentru culturile în suspensie. In plus, capacitatea de creştere rapidă
a acestor celule conferă avantajul reducerii timpului de incubaţie, condiţii de mentinere
nepretenţioase şi o recoltă crescută de celule pe unitatea de nutrient.
Celulele Sf 9 au fost utilizate pentru producerea betalactoglobulinei bovine
recombinate, antistazinei, receptorului beta adrenergic, a bioinsecticidelor si a vaccinului
contra gripei aviare H5N1.
Linia Sf 9 a fost adaptată pentru creşterea în medii fără ser, în flacoane agitate mecanic
şi tancuri rotative, culturile putând fi controlate promt în vederea obţinerii unei producţii
înalte de proteine. Infecţiile culturilor cu baculovirus pot fi uşor monitorizate prin
măsurarea creşterii volumului celular şi a scăderii viabilităţii celulare. După mai multe
zile de la începutul infecţiei virale, celulele lizează eliberând în mediu proteinele
recombinante pe care le-au sintetizat. Titrul acestor produse proteice este influenţat de
necesităţile de oxigen ale celulelor Sf 9.
9
regiunea de replicare timpurie. Replicarea vectorului SV40 se realizează după maxim 2
zile.
Celulele COS au fost utilizate pentru producerea de proteine recombinante printre care
glicoproteina HSV-1, lanţul B al ricinei, fosfataza alcalină placentară, trombomodulina,
receptorul CD7, beta glocuronidaza umana, interleukina 5 şi interferonul-β-1 uman.
10
Condiţii de cultură. Celulele NIH/3T3 sunt cultivate în DMEM cu FBS 10 %. Celulele
prezintă o puternică inhibiţie de contact şi sunt sensibile la formarea flocoanelor în serul
de cultură.
Condiţii de cultură. Celulele HeLa sunt cultivate în mediu Eagle (EBSS) suplimentat cu
glutamină, aminoacizi neesenţiali şi FBS 10 %. Iniţial ele au servit la dezvoltarea
primelor medii de cultura pentru celule umane, care conţineau componente precum
omogenat din făt bovin, sânge de găina obţinut prin puncţie cardiaca, sânge din cordon
ombilical uman etc. Aceste componente erau utilizate pentru conţinutul lor în factori de
creştere necesari in cantităţi infime pentru dezvoltarea si multiplicarea celulelor.
11
secretoare de Ig de interes (limfocite B), iar prin selecţie şi creare de clone rezultă hibrizi
care produc şi secretă doar un anticorp specific (linii Hibridoma).
Liniile celulare Sp2/0-Ag 14 de tip mieloma par să fuzioneze preferenţial cu
celulele splenice aflate în diviziune, care sunt principalele celule secretoare de Ig şi
formatoare de plaje de liză.
Condiţii de cultură. Celulele sunt cultivate în mediul pentru leucocite RPMI (dezvoltat
de Moore et al., la Roswell Park Memorial Institute) ce conţine glutamină şi FBS 10 %.
Celulele sunt rezistente la prezenţa 8-azoguaninei, dar mor când sunt cultivate în mediul
HAT (mediu hipoxanitina-aminopteridina-timidina).
12
Astfel, meiul HAT este un mediu selectiv pentru celulele ce prezintă copii
funcționale ale genelor pentru TK şi HGPRT, analog cu mediile ce conțin antibiotice și
servesc la selectarea de bacterii ce prezintă rezistență la acestea.
3. Celulele care au fuzionat sunt crescute pe mediu HAT pentru 10-14 zile.
Aminopteridina din mediu blocheaza dihidrofolat reductaza (DHFR) şi deci calea sintezei
de nucleotide. Deci, celulele mieloma nefuzionate vor muri întrucât nu pot produce
nucleotide nici de novo pentru ca au enzima DHFR blocata de aminopteridină, nici pe
calea alternativa pentru ca sunt defective pentru gena HGPRT. Eliminarea celulelor
Mieloma nefuzionate este necesara pentru ca altfel ele s-ar înmulţi repede şi ar elimina
prin concurenţă puţinele celule hibridoma formate. Celulele B nefuzionate mor singure,
având o durata scurtă de viata. Astfel, supravieţuiesc doar celulele hibride Mieloma-
limfocit B, întrucât ele au gena HGPRT funcţională provenită de la limfocit. Aceste
celule vor produce anticorpi (proprietate a limfocitelor B) şi sunt imortale (proprietate a
celulelor Mieloma).
13
Liniile celulare Hibridoma prezintă un spectru larg de aplicaţii de ordin comercial,
terapeutic şi de diagnostic. O serie de anticorpi monoclonali produşi de liniile Hibridoma
au fost brevetaţi sau sunt la ora actuală supuşi testelor clinice în scopul utilizării lor
terapeutice. Un exemplu este Ac Campath-1 obţinut din antigenul limfocitar CD52 şi
utilizat împotriva unor forme de leucemie sau a şocului septic.
Deşi majoritatea anticorpilor monoclonali produşi provin din celule murine sau de
şobolani, Ac monoclonali umani au fost obţinuţi prin imortalizarea limfocitelor imunizate
in vitro. Printre aceştia se numără Ac împotriva glicoproteinei din anvelopa virusului
HIV1, a antigenului de suprafaţă al hepatitei B, a citomegalovirusului şi virusului
variolei.
In vederea reducerii costurilor de producţie şi a complexităţii postprocesării a Ac
monoclonali, este necesar să se obţină concentraţii crescute de Ac în timpul producţiei lor
şi să se lucreze cu densităţi celulare mari ce pot fi obţinute în sisteme de cultură
perfuzate. Liniile Hibridoma pot fi produse atât în suspensie, de ex. în sticle rotative, sau
pe substrat solid, de ex. pe reţele fibrilare laxe, microparticule sau microcapsule. Toate
aceste sisteme sunt adaptate pentru producţia pe scară largă.
Ca în toate cazurile de producţie a liniilor celulare pe scară largă, mediile fără ser
şi proteine sunt preferabile deoarece facilitează sinteza de anticorpi. Un aspect negativ
important al creşterii celulelor în medii cu conţinut proteic redus este însă creşterea
pericolului morţii celulelor şi deci un risc crescut al degradării Ac datorită proteazelor
endogene.
Condiţii de cultură. Celulele sunt cultivate în mediul Eagle MEM cu FBS 10%. Durata
de viaţă a celulelor acestei linii poate fi crescută în funcţie de reţeta chimică a mediilor
utilizate.
14
12. Linia celulară WI-38
Este o linie celulară diploidă umană ce provine din ţesut embrionar pulmonar şi este
formată din celule care prezintă o morfologie fibroblastică. Această linie are
susceptibilitatea la o largă gamă de virusuri şi în consecintăn este utilizată la producerea
vaccinurilor antivirale la om, împotriva: rinovirusurilor, rubeolei, poliomielitei, febrei
galbene. Celulwele WI-38 sunt dependente de ancorare şi vor creşte multistratificat
atunci când cultura este menţinută la 37oC pentru o perioadă îndelungată de timp cu
ajustări poeriodice ale pH-ului. Celulele supravieţuiesc 50 +/- 10 diviziuni, un ciclu
celular durând circa 24h.
Condiţii de cultură. Celulele sunt cultivate în mediul Eagle MEM cu FBS 10%.
15
Condiţii de cultură. Celulele sunt cultivate pe mediu Eagle MEM cu FBS 10%
16
Aceste proprietăţi ale celulelor Ψ CRE/ Ψ CRIP le fac deosebit de utile pentru studii
privind transferul de gene in vivo, studii orientate spre analiza liniilor celulare şi terapia
genică. Ambele linii pot fi folosite şi la izolarea de colone ce produc stabil titruri crescute
de retrovirusuri recombinante.
17
Terminologie utilizată în domeniul culturilor de celule, organe şi ţesuturi, al biologiei
moleculare şi geneticii moleculare
18
Celulă endocrină: la animale, celulă producătoare de hormoni, factori de creştere sau alte
substanţe cu rol de semnalizare pentru celulele-ţintă, care sunt situate la distanţă şi posedă
receptori corespunzători pentru aceste substanţe.
Celulă hibridă: termen utilizat pentru a desemna o celulă mononucleată care provine din
fuziunea a două celule diferite, ce conduce la formarea unui sincarion.
Celulă micronucleată: celulă stopată în mitoză în care mici grupe de cromozomi funcţionează
ca situsuri pentru reasamblarea anvelopei nucleare, rezultând astfel micronuclei. Numărul maxim
de micronuclei care se pot forma va fi egal cu numărul total de cromozomi.
Celule (sau culturi) dependente de ancorare : celule sau culturi provenite din acestea care
cresc, supravieţuiesc şi îşi menţin funcţionalitatea numai dacă sunt ataşate la o suprafaţă solidă,
de exemplu de sticlă sau plastic. Termenul nu face referinţă la celule normale sau la celulele
transformate sau nu neoplastic.
Cibrid: o celulă viabilă rezultată în urma fuziunii unui citoplast cu o celulă intactă, creându-se
astfel un hibrid citoplasmatic.
Citoplast: citoplasma intactă care rămâne după enuclearea unei celule.
Clonă: în terminologia utilizată în cultura de celule animale, o populaţie de celule provenită
dintr-o celulă unică, prin diviziuni mitotice succesive. O clonă un este, în mod necesar, omogenă
şi, în consecinţă, termenii clonă şi clonat un indică omogenitatea genetică sau de altă natură a
populaţiei celulare care formează clona. In terminologia utilizată în cultura de ţesuturi vegetale,
termenul clonă se referă la o cultură obţinută prin mijloacele precizate mai sus, dar se poate
referi şi la celule propagate exclusiv prin înmulţire vegetativă (asexuată) toţi membrii grupului
respectiv provenind prin multiplicarea repetată a unui singur individ iniţial.
Complementaţie: capacitatea a două anomalii genetice diferite de a se compensa reciproc.
Inhibiţie de contact a locomoţiei: fenomen ce caracterizează anumite celule, în cadrul căruia
două celule ajung în contact, activitatea lor locomotorie diminuează şi mişcarea anterogradă a
unei celule pe suprafaţa celeilalte încetează.
Crioconservare: stocare a celulelor, ţesuturilor, embrionilor, organelor sau seminţelor la
temperatura ultrascăzută. Stocarea acestora se realizează de obicei la temperaturi sub – 100oC.
Criză: stadiu al transformării celulelor in vitro care se caracterizează prin reducerea proliferării
culturii, figuri mitotice aberante, detaşarea celulelor de pe substratul de cultură şi apariţia
celulelor gigantice multinucleate. In timpul acestei degenerări masive a culturii, de regulă, dar un
19
întotdeauna, un mic număr de colonii supravieţuieşte şi dă naştere unei noi culturi, aparent cu o
durată nelimitată de viaţă in vitro. Fenomenul de criză a fost descris pentru prima dată la celulele
umane în urma infecţiei cu oncovirusul SV40.
Cultură axenică: o cultură lipsită de forme de viaţă străine sau nedorite. O cultură axenică poate
să fie intenţionat realizată prin co-cultivarea diferitelor tipuri de celule, ţesuturi sau organisme.
Cultură celulară continuă: cultură aparent capabilă să efectueze un număr nelimitat de dublări
ale populaţiei sale celulare ; expresia este atribuită frecvent unei culturi de celule imortale. Un
este obligatoriu ca celulele unei astfel de cultura să exprime caracteristici ale transformării
neoplastice sau maligne in vitro.
Cultură celulară finită: cultură capabilă de un număr finit de dublări ale populaţiei, în urma
cărora celulele încetează să mai prolifereze.
Cultură celulară imortală: vezi cultură celulară continuă.
Cultură de celule: termen utilizat pentru a desemna menţinerea sau cultivarea celulelor in vitro
incluzând cultura celulelor individuale. In cadrul culturilor de celule, celulele un mai sunt
organizate în ţesuturi.
Cultură de explante : menţinerea sau creşterea unui explant în cultură.
Cultură de organe: menţinerea sau creşterea unui primordiu, a unei părţi sau a unui întreg organ
in vitro, în condiţii care permit conservarea structurii şi/sau funcţiei acestuia.
Cultură de ţesuturi: menţinerea sau creşterea in vitro a ţesuturilor în condiţii care permit
conservarea şi diferenţierea arhitecturii şi/sau funcţiei acestora.
Cultură embrionară: dezvoltarea sau menţinerea in vitro a embrionilor maturi sau imaturi
izolaţi.
Cultură în suspensie: tip de cultură în care celulele sau agregatele celulare se multiplică atunci
când sunt suspendate într-un mediu lichid.
Cultură primară: cultură iniţiată din celule, ţesuturi sau organe preluate direct din organisme. O
cultură primară poate fi considerată ca atare până în momentul în care ea poate fi subcultivată cu
succes pentru prima oară. După acest prim pasaj, ea devine o linie celulară.
Densitate a populaţiei: numărul de celule pe unitatea de suprafaţă (sau volum) dintr-un vas de
cultură; de asemenea, numărul de celule pe unitatea de volum de mediu în cazul culturilor în
suspensie.
20
Densitate de saturare: număr maxim de celule care poate fi obţinut într-un vas de cultură, în
condiţii de cultură specifice. Acest parametru este exprimat de obicei ca număr de celule pe cm2
într-o cultură monostrat sau ca număr de celule pe cm3 într-o cultură în suspensie.
Diferenţiate: celule care-şi menţin în cultură, în totalitate sau în majoritate, structurile
specializate şi funcţiile caracteristice pe care le deţin in vivo.
Diploidie: stare nucleară în care cromozomii cu excepţia celor sexuali sunt prezenţi în număr
dublu şi sunt identici structural cu cei ai speciilor din care a derivat cultura considerată.
Eficienţă de ataşare: procentul de celule însămânţate (inoculate) care se ataşează la suprafaţa
unui vas de cultură, într-o perioadă definită de timp. Condiţiile de cultură în cadrul cărora se
determină aceşti parametri trebuie să fie întotdeauna să fie precizate.
Eficienţă de clonare: procentul de celule însămânţate (inoculate) care formează o clonă.
Întotdeauna trebuie să existe siguranţa că coloniile formate provin din celule individuale pentru a
utiliza acest termen în mod corect.
Eficienţă de creştere în plăci (Plating efficiency): expresie utilizată iniţial înainte de folosirea
unor expresii precum eficienţă de ataşare (însămânţare), eficienţă de clonare sau eficienţă de
formare a coloniilor; este mai indicat să se folosească una din aceste expresii, deoarece termenul
plating nu este suficient de explicit pentru a descrie fenomenul care are loc. Vezi şi ataşare,
însămânţare, clonare, eficienţă de formare a coloniilor.
Eficienţă de însămânţare: vezi „eficienţă de ataşare”.
Electroporare: crearea cu ajutorul curentului electric a unor pori tranzitorii în membrana
celulară, în scopul introducerii în citoplasmă, din mediu, a unui material exogen, de obicei ADN.
Embriogeneză: procesul de iniţiere şi dezvoltare a embrionilor.
Epitelial-like: asemănător, caracteristic, având forma sau aspectul celulelor epiteliale. Pentru a
defini o celulă ca fiind epitelială, ea trebuie să posede caracteristice tipice celulelor epiteliale.
Frecvent, având certitudinea originii histologice şi/sau funcţiei celulelor introduce în cultură, este
rezonabil şi plauzibil ca acele celule să fie desemnate ca fiind epiteliale. Până în momentul în
care o definiţie riguroasă va fi formulată este mai corect să se utilizeze termenul epitelial-like.
Ereditate citoplasmatică: moştenire a caracterelor datorată genelor extranucleare (de ex. genele
prezente în unele organite celulare, precum plastidele sau mitocondriile, sau în plasmidele
bacteriene).
21
Euploidie: stare care caracterizează nucleul unei celule care conţine un multiplu exact (întreg) al
numărului haploid de cromozomi.
Eveniment epigenetic: orice schimbare fenotipică care nu este rezultatul unei modificări a
secvenţei ADN. Această schimbare poate fi stabilă şi transmisibilă şi poate consta în alterări ale
metilării ADN-ului, modificări ale activării transcripţiei, ale controlului translaţiei precum şi
posttranslaţionale.
Explant: fragment excizat dintr-un ţesut şi transferat într-un mediu artificial pentru creştere şi
menţinere.
Fibroblast-like : asemănător, caracteristic, având forma sau aspectul celulelor fibroblastice. Ca
şi în cazul celulelor epithelial-like, până în momentul formulării unei definiţii riguroase, este mai
corect să se utilizeze termenul de fibroblast-like.
Genetica celulelor somatice: studiul fenomenelor genetice ale celulelor somatice. Celulele care
se studiază d.p.d.v. genetic sunt frecvent celule crescute în cultură.
Heterocarion: celulă cu doi sau mai mulţi nuclei genetic diferiţi prezenţi într-o masă de
citoplasmă comună, provenită de obicei în urma fuzionării celulelor.
Heteroploid: nume dat unei culturi celulare ale cărei celule posedă nuclei ce conţin un număr de
cromozomi diferit faţă de numărul diploid. Acest termen este utilizat numai pentru a descrie o
cultură şi nu celule individuale. Astfel, o cultură heteroploidă este acea cultură care va conţine
celule aneuploide. Un exemplu de cultură heteroploidă este linia celulară HeLa.
Hibrid celular somatic: celulă rezultată din fuziunea celulelor animale provenite din celule
somatice care diferă d.p.d.v. genetic.
Hibrid citoplasmatic: termen sinonim cu cel de cibrid.
Hibridizare celulară : fuzionarea a două sau mai multe tipuri de celule diferite, care conduce la
formarea unui sincarion (heterocarion).
Hibridoma: celulă care rezultă din fuziunea unei celule tumorale ce nu produce anticorpi
(mieloma) cu o celulă plasmatică normală stimulată antigenic. Asemenea celule sunt produse
pentru capacitatea lor de a sintetiza un anticorp unic împotriva epitopului antigenului care
stimulează celula plasmatică. Acest anticorp este denumit anticorp monoclonal.
Histiotipic: asemănarea morfologică sau funcţională (sau morfofuncţională) a celulelor cultivate
in vitro cu celulele prezente într-un ţesut (in vivo).
22
De exemplu o suspensie de celule fibroblast-like poate secreta o matrice de glicozaminoglicani-
colagen, rezultând o strcutură similară cu ţesutul conjunctiv fibros, structură care este în
consecinţă histiotipică. Nu este indicat ca acest termen să se folosească alături de cuvântul
cultură. Ca atare un sistem de cultură tisulară care prezintă celule cu formă şi structură tipică
celulelor in vivo se va denumi histiotipic.
Homocarion: celulă cu doi sau mai mulţi nuclei genetic identici prezenţi într-o masă de
citoplasmă comună, provenită în urma fuzionării celulelor.
Imortalizare: atingerea de către o cultură celulară finită a atributelor unei linii celulare continue,
intrinsec sau prin diferite perturbări. O celulă imortalizată nu este în mod necesar o celulă
transformată neoplastic sau malign.
Inducţie: iniţiere in vitro a unei structuri, proces sau organ.
Inhibiţie a creşterii dependentă de densitate: inhibiţie a mitozei corelată cu creşterea densităţii
celulare.
Karioplast: nucleu obţinut prin enuclearea unei celule, înconjurat de o regiune redusă de
citoplasmă şi de membrana plasmatică.
Linie celulară : descendenţa celulară provenită dintr-o cultură primară de celule, în momentul
primei subcultivări reuşite a acesteia. Termenul linie celulară implică faptul că culturile realizate
dintr-o linie celulară reprezintă o descendenţă a celulelor original prezente în cultura primară.
Termenii de finită sau continua sunt folosiţi ca sufixe numai atunci când statutul culturii este
cunoscut. In caz contrar, termenul de linie este suficient. Termenul linie continua înlocuieşte
termenul linie stabilă. In cadrul descrierii unei culturi, care este publicată, este obligatorie
caracterizarea sau istoria acelei culturi. Dacă acestea au fost deja publicate, trebuie făcute
referinţe la publicaţia originală. In utilizarea unei culturi obişnuite de la un alt laborator,
desemnarea corectă a acesteia, cu numele şi descrierea originală trebuie menţinute şi orice
modificări trebuie raportate prin oricare altă publicaţie ulterioară.
Lipozom: veziculă lipidică închisă care delimitează un interior apos. Ea poate fi utilizată pentru
a încapsula materiale exogene în scopul transportului lor intracelular, în urma fuziunii cu
membrana plasmatică.
Mediu chimic definit: soluţie nutritivă folosită pentru cultura celulelor (ţesuturilor) în cadrul
căreia fiecare component este specificat şi în mod ideal, are structură chimică cunoscută.
23
Microcelulă: fragment celular care conţine unul sau mai mulţi cromozomi, format prin
enuclearea sau dezorganizarea unei celule micronucleate.
Morfogeneză: a) evoluţia unei structuri de la un stadiu nediferenţiat la unul diferenţiat; b)
procesul de apariţie şi dezvoltare al structurilor diferenţiate.
Mutant: variaţie fenotipică apărută în urma modificării unei gene sau apariţia unei gene noi.
Nivelul de dublare a populaţiilor: numărul total de dublări ale populaţiei unei linii sau tulpini
celulare din momentul iniţierii acesteia in vitro. Formula utilizată pentru calculul dublării
populaţiei este:
Nr. de dublări ale populaţiei= log10 (N/No) × 3,33 unde
N = nr. de celule din vasul de creştere la sfârşitul unei perioade de creştere; No = numărul de
colonii celulare din vasul de creştere.
Pentru determinarea acestui parametru este mai bine să se folosească numărul de celule viabile
sau de celule ataşate. Nivelul de dublare a populaţiei este o expresie sinonimă cu cea de dublări
cumulative ale populaţiei.
Număr de pasaje: numărul de ori prin care celulele cultivate au fost subcultivate sau au suferit
pasaje. In descrierea acestui parametru diluţia celulelor trebuie stabilită astfel încât vârsta relativă
a culturii să poată fi certificată.
Organogeneză: a) în culturile de celule animale - dezvoltarea, din celule disociate, a unei
structuri care prezintă forma sau funcţia (sau amândouă) ale unui organ natural; b) în culturile de
celule vegetale - proces de diferenţiere prin care se formează organele plantei de novo sau din
structuri preexistente; c) în biologia dezvoltării - diferenţierea unui sistem de organe din celule
stem sau celule precursoare.
Organotipic: asemănarea cu un organ natural, în privinţa structurii tridimensionale sau a
funcţiei, sau a amândurora. De ex., în cultură, un organ rudimentar se poate diferenţia într-o
manieră organotipică, o populaţie de celule dispersate se poate rearanja într-o structură
organotipică şi poate de asemenea să funcţioneze într-o manieră organotipică. Termenul
organotipic nu se utilizează în asociere cu cuvântul cultură, fiind destinat a fi utilizat ca termen
descriptiv.
Paracrină: la animale, celulă care produce hormoni, factori de creştere sau alte substanţe cu rol
de semnalizare pentru care celulele ţintă exprimă receptori corespunzători. Aceste celule ţintă
24
sunt localizate în imediata apropriere a celulei paracrine sau fac parte dintr-un grup de celule
adiacent la acestea. Vezi şi „autocrin” şi „endocrin”.
Pasaj: transferul sau transplantarea celulelor dintr-un vas de cultură în altul, realizat cu sau fără
diluare. Se subînţelege faptul că de fiecare dată când se realizează un pasaj, o anumită proporţie
de celule se poate pierde şi în consecinţă survine o diluare a celulelor, deliberată sau nu. Aceste
termen este sinonim cu cel de „subcultură”.
Patogen-free: lipsă a microorganismelor contaminante, stabilită prin diferite teste specifice.
Pseudoploid: condiţie nucleară în care numărul de cromozomi al unei celule este diploid dar, ca
urmare a unor rearanjamente cromozomiale, cariotipul este anormal iar relaţiile de linkare pot fi
afectate.
Recon: celulă viabilă obţinută prin fuziunea unui karioplast cu un citoplast.
Senescenţă in vitro: caracteristică atribuită culturilor celulare finite, în cazul culturilor de celule
de la vertebrate. Expresia se referă în principal la incapacitatea acestor celule de a depăşi un
număr finit de dublări ale populaţiei. Culturile de celule vegetale şi cele de celule de la
nevertebrate nu prezintă această proprietate.
Senescenţă: vezi „senescenţă in vitro”.
Sincarion: celulă hibridă rezultată în urma fuziunii nucleilor celulelor care au format iniţial
celula hibridă.
Strat nutritiv: strat de celule (de obicei letal iradiate pentru culturile de celule animale) pe care
se cultivă un anumit tip celular de interes.
Subcultură: vezi pasaj. La culturile de celule vegetale – proces prin care un ţesut sau explant
este iniţial subdivizat şi apoi transferat în mediu de cultură proaspăt.
Subtulpină: populaţie celulară ce poate proveni dintr-o tulpină, prin izolarea unei singure celule
sau a unui grup de celule ce prezintă proprietăţi sau markeri care nu apar în toate celulele tulpinii
parentale.
Timp de dublare a populaţiei: intervalul de timp, calculat în perioada fazei logaritmice de
creştere, în care populaţia creşte, de ex. de la 1×106 celule la 2×106. Expresia nu este sinonimă cu
cea de „timp de generaţie celulară”.
Timp de generaţie celulară : intervalul de timp cuprins între două diviziuni celulare succesive.
In prezent acest interval poate fi precis determinat prin intermediul cinefotomicrografiei. Acest
termen nu este sinonim cu cel de timp de dublare a populaţiei.
25
Totipotenţă: caracteristică celulară de a deţine potenţialul de formare a tuturor tipurilor de celule
ale unui organism adult.
Transfecţie: transferul de ADN străin celulelor aflate în cultură, în scopul retragerii acestuia în
genomul lor. Utilizarea tradiţională în microbiologie a acestui proces, se bazează pe ADN-ul
provenit de la un virus, în scopul transfecţiei. In general termenul defineşte transferul ADN-ul
indiferent de originea acestuia. Vezi şi „transformare”.
Transformare in vitro: o modificare care se moşteneşte, survenită în celulele cultivate, indusă
fie intrinsec, fie prin tratament cu carcinogeni chimici, virusuri oncogene, iradieri, transfecţie cu
oncogene, etc. Această modificare conduce la apariţia unor caracterisitici morfologice,
antigenice, neoplastice, proliferative, etc., alterate. Distincţia dintre această expresie şi expresia
„ transformare neoplastică in vitro” constă în aceea că alterările ce survin în populaţia celulară nu
include întotdeauna şi dobândirea capacităţii celulelor de a produce tumori într-o gazdă
caracteristică. Natura transformărilor survenite trebuie să fie specificată obligatoriu în orice
descriere realizată.
Transformare: în culturile de celule vegetale – introducerea şi integrarea stabilă în genomul
unei celule vegetale a ADN-ului străin, prin orice mijloace, rezultând modificarea genetică a
celulelor receptoare. Pentru culturile de celule animale, vezi transformarea in vitro,
transformarea neoplastică in vitro şi transfecţia.
Transformarea neoplastică in vitro: dobândirea de către celulele cultivate a proprietăţii de a
forma neoplasme benigne sau maligne, atunci când sunt inoculate animalelor. Numeroase
populaţii de celule transformate apar in vitro spontan sau prin manipulare intenţionată; produc
numai tumori benigne, fără invazii locale sau metastaze, în urma inoculării la animale. Dacă
există evidenţe, expresiile „transformare neoplastică malignă in vitro” sau „transformare malignă
in vitro” pot fi utilizate pentru a semnala faptul că celulele unei linii produc invazii sau
metastaze, în urma injectării la animale.
Tulpină celulară: populaţie celulară provenită fie dintr-o cultură primară, fie dintr-o linie
celulară, prin selecţia sau clonarea celulelor cu anumite proprietăţi sau markeri specifici.
Variantă: cultură care prezintă o schimbare fenotipică stabilă, de origine genetică sau
epigenetică.
Variaţie epigenetică: variabilitate fenotipică care nu prezintă o bază genetică.
Virus-free: cultură lipsită de virusuri specifice, fapt stabilit pe bază de teste caracteristice.
26