CURS 1

CITODIFERENIEREA

reprezint ansamblul de mecanisme celuleare si

moleculare, prin care un subset din setul de gene ale orictrei celule, este selectiv
exprimat n fiecare tip de celul. Diferenierea celular este de regul ireversibil.
Schimbarea strii de difereniere (ntlnit n special la plante) se numete dedifereniere.
Dezvoltarea embrionar urmrete pe de-o parte generarea diversitii celulare, n
fiecare generaie, iar pe de alt parte, asigur continuitatea celular de la o generaie la
alta prin intermediul celulelor germinale.
1. Imediat dup F! are loc segmentarea. Aceasta cuprinde o succesiune de diviziuni
mitotice foarte rapide, n care volumul enorm de citoplasm al zigotului este divizat
n celule mai mici numite blastomere. La sfritul procesului de segmentare rezult
blastula.
2. Dup ce viteza diviziunilor celulare mitotice s-a redus, blastomerele sufer deplasri
n cursul crora i chimb poziia. Ansamblul acestor rearanjri celulare poart
denumirea de gastrulare i la sfritul ei se formeaz cele trei foie embrionare:
ectoderm, endoderm i mezoderm.
3. Dup formarea celor trei foie embrionare, celulele ncep s interacioneze ntre ele i
s se organizeze pentru a forma esuturile i organele, proces numit organogenez.
4. O parte din citoplasma zigotului formaz celulele precursoare ale gameilor. Aceste
celule se numesc celule germinale primordiale i se deosebesc de celelalte celule ale
corpului numite celule somatice.
mprirea n celule somatice i celule germinale reprezint una din primele
diferenieri care au loc n cursul embiogenezei. Datorit faptului c toate celulele unui
organism provin din ovulul fecundat, ele sunt echivalente din punct de vedere genetic i
au aceeai informaie genetic cu cea a zigotului.. Fenotipic, ns, ele sunt diferite i se
caracterizeaz prin produi genetici distinci.. Cu alte cuvinte, celulele unui organism se
deosebesc ntre ele nu pentru ca au informaie genetic diferite ci pentru c exprim gene
diferite. Cele mai importante dovezi c genomul rmne constant n cursul diferenierii
celulare provin de la exp. lui Gurdon (1975) prin care s-au transplantat nuclei de celule
somatice in ovocite enuclate de amfibian. Confirmarea echivalenei genomice s-a realizat
ns n 1997 odata cu clonarea oiei Dolly.

ZIGOT
BLASTUL
GASTRUL

ECTODERM
Epiderm
i str. asociate

ENDODERM

creier

intestin embrionar

i S.N.

epit. tb. dig.

epit. tr. resp

glande

MEZODERM
Notocord

Somite
Muchi S. excret. Gonade Pleur
Pericard
Peritoneu
Mezenchim
Derm Sist. Circulator

Sist. Osos

Ovocitul de amfibian este destul de voluminos pentru a permite injectarea cu o

micropipet a unui nucleu izolat din alt celul (intestinal, tegumentar). S-a constatat c
transplantarea nucleilor celulelor intestinale de mormoloc, n ovocite enucleate de
Xenopus laevis, determin formarea de mormoloci viabili, unii din ei dezvoltndu-se
pn la stadiul de adult. Acest experiment a demonstrat c nucleii endodermali sunt
totipoteni. n cazul n care s-au folosit nuclei din celulele tegumentare adulte s-au
obinut mormoloci, ns niciodat aduli. ncercrile cu nuclei ai altor celule adulte au
condus la aceeai concluzie: nucleii celulelor difereniate sunt pluripoteni (au capacitatea
de a produce toate tipurile celulare ale unui mormoloc) dar nu totipoteni.
Exist i excepii de la regula echivalenei genomice, cunoscute sub denumirea de
diminuri cromozomale.
- la Ascaris toate celulele somatice pierd 25% din ADN acesta fiind bogat n
secvene repetitive. La alt specie Parascaris acre are doar doi cromozomi, se elimin
85% din ADN. Dup prima diviziune de segmentare, n blastomera din polul animal
cromozomii se fragmenteaz i o parte din ADN este eliminat.. Procesul continu i n a
doua diviziune de segmentare, astfel nct n final doar cteva celule conin genomul
intact i ele dau natere liniei germinale.
Secvena de evenimente embrionare care conduce la formarea unui tip celular
specializat cuprinde trei etape: specificare, determinare i difereniere celular.
O celul specificat este capabil s se diferenieze autonom ntr-un mediu neutru
(mediu de cultur). Fiecare celul este specificat de tipul de citoplasm motenit n
cursul segmentrii, astfel nct destinul celular este asumat fr intervenia celulelor
vecine. Acest tip de specificare poart denumirea de specificare autonom, pentru c
celula este specificat de proprii constituieni citoplasmatici.
O celul fondatoare este considerat prima celul specificat, care prin diviziuni
succesive va forma o clon de celule, ce vor alctui un teritoiu embrionar.
Moleculele implicate n specificarea autonom poart denumirea de determinani
morfogenetici, natura lor biochimic fiind diferit..

Un alt tip de specificare este specificarea condiionat sau inductiv deaorece

destinul blastomerelor depinde de condiiile n care se gsesc. Ex. daca se indeprteaz o
blastomer din embrionul timpuriu celulele rmase ii modific destinul.
Celulele determinate sunt angajate pe o anumit cale de dezvoltare. De exemplu,
mezodermul somitic este determinat s formeze esut muscular, gonade, sistem excretor,
etc. Celulele determinate s urmeze o anumit cale de dezvoltare sunt denumite cu
sufixul blast (mioblast, neuroblast) i ele au capacitatea de a se divide, pentru a forma o
clon celular, n care toi membrii sunt destinai s formeze acelai tip celular..
O celul determinat se poate diferenia autonom cnd este plasat n alt regiune
embrionar. Dac n blastula de amfibian se grefeaz, ntr-o regiune ectopic, celule
ectodermale, care dau natere ochiului, celulele transplantate se difereniaz n aceeai
direcie cu celulele nconjurtoare, aspect care sugereaz c n momentul transplantului
celulele nu erau determinate. Dac aceiai operaie este realizat mai trziu (gastrul),
viitoarea regiune vizual va forma n embrionul gazd un ochi ectopic..
Determinarea celular implic selectarea genelor care se vor exprima n
fiecare tip celular.
Fenomenul determinrii celulare ridic dou ntrebri moleculare:
1. Ce molecule definesc starea celular determinat?
2. Care este mecanismul prin care se menine aceast stare?
Diferenierea celular reprezint procesul prin care celulele embrionare devin
diferite unele de altele, capt identiti distincte i funcii specializate. n cursul
diferenierii au loc modificri ale exprimrii genetice, responsabile de sinteza produilor
specifici unui tip celular.
Genele exprimate n celulele difereniate cuprind pe lng cele care codific
proteine specifice i alte gene, care asigur buna funcionare a celulei. (house keeping
genom). O celul difereniat este caracterizat de produii pe care i conine, astfel nct
prezena anumitor proteine poate determina modificri structurale.
Celulele difereniate sunt foarte stabile i n mod normal nu se mai divid.
Exist dou cazuri n care diferenierea unui tip celular nu este ireversibil:
transdiferenierea i dediferenierea.

Transdiferenierea a fost observat n esuturile regenerate, unde un tip celular se

poate modifica n alt tip celular, nrudit. De exemplu, regenerarea cristalinului de triton se
poate realiza prin recrutarea celulelor din regiunea dorsal a epiteliului pigmentat al
irisului.
Dediferenierea reprezint pierderea caracteristicilor structurale i funcionale ale
unei celule difereniate i diferenierea ulterioar n alt tip celular. Dup amputarea unui
membru de triton celulele epidermale migreaz rapid la suprafaa rnii i formeaz un
blastem alctuit din keratinocite, care i pierd caracterul difereniat i reintr n ciclul
celular. Pe baza activitii blastemului are loc regenerarea tuturor tipurilor celulare
caracteristice membrelor.
REGLAREA ACTIVITII TRANSCRIPIONALE
Dezvoltarea unui organism pluricelular este realizat prin aciunea unor factori
transcripionali specifici i a altor proteine reglatorii, care controleaz programele de
determinare i difereniere celular.
Paradigma major a geneticii dezvoltrii este expresiei genic difereniat din
acelai repertoriu nuclear. Diferite tipuri celulare au seturi diferite de proteine chiar dac
genomul lor este identic. Aceast reglare a expresiei genice se poate realiza la mai multe
nivele:
-

transcrierea genetic difereniat reglaj la nivelul transcrierii ARN

procesarea secelstiv a ARN nucl.

Translaia selectiv a ARNm

Modificarea diferit a proteinelor.

FACTORI TRANSCRIPIONALI
I. SUPRACLASA FACTORILOR TRANSCRIPIONALI CU MOTIVE DE
ZINC
Clasa C2H2 (TFIIIA)
Clasa C4 (Receptori nucleari)
Factori transcripionali GATA
II. SUPRACLASA FACTORILOR TRANSCRIPIONALI CU DOMENII
BAZICE
Clasa factorilor transcripionali leucin-zipper
Clasa factorilor transcripionali bazici helix-loop-helix
Clasa factorilor transcripionali HLH leucin zipper
III. SUPRA CLASA FATORILOR TRANSCRIPIONALI HELIX-TURNHELIX
Clasa factorilor transcripionali cu homeodomeniu
Clasa factorilor transcripionali PAX
Clasa forkhead
Clasa ETS
Clasa TEA
IV ALI FACTORI DE TRANSCRIERE
Clasa REL
Clasa MADS-BOX
Clasa factorilor transcripionali cu domeniu COLD-SHOCK
Clasa RUNT
Clasa HMG
Clasa factorilor transcripionali T-BOX

Factorii transcripionali sunt reprezentai de proteine, care pot afecta transcrierea

unei gene, prin activarea sau inhibarea ei. Acest efect poate fi exercitat direct, prin
legarea de ADN sau indirect, prin interacii cu ali factori transcripionali.
Factorii transcripionali care interacioneaz cu regiunile de control ale genelor se
mpart n dou grupuri:
-

factori de transcriere bazali care iniiaz transcripia de la nivelul secvenei

promotoare TATA. Ei sunt necesari pentru transcrierea unei game largi de
gene i sunt prezeni n majoritatea tipurilor celulare.

Factori transcripionali reglatori. Acestia se pot lega de secvene de ADN

situate la distan de situsul de iniiere a transcripiei, au rolul de a modula
activitatea transcripional i permit exprimarea genelor caracteristice unui tip
celular.

Dei unele proteine reglatorii de la eucariote acioneaz individual, majoritatea lor

fac parte dintr-un complex alctuit din mai multe polipeptide, fiecare cu o funcie
distinct.
Studiile moleculare i compararea secvenelor de aminoacizi au evideniat
existena mai multor motive structurale, care mediaz contactele specifice cu ADN. n
multe cazuri, motivul de legare de ADN este conservat n cursul evoluiei, la o gam larg
de specii. Existena acestor motive conservate de legare de ADN a condus la gruparea
reglatorilor transcripionali n superclase, clase i familii
I. SUPRACLASA FACTORILOR TRANSCRIPIONALI CU MOTIVE DE
ZINC
Clasa C2H2 (TFIIIA)
In motivele Zn finger ale acestor factori transcripionali, Zn joac un rol
structural, pentru c el stabilizeaz aceste domenii scurte prin interacii ionice
Ex. TFIIIA - recunoaste specific o secven din regiunea de control a genei ARNr
5S.
Factorii transcriptionali care se nfoar n jurul acidului nucleic si au contacte
multiple cu acesta, nu pot interaciona eficient cu ADN ncolcit n jurul miezului

histonic. n acest sens s-a constatat c eficiena legrii TFIIIA depinde de tipul i
stoichiometria histonelor asociate genei ARNr 5S.
Clasa C4 (Receptori nucleari)
Receptorii nucleari particip la reglarea transcripional a proceselor embrionare,
n meninerea homeostaziei sau n inducerea/inhibarea proliferrii celulare, a diferenierii
i apoptozei
Factorii transcripionali GATA
Domeniul GATA se gsete n proteinele care se leag la o secven consens de
ADN, bogat n Guanozin-Adenozin-ribozilTimin.Adenozin. Prezint 2 motive
Znfinger.
Un aspect important al biologiei dezvoltrii este acela al nelegerii modului n
care foiele embrionare genereaz diferite tipuri celulare. Date recente sugereaz c
factorii transcripionali GATA i NHF3 (Hepatic Nuclear Factor) sunt eseniali pentru
formarea endodermului la toate metazoarele. Aceti factori confer competen unei foie
embrionare pluripotente, nainte ca aceasta s exprime genele specifice. Acest fenomen
denumit potenare genetic se realizeaz prin legarea factorilor transcripionali GATA i
HNF3 de genele int, naintea activrii lor. De exemplu, n endodermul intestinului
anterior din care se va diferenia mugurele hepatic gena albuminei nu se exprim dei de
regiunea enhancer sunt legati factorii GATA-4 i HNF3. Ulterior, n primordia ficatului
(mugurele hepatic) gena este transcris datorit legrii de enhancer i a altor factori
transcripionali

GATA-4

HNF3

ENDODERM

ENHANCERUL GENEI ALBUMINEI

MUGURELE HEPATIC
GATA-4

HNF3

Alti factori de transcriere

II. SUPRACLASA FACTORILOR TRANSCRIPIONALI CU DOMENII

BAZICE
Clasa factorilor transcripionali leucin-zipper
In forma lor monomerica, proteinele leucin yipper contin un domeniu de
dimerizare C-terminal si unul bazic N-terminal
La toate organismele factorii transcriptionali leucinzipper asigura controlul
transcriptional al genelor implicate in formarea diferitelor strcuturi embrionare.
Clasa factorilor transcripionali bazici helix-loop-helix
Acesti factori contin un domeniu de 50-60 de aminoacizi format din 2 helixuri
amfipatice unite printr-o regiune variabil ca lungime ce formaz o bucl
Din aceast categorie fac parte factori transcriptionali cu rol embrionar.
III. SUPRA CLASA FATORILOR TRANSCRIPIONALI HELIX-TURNHELIX
Clasa factorilor transcripionali cu homeodomeniu
Homeodomeniul este codificat de o secven de ADN denumita homeobox alc din
60 aa ce formeaz 3 helixuri mpachetate intr-o strcutura globulara
Clasa PAX
Genele Pax codifica factori de transcriere ce controleaza diferite evenimente
embrionare la vertebrate, artropode si nematode. Acesti fact de transcriere contin un
domeniu de legare de ADN alctuit din 124-130 aa denumit paired-box deoarece este
bipartit si alcatuit din 2 subdomenii N-terminal si C-terminal
Clasa MADS-BOX
Fact transcriptionali MADS alctuiesc o clasa distinct de proteine reglatoare
embrionare care se gasesc in cantitate mare in muschii secheletici, cardiaci, netezi i
neuroni
Proteinele MADS-BOX recunosc secvene bogate in AT

Fibra de 30 nm

Structura miezului nucleozomal (dup Khorasanizadeh, 2004). 147 pb ADN (ilustrat n dou
nuane de albastru) sunt infurate n jurul octamerului histonic compus din cte dou molecule H2A
(rou), H2B (roz), H3 (verde) i H4 (galben) pentru a forma particula miez nucleozomal cu forma sa
caracteristic de disc aplatizat.

DOMENIILE CROMATINICE

Goldman (1988) a introdus noiunile de gene competente transcripional,

nelegnd prin acest termen setul de gene care sunt transcrise la un moment dat sau care
vor fi transcrise ulterior, n dezvoltarea ontogenetic, atunci cnd vor apare stimuli
corespunztori, i de gene incompetente transcripional- acele gene care nu pot fi
transcrise n nici o situaie mezologic.

De exemplu, gene incompetente transcripional n fibroblaste sunt genele pentru

hemoglobin sau genele specifice ficatului. Autorul consider c dobndirea potenialului
de transcriere ce apare n cursul dezvoltrii nu este o proprietate a nsi unitii de
transcriere, ci mai degrab a domeniului cromatinic care poate fi de cteva ori mai mare
dect gena.
Prin domeniu cromatinic se nelege o bucl de ADN superspiralizat
independent, ce poate fi asamblat n cursul replicrii ntr-o conformaie deschis
(transcriptibil) sau nchis (netranscriptibil), depinznd de disponibilitatea unei
cantiti corespunztoare a unui factor proteic specific (posibil un factor de transcriere),
n cursul replicrii.

- Domeniile cromatinice se replic fiecare ca o unitate singular sub controlul

unei singure origini a replicrii. Dac acea origine a replicrii iniiaz replicarea n cursul
primei jumti a fazei S, domeniul este asamblat ntr-o configuraie activ. n consecin,
replicarea timpurie este o condiie esenial ca un domeniu cromatinic s fie asamblat
ntr-o stare activ. Domeniile cromatinice ale organismelor eucariote apar ca bucle ale
unor regiuni discrete ale cromozomilor, avnd lungimea de 30-300Kb, fiind ancorate ntrun matrix nuclear bogat n proteine
- Fiecare domeniu cromatinic este o unitate funcional, n sensul c, bucla n
intregul ei poate fi n stare potenial activ sau n stare represat transcripional.

Reglarea transcripiei genice implic dou etape de baz:

1. Stabilirea unei conformaii a cromatinei compatibil cu transcripia;
2. Introducerea factorilor transactivatori care interacionaeaz cu promotorul,
spre a iniia transcripia.

Conceptul domeniului cromatinic ca unitate de reglare a activitii genice n

cursul dezvoltrii are implicaii importante. Una dintre ele este aceea c elementele de
secven aflate imediat n amonte de gene, alturi de factorii transactivatori ce se leag la
ele, au fost obiectul multor studii de biologie molecular, cu rezultate importante. S-a
conchis c expresia genic este sensibil la starea domeniilor cromatinei n care gena
considerat se afl localizat.

1. Depunerea la nivelul ADN a unui nou

tetramer sintetizat (H3-H4)2 pentru a forma
o particul sub-nucleozomal, urmnd a fi
adugai 2 dimeri H2A-H2B
o particul
miez nucleozomal ce cont din 146 pb ADN
ce nconjoar octamerul histonic. Aceast
particul miez i ADN linker formeaz un
nucleozom. Histonele nou sintetizate sunt
modificate specific. Cea mai conservat
modificare este acetilarea histonei H4 la
nivelul Lys 5 i 12 (Sobel, 1995).
2. Eveniment de maturare ce necesit ATP
pentru a stabili spaierea regulat a
nucleozomilor pentru a forma
nucleofilamentul. n timpul acestei etape
histonele ncorporate sunt deacetilate
3. are loc ncorporarea histonelor linker
nsoit de plierea nucleofilamentului ntr-o
fibr de 30nm, structur care rmne a fi
elucidat. Exist 2 modele de baz: modelul
solenoidului i modelele zig-. n final,
plierile succesive conduc ctre un nivel nalt
de organizare i la apariia domeniilor
specifice n nuclei.

ncorporarea variantelor histonice cum ar fi H2A-X, CENP-A, macroH2A i

H2A.Z ar putea fi de o importan major n anumite domenii din genom. n acest
context, o variant a histonei H3 este asociat cu regiunile centromerice sileniate sau
macroH2A este asociat cu cromozomul X inactiv la femelele mamiferelor. H2A.X este
implicat n formarea unor foci ce conin factori de reparare ADN n regiunile rupturilor
dublu catenare. H2A.Z are rol n modificarea structurii cromatinei n vederea reglrii
transcrierii.
n timpul etapei de maturare, ncorporarea histonelor linker, a proteinelor nonhistonice asociate cromatinei denumite HMG (High Mobility Group) i a altor factori
specifici cu legare la ADN, ajut la spaierea i plierea nucleofilamentului. De aceea,
primii pai n asamblarea cromatinei pot avea un impact major n caracteristicile finale
ale cromatinei din domeniile nucleare spacifice
Proteinele HMG (High Mobility Group)
Proteinele HMG (High Mobility Group) sunt proteine nucleare ubiquitare ce
regleaz i faciliteaz diferite activiti n care este implicat ADN, cum ar fi transcriere,
replicare, recombinare i reparare. Aceste proteine se leag la ADN i la cromatin i
acioneaz ca elemente arhitecturale, inducnd modificri pe distane scurte sau lungi n
structura situsurilor la care se leag. Proteinele HMG influeneaz activitatea diferitelor
molecule reglatoare cum ar fi: receptori hormonali, p53, proteinele RAG implicate n
recombinarea V(D)J, proteinele homeotice HOXD9 i a ctorva factori de transcriere.
Domeniile funcionale ale proteinelor HMG sunt foarte rspndite, ele fiind componente
i ale diferitelor proteine reglatoare cu domenii de legare la ADN.

Proteinele HMG prezint un rol important n maladiile umane. Mutaii sau

rearanjamente n genele ce codific pentru unele din proteinele aparinnd grupului HMG
sunt asociate cu etiologia unor tumori benigne des ntlnite cum ar fi: leiomioame
uterine, polipi endometriali, lipoame. HMG-1 i HMG-2 sunt implicate n mecanismul de
aciune al citostaticului cisplatin. La pacienii ce sufer de maladii autoimune au fost
detectati anticorpi pentru proteinele HMG.
Prin modificarea arhitecturii ADN i a cromatinei, proteinele HMG pot contribui
la reglarea diferitelor procese care, n ultim instan, afecteaz fenotipul celular. Studiul
asupra structurii i funciei acestor proteine ar putea aduce noi informaii asupra
mecanismelor moleculare implicate n etiologia diferitelor maladii.
Nomenclatura
Proteinele High Mobility Group (HMG) au fost iniial izolate din cellule
mamaliene i, arbitrar clasate ca un grup specific de proteine non-histonice, pe baza
observaiaei c sunt asociate cu cromatina izolat.
Au fost divizate n 3 grupe: HMG-1/-2, HMG-14/-17 i HMG-I/Y. Acestea sunt
considerate proteine HMG clasice. Studii mai amnunite au evideniat c motivele
funcionale caracteristice fiecrui grup de proteine HMG sunt prezente i la alte proteine
nucleare. Proteinele care conin oricare din motivele funcionale ale proteinelor HMG
clasice sunt denumite proteine cu motiv HMG. Acestea sunt divizate n 3 suoerfamilii
denumite:
1. HMGB (denumirea anterioar HMG-1/-2)
2. HMGN (denumirea anterioar HMG-14/-17)
3. HMGA (denumirea anterioar HMG-I/Y).
Fiecare familie HMG posed o secven funcional caracteristic. Domeniul
funcional al familiei HMGB este denumit HMG-box, cel al familiei HMGN se
numete Nucleosomal binding domain, iar cel al HMGA este denumit AT-hook.
Inter-relaia dintre diferitele proteine HMG este ilustrat n diagrama urmtoare :

4. HMGB (denumirea anterioar HMG-1/-2)

5. HMGN (denumirea anterioar HMG-14/-17)
6. HMGA (denumirea anterioar HMG-I/Y).

PROTEINE HMG
Proteine cu motiv

Proteine clasice

HMG

HMG
MOTIVUL FUNCIONAL

Proteine HMG-box

Proteine NBD

HMG-box
HMGB
Nucleosome binding
HMGN

Denumire nou HMGB

Denumire veche HMG 1/2

Denumire nou HMGN

Denumire veche HMG 14/17

AT-hook
HMGA
Proteine AT-hook

Denumire nou HMGA

Denumire veche HMG I/Y