1.Definiti proprietatile de patogenitate si virulenta.
Patogenitatea este proprietatea unui microorganism de a
determina in conditii naturale sau experimentale aparitia unui proces infectios decelabil din punct de vedere clinic la o gazda receptiva.Patogenitatea este un caracter de specie.Patogenitatea implica existenta a 4 proprietati esentiale:a)capacitatea de a patrunde si de a se localiza in organismul gazdei ;b)proprietatea de a se multiplica in tesuturile acesteia si de a le invada; c)rezistenta la mecanismele de aparare ale gazdei; d)producerea leziunilor tisulare care se pot exterioriza clinic. Virulenta este capacitatea unei tulpini a unui mo patogen aflat intr-o anumita faza de crestere de a se localiza, de a se multiplica si eventual de a invada celulele si tesuturile gazdei si/sau de a produce toxine, determinand o stare patologica la o gazda receptiva. 2.Enumerati si definiti factorii determinanti ai virulenteiVirulenta exprima cantitativ gradul de patogenitate a unei tulpini pentru o anumita gazda si este o proprietate multifactoriala: a)Infectiozitatea reprezinta capacitatea unui mo de a depasi mijloacele de aparare a organismului, de a de implanta si a coloniza tesuturile sanatoase, adica de a stabili o localizare si de a forma un focar primar de infectie. b)Agresivitatea sau invazivitatea reprezinta capacitatea agentilor patogeni de a depasi prin mecanisme specifice, barierele epiteliale, de a patrunde in tesuturile gazdei si de a se multiplica, producand efecte patologice. c)Toxigenitatea reprezinta capacitatea unui agent patogen de a elabora in cursul cresterii sale una sau mai multe substante toxice. Toxigeneza este o proprietate esentiala a patogenitatii bacteriene. 3.Natura chimica a toxinelor bacterieneDpdv exclusiv al compozitiei chimice se disting:a)toxine proteice reprezentate de exotoxinele produse de bacteriile G+ si de toxinele proteice intracelulare ale unor bacterii G- : B.pertusis, Y.pestis, Sh.dysenteriae(neurotoxina) ;b)toxinele glico-lipopolipeptidice corespunzatoare endotoxinelor. 4.Capsida virala:subunitati componente,tipuri de simetrie. Capsida e o structura proteica ce acopera genomul viral.Cea mai mica unitate structurala a capsidei e capsomera.Capsomera e alcatuita dintr-un lant polipeptidic sau dintr-un agregat de catene polipeptidice identice sau diferite. Capsomerele sunt cele mai mici unitati structurale vizibile la microscopul electronic. La virusurile cu simetrie helicala, capsomerele sunt unitati morfologice ale capsidei si in acelasi timp sunt unitati de structura biochimica,formate dintr-un singur polipeptid. La virusurile cu simetrie icozaedrica,capsomerele sunt numai unitati morfologice, dar din punct de vedere biochimic sunt oligomere.In alcatuirea lor intra mai multe unitati biochimice ,cele cu structura de penton contin 5 subunitati (pentamere) iar cele cu structura de hexon contin 3 subunitati(trimere). Polipeptidele din structura oligomerului pot fi identice sau diferite. 5.PEPLOSUL:natura chimica,componente,mecanismul invelirii. Invelisul extern sau peplosul(peplos=manta) e o structura suplimentara ce acopera capsida unor virusuri.Peplosul e dobandit in timpul maturarii virionilor prin procesul de inmugurire ce are loc la suprafata celulei.Fiind derivat din membrana citoplasmatica,peplosul e format din dublu strat fosfolipidic unde sunt inclavate proteine derivate din celula si proteine codificate de virus. Cele mai multe glicoproteine ale peplosului sunt codificate de genomul viral. Glicoproteinele codificate de virusuri sunt constituenti universali ai peplosului, dar diversitatea lor e limitata. Cele mai cunoscute glicoproteine virale sunt spiculele, inclavate in peplos.Acestea sunt prelungiri proeminente la suprafata peplosului. Cele mai studiate sunt spiculele din invelisul mixovirusurilor cu rol de hemaglutinare si de neuraminidaza.Lipidele sunt incorporate in invelisul viral in timpul inmuguririi din membrana celulara.Invelisul viral are un continut semnificativ mai inalt de colesterol,comparativ cu membrana citoplasmatica. In ceea ce priveste semnificatia biologica: capsida indeplineste un rol protector esential pentru genomul viral, acoperindu-l integral si participa la procesele de adsorbtie si fixare a virionului pe suprafata celulei sensibile. Invelisul extern consolideaza functiile capsidei,protejeaza nucleocapsida si asigura o structura mai compacta a virionului. Spiculele proeminente pe suprafata peplosului favorizeaza fazele de adsorbtie si fixare a virionului in procesul infectios.
6.GENOMUL VIRAL:tipuri structurale,molecule
asociate,dimensiuni. Genomul viral e alcatuit dintr-o molecula de acid nucleic ADN sau ARN. Virionii nu contin niciodata ambele tipuri de acizi nucleici. Virusurile al caror genom e alcatuit dintr-o molecula de ARN formeaza grupul ribovirusurilor,iar cele care au ca genom o molecuda de ADN apartin grupului dezoxiribovirusuri. Genomul viral poate avea o structura unitara sau informatia genetica e distribuita in mai multe segmente genomice legate prin interactiuni specifice.In functie de structura moleculara a materialului genetic,virusurile cu genom ADN se impart in 3 clase: virusuri cu genom dublu catenar, linear; virusuri cu genom dublu catenar, circular; virusuri cu genom monocatenar,linear. Moleculele genomice monocatenare, lineare sau circulare au o tendinta de a se plia formand bucle dublu catenare in ac de par. Genomul viral are sarcina neta negativa si e asociat cu 2 tipuri de molecule ce favorizeaza plierea si impachetarea :poliamine (spermina si spermidina ) si proteine(sunt bazice de tipul protaminelor si histonelor) ce se mai numesc si nucleoproteine. Dimensiunile genomului ribovirusurilor sunt relativ uniforme,variatiile fiind in limita a 30 de ori: genomul virusului hepatitei delta are greutatea moleculara 500kDa(1678 nucleotide)- e cel mai mic genom viral. Cel mai mare genom ARN e al reovirusurilor(15000kDa). Genomul dezoxiribovirusurilor are o scara mai larga de la 1 la 185.Cel mai mic genom e al virusului hepatitei B(1000kDa-3200nucleotide),iar cel mai mare e al unui avipoxvirus (185.000 kDa)
7. Genomul segmentat, polaritatea functionala a
genomului viral:Genomurile virale ARN segmentate (divizate, multipartite) sunt unele ribovirusuri, infectioase pentru organismul animal si pentru plante, ce au genomul alcatuit din mai multe segmente. Cele infectioase pentru om si animale se caracterizeaza prin faptul ca toate segmentele genomului sunt incorporate intr-o capsida comuna.(virusurile gripale, reo- si arenavirusurile).Virusurile gripale au genomul alcatuit din 8 si respective 7 segmente de ARN monocatenat. La Arenaviridae, genomul e format din 2 segmente inegale(L=large=2x106D si S=small=106D). La reovirusuri, genomul are caracter de unicitate, fiind format din 10 segmente de ARN d.c. La toate cele 3 familii de virusuri, segmentele ARN se deosebesc prin secventa nucleotidelor si nu provin din fragmentarea unei molecule mari. Dovada pentru acest fapt e ca moleculele nu hibridizeaza unele cu altele, fiecare fiind transcrisa in ARNm specific si codifica sinteza unei proteine. Ribovirusurile cu genom segmentat, infectioase pentru plante au o particularitate distincta: segmentele genomului nu sunt incorporate in aceeasi capsida virala, ci sunt distribuite individual in capside separate. Pentru desfasurarea cicluliui de multiplicare virala este necesara infectia simultana cu toate particulele viale care constituie complementul genomic.Genomul segmentat pare a fi avantajos, deoarece mesajele genetice mai mici sunt mai usor replicate si transmise in celula EK animala sau vegetala. Pentru virusurile cu genom segmentat repartizat in mai multe capside, faptul pare dezavantajos pentru initierea replicarii, dependenta de toate segmentele genomice incapsidate separat,dar in realitate, in procesul infectios se elibereaza cantitati imense de particule virale care asigura sansa transmiterii tuturor particulelor ce contin un complement genomic.
8. Modalitati particulare de codificare a informatiei
genetice: suprapunerea genica, schimbarea cadrului de citire.Virusurile prezinta o diversitate proprie de sisteme genetice, neintalnita la sistemele celulare. Diversitatea genetica a virusurilor e consecinta succesului lor de a parazita toate grupele cunoscute de organisme. Datorita dimensiunilor mici ale genomului lor, fac economie de informatie genetica utilizand mai multe strategii de codificare, pot depasii conditiile restrictive ale cantitatii limitate de informatie genetica, prin existenta unor gene suparapuse/ suprapunerea genica = o secventa ADN poate sa codifice mai mult decat o proteina. Fenomenul suprapunerii se realizeaza pe 2 cai: 1) Inadirea acelorasi secvente codificatoare ale moleculei de ARNm in succesiuni diferite. La virusurile infectioase pentru animale, informatia genetica are caracter discontinuu, asa cum este si a celulelor . ARNm estew rezultatul unui proces de prelucrare a copiei primare(ARN premesager), ce consta in eliminarea intornilor si inadirea exonilor. La virusuri exonii sunt asamblati in succesiuni diferite in molecula de ARNm , ceea ce diversifica gama proteinelor codificate de o secventa de ADN. Secventele intronilor nu se gasesc in ARN matur.Echipamentul enzimatic care catalizeaza prelucrarea ARNm prin clivare si inadire este localizat in nucleu si in consecinta, mecanismul inadirii genetice poate fi activ numai la virusurile care se multiplica in nucleu sau au o faza nucelara a ciclului de replicare. 2) initierea traducerii mesajului la doua sau chiar trei situsuri diferite. Unele virusuri schimba cadrul de citire a informatiei in timpul traducerii (frame shifting), initiind sinteza proteica la noi situsuri de traducere a ARNm (open reading frames - ORF). Prin initierea traducerii mesajului la 2 sau 3 situsuri diferite, aceiasi secventa de nucleotide este tradusa in 2 sau 3 proteine distincte. Ribosomii au capacitatea intrinseca de a schimba cadrul de citire in timpul traducerii mesajului pe care unele virusuri o exploateaza pentru a diversifica setul de proteine pe care le sintetizeaza .
9. Componente moleculare ale virusurilor cu simetrie
helicala.Simetria este definita de aranjarea ordonata si repetata intr-un ansamblu, a subunitatilor sale identice ca forma si marime, dispuse in jurul unui plan sau al unui ax. Simetria helicala a fost descrisa la virusul mozaicului tutunului, la mixovirusuri, paramixovirusuri, rhabdovirusuri). Simetria helicala este definita de asezarea unitatilor componente in jurul unui ax, care e supus concomtent , unei miscari de rotatie si unei miscari de transaltie, paralela cu acelasi ax(miscarea este similara unui surub). Capsomerele sunt asezate in mod repetat, avand pozitii rezultate din cele doua tipuri de miscare simultana in jurul axului si paralela cu acesta, astfel incat definesc o suprafata cilindrica, cu o structura helicala. Unele virusuri au nucleocapside helicale flexibile , ceea ce le permite sa dobandeasca forma sferica . Cele cu nucleocapsida rigida au forma cilindrica. Dintre virusurile cu simetrie helicala, cu nucleocaspsida rigida, cel mai cunoscut este VMT. Diametrul extern al cilindrului e de 18 nm, iar cel intern de 4 nm. Lungimea cilindrului este de 300 nm . Capsida este alcatuita din 2130 capsomere identice, formate la randul lor dintr-o singura unitate proteia, fiecare proteina avand 158 aa.Genomul sau este o molecula de ARN monocatenar, asezat in zona centrala a virionului, inclavat intre capsomere.Spirele de ARN genomic se inclaveaza si se insera printre moleculele proteice capsidale.Fiecare tu de helice ARN contine 49 de nucleotide care se gasesc in raporturi spatiale cu 16,3 molecule proteice, asezate helical. Unele virusuri nude, cu simetrie helicala au aspectul unor filamente flexibile si o structura tubulara mai laxa(fagii filamentosi). O serie de virusuri infectioase pentru om si animale prezinta o nucleocapsida cu un grad accentuat de flexibilitate, astfel incat virionul ia forma sferica. Faptul se explica prin flexibilitatea individuala a fiecarei capsomere, evidentiata la paramixovirusuri.
10. Formele posibile de existenta a
virusurilor.Virusurile pot exista sub forma virionilor, sau virusul infectios matur(particula virala infectioasa). Pot exista sub forma de virus vegetativ, adica genomul viral liber in celula infectata, care poate fi replicat. Si de asemenea mai pot exista sub forma de provirus sau genom viral integrat in cromosomul celulei gazda.Diferentele referitoare la anatomia virusurilor se refera totdeauna la virion unitatea integrata de structura si functie dotata cu proprietatea de infectiozitate a celulelor sensibile. Din punct de vedere morfologic se disting urmatoarele tipuri de virioni: - de forma sferica(izodiametrica) sau sferoidala (de ex. Virusurile gripale, adeno- si herpesvirusurile, picorna si reovirusurile); - de forma cilindrica alungita, adica de bastonas rigid sau flexibil (virusul mozaicului tutunului sau fagii filamentosi);-virioni de forma paralepipedica, caracteristica poxvirusurilor (virusul vaccinal, virusul variolei);-virioni cu forma de obtuz sau de cartus, la rhabdovirusuri;- in forma de cireasa cu coada (fagii cu coada) Ca dimensiuni, virusurile au dimensiuni microscopice. Cele mai mari sunt orthopoxivirusurile, de 240-300 nm, adica apropiate de dimensiunile celor mai mici bacterii. Bacteriofagii cei mai mari ating 200 nm. Cele mai mici sunt enterovirusurile, sub 30nm diametru, adica de dimensiunea ribosomilor.In functie de manifestarile patologice ale infectiilor virale, virusurile pot fi clasificate in urmatoarele categorii: virusuri dermotrope, cu afinitate pentru tegument si mucoase (poxvirusurile); neurotrope, cu tropism pentru SNC (virusul rabic, virusurile encefalitogene, virusul polio); virusuri dermo-neurotrope, cu afinitate pentru celulele tegumentare si pentru SNC (v. herpetice); v. organotrope cu afinitate pentru organele interne (v hepatice) ; v. pantrope, cu afinitate pentru celulele sistemului reticuloendotelial(fagocite ,celulele reticulare ale sinusurilor venoase din splina si ganglioni, celule endoteliale ale vaselor sanguine si limfatice, fibroblastele tesutului conjunctiv).
11. Comparati parazitismul virusurilor cu
parazitismul bacteriilor.Fata de bacterii virusurile prezinta parazitism absolut, constant, pe cand la bacterii parazitismul absolut e absent. Starea de dependenta totala a replicarii virale de substratul celular viu, corespunde relatiei de parazitism absolut, fundamental distincta de cea a parazitismului obligat, caracteristic unor microorganisme patogene (Treponema, Rickettsi, Chlamydia). Aceste bacterii preiau substante nutritive din celula gazda, au propriul aparat de sinteza a macromoleculelor componente, isi pastreaza totdeauna integritatea structurala. Diviziunea lor are loc pornind de la ansamblul integrat al structurilor celulare.In contrast, multiplicarea virala necesita, in esenta numai genomul viral, toate celelalte componente necesare replicarii fiind de origine celulara. Pe cand bacteriile nu depind intr-atat de celulele organismului parazitat.
12. Natura virusurilor.Virusurile sunt entitati
infectioase complexe si organizate, deoarece contin doua componente esentiale: una genetica (acidul nucleic) si una proteica. Uneori, proteinele nu sunt esentiale pentru exprimarea proprietatilor sistemului, pentru ca acidul nucleic in stare pura este infectios. Caracterul inalt organizat al virionului rezulta din faptul ca relatiile spatiale dintre genom si capsida sunt definite si constante si deriva din simetria la nivel molecular. Virionii nu au echipament enzimatic propriu, producator de energie. Uneori, virionul contine enzime de replicare a genomului. Consecinta este ca virionul nu are metabolism, nu creste si nu se divide. Virusurile realizeaza complexe biologice numai in contextul procesului infectios in celula sensibila. In afara relatiilor cu celula gazda, virionul matur este o entitate inerta. Deoarece nu au metabolism propriu, virusurile nu se multiplica, ci sunt multiplicate de celula, pornind numai de la genomul viral si nu de la ansamblul constituentilor structurali. Infectia virala este rezultatul patrunderii in celula, a virionului sau numai a acidului nucleic viral. Pentru sinteza componentelor virale este utilizat aparatul structural si enzimatic al celulei infectate(ribosomii si enzimele catalizatoare). Instructiunile programului genetic viral sunt executate numai in celula vie. Starea de dependenta totala a replicarii virale de substratul celular viu, corespunde parazitismului absolut.Virusurile se multiplica intr-un substrat celular viu, pornind exclusiv de la genomul viral, dupa modelul furnizat de informatia genetica inscrisa in genom.Cei mai multi autori considera ca incadrarea virusurilor in lumea vie este imposibila, artificiala sau fortata. In evolutie, viul incepe numai dupa constituirea unui program genetic, dar proprietatea fundamentala a viului este capacitatea de autoreproducere. Virusurile poseda anumite proprietati ale sistemelor vii: au un program genetic, se disemineaza, sunt sensibile fata de actiunea factorilor de mediu, dar sunt lipsite de autonomie, adica de capacitatea de a se manifesta ca sisteme bilogice de sine statatoare. Lipsa de autonomie le plaseaza in afara sferei viului.=> virusurile nu se reproduc ca siseme autonome ci sunt multiplicate numai in sistemele celulare.
18.Sinteza mesagerilor de la ribovirusuri. La
ribovirusuri, ARNm are origini diferite in functie de tipul de virus de natura genomului sau, dar in special de polaritatea materialului genetic.Polaritatea acizilor nucleici este sabilita conventional, cu posibilitatea traducerii lor directe sau indirecte, in proteine. ARN genomic ,tradus direct in proteine are polaritate pozitiva. ARN genomic,care este mai intai transcris intr-o molecula de ARNm ale polaritate negative. In ciclul de multiplicare a ribovirusurilor nu se face distinctia functionala intre ARNm timpuriu si tardive,deoarece genomul viral functioneaza alternative ca matrita pentru sinteza ARNm si ARN genomic. Dupa natura ARNgenomic si dupa raportul sau cu ARNm ,ribovirusurile infectioase pentru celulele animale,pot fi impartite in 6 clase: CLASA I. ARNgenomic are rol de ARNm si codifica sinteza proteinelor virale structural si functionale. CLASA II. Au genom cu polaritate negative CLASA III. Au genom segmentat, monocatenar,cu polaritate negative. CLASA IV. Au genom ARN monocatenar, format din 2 segmente. Jumatatea 3 are polaritate negative si este transcrisa in ARNm complementar, de o transcriptaza vironica, iar jumatatea 5are polaritate pozitiva(ARNm rezulta dupa o transcriere dubla.) CLASA V. Au ARN dublu catenar segmentat CLASA VI. Genomul lor se replica printr-o copie intermediara de ADN. ARN genomic are complementaritate pozitiva ,dar nu functioneaza ca ARNm.
13. Comentati gradul de specificitate al interactiunii
virus-celula. Una dintre particularitatile virusurilor si anume specificitatea lor pt o anumita categorie de cel.este in primul rand o specificitate de fixare ,conditionate de interact unei proteine virale ,cu un constituient normal al suprafetei celulare,care are rol de receptor de virus. Gradul de specificitate al interactiunii virus-celula este diferit.Suprafata cel.veg.este acoperita cu ceara,pectin,dar mai ales cu un perete gros celulozic si nu are receptori de virus.Nu se cunoaste niciun virus care sa utilizeze receptori celulari specifici. Infectia cel veg este conditionata de lezarea peretelui celulozic:prin leziune mecanica sau prin virusurile care sunt inoculate de vectori care transmit virusul.Infectia virala nu are consecinte patologice daca virusul nu se disemineaza de la celula infectat initial la celulele vecine. Trecerea virusului de la o celula la alta este impiedicata de peretii celulari.Dar ceulele contin canale in peretele despartitor ceea ce produce un continuum intercelular. 14. Liganzii virali si receptorii. Liganzii virali mai cunoscuti decat receptorii celulari.Virionii inveliti se leaga de receptorii celulari prin glicoproteinele peplosului,care adesea proemina sub forma spiculelor. Structurile de legare a virusurilor nude cu simetrie icozaedrica sunt situate la varfurile icozaedrului. Ele sunt polipeptide ale capsidei sau sunt proteine fibrilare proeminete la varfuri.Receptorul celular este dificil de definit,deoarece particular virala este un ligand de dimensiuni mari ce interactioneaza cu o suprafata mare a celulei, la nivelul careia se gasesc molecule de legare specifice si nespecifice.Pentru ca o molecula membranara sa aiba rol de receptor pentru virus, trebuie sa aiba o densitate suficient de mare pentru a asigura interactiuni multiple cu ligandul viral. Virusul se mai poate lega de receptori dif eriti pe diferite tipuri de celule. Din punct de vedere biochimic receptorii celulari pentru virusuri sunt glicoproteine,glicolipide sau glucide. Specificitatea de legare este confirmata de o parte a unei macromoleculei sau de catenele glucidice ale conjugatelor glicoproteice. Ligandul virusului influenteaza:hemaglutinina, care se leaga specific de resturile de acid sialic ale glicoproteinelor membranei citoplasmatice. Avem receptori pentru :acetilcolina(poate avea rol de receptor si pentru virusul rabic),HCMV(virusul citomegalic uman),adenovirusuri,rhinovirusuri,HIV. Celulele organismului uman si animal au receptori pentru un numar mare de agenti infectiosi. Atasarea de receptorii celulari este un proces reversibil,daca nu se produce internalizarea ,virusul poate sa se detaseze de pe suprafata celulei( fenomen numit ELUTIE). Atasarea virusului determina modificari ireversibile in structura receptorului de internalizare. 39. Definiti transformarea genetica bacteriana si conditiile desfasurarii procesului. Transformarea genetic bacteriana este o modalitate de transfer a informatiei genetice de la o bacterie donoare la o bacterie receptoare, prin intermediul unui fragment de ADN (o fractiune a ADN total al celulei donoare), elberat prin mecanisme fizice (plasmoliza), prin extractive chimica sau pe cale enzimatica. Pentru ca transformarea sa aiba loc, sunt necesare cateva conditii: ADN transformant sa aiba gr. Mol. Intre 1-20kDa; fragmentul de ADN trebuie sa fie dublu catenar ; numarul celulelor transformante creste odata cu concentratia ADN in mediu pana la nvelul de saturare; sa existe un grad de omologie genetica intre ADN transformant si o anumita secventa a crmosomului celulei receptoare ; acceptarea ADN si tansformarea sunt conditionate de o anumita stare fiziologica a celulei receptoare, denumita stare de competent, cu o durata variabila 37. Elementele genetice transpozabile la bacterii: categorii si structura genetica. Elemente genetice transpozabile(EGT) unt secvente specific de ADN , mobile, care se pot desprinde (exciza) din insertiile lor si se reintegreaza in alte situsuri ale aceluiasi replicon sau in repliconi diferiti. Caracteristica generala a EGT este ca toate au capacitatea de a transpoza, adica de a insera la diferite situsuri, fara omologie genetic, pe acelasi sau pe alt replicon. Se cunosc 4 clase d EGT: 1)Secventele de insertie (SI) si transpozonii simpli; 2)Transpozonii complecsi ; 3)Bacteriofagii transpozantii; 4)Transpozonii conjugative. SI si transpozonii nu au existent autonoma ci se gasesc numai in stare integrate in structura unui replicon, ca segmente lineare de ADN, cu extremitati bine definite, in timp ce fagii prezinta o faza libera, extracelulara.
virusurilor in celula animala,dupa fixarea ireversibila se produce prin 2 mecanisme: endocitoza si fuziune. Predominanta este endocitoza (=viropexie),un proces analog celui de pinocitoza,caracterizat virusurilor nude (adeno- si ribovirusurile),dar si unor virusuri invelite(influenza-,rhabdo-,poxvirusuri). Interactiunea initiala a virionului cu receptorii din membrana celulara nu este suficienta pentru a declansa endocitoza particulelor legate ,ci reprezinta semnalul pentru initierea agregarii proteinelor contractile ale celulei si pentru formarea unei pseudopode..Formarea aceasta usureaza interactiuni multiple ale suprafetei virionului cu receptorii celulei. Proteinele contractile ale citiplasmei se activeaza si realizeaza inchiderea particulei virale,intr o vacuola de endocitoza denumita microvezicula sau pinosm tapetat cu clatrina printr un mechanism similar inchiderii unui fermoar. Marginile libere ale memebranei celulare intruzate fuzioneaza si restabilesc integritatea suprafetei celulare,astfel incat virusul ramane inclus intro vezicula de endocitoza. Vezicula pierde invelisul de clatrina si fuzioneaza repede cu mici cisterne de REN si cu lizosomi. Se formeaza un endosom al carui pH se acidifica sub actiunea unei pompe protonice din membrane.Pe masura ce pH scade, protein capsidei sufera modificari de conformatie si expune un domeniu hidrofob ce determina fuziunea cu membrana endosomului.Acesta este mecanisul de patrundere al virionilor nuzi prin liza endosomului. Virusul eliberat din endosome este fie sub forma nucleocapsidei, fie nucleoproteinelor. Fuziunea invelisului viral cu membrane citoplamatica,la care peplosul,la contactul cu membrane celulara,se dizolva si ramane incorporat in membrane. La locul covalescentei celor 2 structuri ,se formeaza un canal care permite trecerea virionului in citoplasma. Fuziunea invelisului viral cu membrana plasmatica necesita interactiunea proteinelor virale de fuziune ale peoplasmului ,cu constituienti specifici ai membranei celulare. Fuziunea este modalitatea de patrundere in celula, caractteristica virusurilor invelite. Cele 2 mecanisme nu se exclude reciproc. Acelasi virus invelit poate fi inglobat pe o cale sau alta, in ffunctie de substratul cellular.Cele 2 mecansime pot coexista frecvent pentru un virus dat ,in raporturile sale cu o linie celulara.
17.Sinteza mesagerilor la deoxiribovirusuri:sediul
transcrierii,enzyme catalizatoare, prelucrarea ARN premesager. Exista 2 faze ale transcrierii:timpurie si tardiva. O mica parte a genomului este transcris in ARNm timpuriu, necesar sintezei proteielor precoce, restul este transcrisa in ARNm tardive. Cele 2 etape sunt separate in timp de momentul replicarii genomului viral. Sunt transcrise de pe catene genomice opuse. Reglarea cantitativa a sintezei proteinelor tardive si timpurii se face posttranscriere,prin intermediul ARN antisens. IN FAZA TIMPURIE a infectiei productive se acumuleaza copiile catenei timpurii ,care sunt traduse in proteine timpurii. IN FAZA TARDIVA a ciclului de multiplicare ARN pol II transcrie copii multiple intregi ale catenei opuse ,iar prin clivare rezulta ARNm tardive si molecule de ARN antisens. Prin asocierea acestora se formeaza ARN dublu catenar ,iar ARNm timpuriu este inactivat. Dezoxiribovirusurile infectioase sunt celule eucariote cu informatie genetica discontina,deoarece pentru a economisii informatia genetica ,secventele codificatoare (exoni) se inadesc intr-o succesiune alternative. O secventa necodificatoare va avea rol de exon pentru ARNm a altei proteine. Transcrierea genelor se face,initial,intr-o molecula de ARN premesager ,ce va fi prelucrata ulterior de aparatul enzimatic al celulei. Copiile de ARNm sunt rezultatul unui process de perelucrare prin clivare si inadire alternative (splicing). Prelucrarea ARNm al dezoxiribolirusurilor este catalizata de enzimele celulare.T ranscrierea si prelucrarea au loc in nucleu. Moleculele de ARNm sunt monocistronice. Poxivirusurile,transcrierea ARN m este catalizata de o ARN polimeraza proprie. La dezoxirobovirusuri transcrierea (in nucleu), traducerea(citoplasma) sunt separate spatial si temporal. La poxivirusuri transcrierea si traducerea au loc in citoplasma.
19.Replicarea si transcrierea genomului viral ARN cu
polaritate pozitiva La virusurile care au ca genom o catena de ARN cu polaritate + (Picorna,Togavirus), catena de sens pozitiva a formei dublu catenare este dislocata de catena nascenta a intremediarului de replicare , iar catena de sens are rolul de matrita pentru sinteza copiilor de polaritate pozitiva care indeplinesc 2 roluri: unele, dupa prelucrarea prin bonetare, metilare interna si adenilare la capatul 3au rolul de ARNm, iar altele functioneaza ca matrite pentru sinteza unor catene noi, de polaritate negativa, amplificand rata sintezei ARN cu specificitate virala. La virusurile cu genom ARN de polaritate pozitiva, pentru ca ARN genomic functioneaza ca ARNm ARN polimeraza se sintetizeaza in celula dupa infectie si nu e componenta virionului de unde rezulta ca ARN genomic e infectios. 20. Replicarea si transcrierea genomului viral ARN cu polaritate negativa.La virusurile cu genom ARN de polaritate (grupul Mononegavirales), mesagerii si catenele genomice sunt transcrise de pe matrite diferite: catena de polaritate negativa a formei dublu catenare functioneaza ca matrita pentru transcrierea ARNm monocistronici, iar cea de polaritate pozitiva este transcrisa in copii de lungimea genomului,de polaritate negativa, cu rol de ARN genomic.
21.Replicarea si transcrierea ARN printr-un
intermediar AND.Replicarea ARN genomic printr-un intermediar ADN este caracteristica retravirusurilor.Genomul ARN al retravirusurilor este replicat printr-un flux de informatie genetica ce trece prin ADN, proces denumit transcriere inversa. Singura functie a ARN genomic este de a indeplini rolul de matrita pentru sinteza intermediarului de ADN in celula infectata. Virionul contine o ADN-polimeraza dependenta de ARN, denumita revers-transcriptaza (RT), precum si molecule de ARNt incorporate din celula in procesul asamblarii, care indeplinesc rolul de primer al transcrierii inverse. Etapele replicarii ARN viral sunt urmatoarele:1)legarea complexului molecular al RT de ARN genomic viral; 2) sinteza unei copii de AND complementar care ramane legata prin punti de H de ARN genomic.Rezulta un hibrid molecular ARN-AND; 3)digestiia selectiva a ARN genomic din hibrizii moleculari ARN-ADN sub acriunea RN-azei H sau RT; 4)sinteza unei catene complementare de ADN viral.Astfel se formeaza o molecula dc de ADN viral care este translocat in nucleul celulei infectate si se integreaza covalent in structura unui cromosom al celulei.ADN integrat este transcris in 2 tipuri de molecule de ARN: unele scurte(subgenomice) cu rol de ARNm si altele lungi cu functie genomica.
22.Proteine virale timpurii si tardive. Proteinele
virale timpurii apartin urmatoarelor categorii: 1)proteine de reglare-rol de instituire si mentinere a ordinii virale.Ele inhiba sinteza macromoleculelor specifice celulei, prin modificarea specificitatii sistemelor enzimatice de replicare, transcriere si traducere, a.i sintezele macromoleculare ale celulei sunt stopate si metabolismul este orientat in sensul sintezei constituentilor virali. 2)proteine matriceale-rol de a delimita terotoriul celular in care virusul se multiplica; 3)proteine-enzime de tipul polimerazelor: ADN- si ARNpolimeraza, nucleaze,ligaze, proteaze. Categoria proteinelor virale tardive cuprinde pe acelea care se sintetizeaza dupa replicarea genomului viral.Ele sunt in primul rand proteine structurale necesare asamblarii virionilor progeni.Alte proteine virale tardive au rol functional: 1)proteine reglatoare 2)proteine de morfogeneza-necesare asamblarii capsidei virioilor cu simetrie ikosaedrica. Se sintetizeaza proteine cu rol de cofraj pe care se asambleaza capsomerele.Dupa constituirea capsidei,proteinele de cofraj sunt eliminate si in capsida este incorporat genomul viral. 3)proteine care usureaza eliberarea virionilor din celula. Sunt necesare la celulele cu perete rigid.Aceste proteine lizeaza mureina parietala a.i.virionii sunt eliberati. 23. Mecanismul eiberarii virusurilor din celula.Eliberarea virusurior din celula se face prin mai multe mecanisme ,dependente in 1-ul rand de nat.
virusului.Virusurile nude se eibereaza rapid dupa
moartea si liza celulei.Intr-o mica masura virusurile nude se elibereaza prin modificarea permeabilitatii m.c..Ribovirusurile invelite (mixo-, paramixo-, toga-,retrovirusurile) se elibereaza prin inmugurire din m.c. sau din cisternele R.E.granular.Ultimele etape ale asamblarii nucleocapsidei sunt asociate cu 1-ele stadii ale inmuguririi sau asambarea capsidei precede inmugurirea. Inmugurirea are loc la niv unor situsuri specifice ale membranei celulare ,acolo unde prot virale s-au inserat atat pe fata int cat si pe cea e xt a m.p. sau a membranlor R.E Asamblarea prin inmugurir necesita co localizarea componentelor structurale.Proteina care proemina pe sup ext a membr sau in cisternele R.E sunt glcozilate iar cele care tapeteaza fata int a m.c sunt neglicozilate. Glicoprot virale se insera in zone distincte ale membr din care prot celulare sunt deplasate sau chiar indepartate.Nucleocapsidele se asociaza specific cu prot virale care tapeteaza fata citopl a membr ( prot M) sau cu domeniile citopl ale glicoprot virale inserate in membrana. La ortho si paramisovirusuri nucleocapsidele recunosc specific si se ataseaza de prot matriceala.Ulterior incepe inmugurirea si treptat virionul se elibereaza,invelit fiind de m.c. in care exista inclavate glicoprot virale .Prot matriceala are rolul unei punti de leg intre nucleocapsida virala si glicoprot inserate in membr. Lipidele+glucidele din invelisul viral sunt proprii celulei,din aceasta cauza compoz lor in struct unui virus difera in raport cu substratul celular in care se multiplica.Dat. acestui fapt preparatele unui virus obtinute pe linii celulare dif se deoseb prin prop fizice,biolog si antigenice Unele virusuri care inmuguresc nu sunt eficiente in proc eliminarii prot membr,iar fenom incorporarii prot strainne este real. Eliberarea virionilor prin inmugurire este mai eficienta pt randamentul infectios deoarece nu depinde de dezintegrarea imediata a celulei ,celula ramane viabila o perioada mai lunga de timp sau dupa transformarea maligna este chiar nemuritoare si elibereaza virus. La herpesvirusuri virionii se invelessc la contactul cu lamela interna a membr nucelare,traverseaza sp dintre cele 2 lamele si la niv porlor nucleari trec in cisternele R.E si in veziculele. Sist menbranare inchide protejeaza virionii de contactul cu citopl si mediaza trasnportul la supr celulei. Membrana vezivulei de transport, fuzioneaza cu membrana citoplasmatica si virionii sunt eliberati in sp extracelular.
24. Explicati evolutia independenta de tip citocit si
echilibrata a complexului virus-celula. Sistemul independent citocid corespunde relatiei in care genomul vial se replica foarte activ .Celula este coplesita de rata inalta a biosintezei componentelor virale si de asamblarea virionilor progeni.Rezultatul este dezintegrarea celulei si eliberarea virionilor progeni.Aceasta interactiune corespunde infectiei litice productive.Sistemul independent echilibrat caracterizeaza complexee furnizate de undele virusuri moderate,care persista in celula dar nu inhiba biosintezele celulare.Genomul viral se replica autonom,dar cu o rata scazuta,care asigura persistenta lui in celula si transmiterea de la 1 generatie celulara la alta.Se sintetizeaza macromolecule virale si se asambleaza virioni progeni.Caracteristic este faptul ca geomul viral se pastreaza in celula in stare fizic indep, ca AND episomal,virusul det o infectie de lunga durata 25. Evolutia de tip integrativ a complexului virus celula animala si fag-celula bacteriana. Evolutia dep sau interactiunea de tip integrativ a fst recunoscuta initial pt interactiunea fag lambda cu celulele E.coli k12.Genomul viral se integreaza in cromosomul bacterian, ca profag si persista nu numai in celula infectata ci se transmite descendentilor ei. Interactiunea de tip integrativ caract raportul dintre genomul virusurilor oncogene si celulele animale.Uneori,rezultatul interactiuni de tin integrativ este transformarea maligna a celulei ,consecinta directa a modificarilor profunde a functiilor celulare.Celulele transformate malign pot sa produca virus progen dar in alte cazuri producerea virusului progen nu este detectabila.Alteori interactiunea de tip integrativ nu are ca efect transformarea maligna, ci constituie mecanismul molecular obligatoriu al multpilicarii virale.
26. Tipuri de infectii virale in vivo .Interrelatiile dintre
virusuri si organisme sunt modulate de virulenta virala,de sistemele de aparare, de tipul celulelor infectate.Astfel modulata,multiplicarea virusuriloe in organism produce mai multe tipuri de infectii : infectia inaparenta,infectia acuta, infectia persistenta cu diferitele sale modalitati de evolutie :infectia cronica ; infectia latenta ; infetcia lenta Infect inaparente definesc situatiile in care, infect si replicarea virala nu sunt insotite de manifestari clinice .Virusurile se multiplica intr-o masura limitata in celula pt care manifesta un tropism nat si nu det simptome clinice (ex virusul polia manifesta un tropism evident pt celulele mucoaseo digestive dar infectia evolueaza inaparent.Aceste infectii au o importanta deosebita in epidemiologie) Infectiile acute sunt det de virusurile care depasesc sist de aparare a organismului si produc leziuni mai mult sau mai putin ample, cu alterarea starii generale a organismului.Pt infectia acuta perioada de incubare este urmata de perioada de stare ,cu manifestarile clinice.La niv celular infect acute sunt de tip productiv.Este produs virus progen si de cele mai multe ori se produce liza ceulara.Aceste infectii au o durata limitata in timp .De cele mai multe ori virusul este eliminat din organism lasand dupa caz o stare de imunitate mai mult sau mai putin solida.Infectiile persistente au o durata f indelungata de evolutie uneori pt tot restul vietii.Ele pot avea acest tip de evoutie de la inceput,adica din mom infectiei dar uneori persistenta este consecutiva unei infectii acute.
29.Explicati transductia genetica mediata de
retravirusuri si de fagi. Retravirusuri transductoare sunt acelea care poarta oncogene celulare in genomul lor; Genomul retravirusurilor nu se mai excizeaza,este transcris uneori impreuna cu gena invecinata ARN hibrid cu ARN transcris de pe gena celulara:C-onc,C-src,Vonc,V-src. Retravirusuri transductoare sunt defective de multiplicare, deoarece oncogena celular a nlocuit total sau parial, o secven esenial pentru desfurarea ciclului de multiplicare, cu excepia virusului sarcomului Rous, care i pstreaz capacitatea de multiplicare. Genele c-onc nu sunt gene virale: nu au rol n ciclul de multiplicare, iar virionii transductori au numai rolul de vehicule pentru oncogenele de origine celular. Virusul sarcomului lui Rous,transductor al genei V-src,virionii contin genomul viral intreg cat si gena virala V-src la un nou ciclu infectios, se integreaza in genomul celular si aduce si gena V-src.Virusurile transductoare au o eficenta foarte inalta de transformare maligna,transforma fibroblastele de embrion de gaina in 24 de ore, in vivo induc forma tumorilor maligne in muschiul pectoral al puilor de gaina in cateva zile. Transductia este procesul de transfer a materialului genetic intre celulele bacteriene mediate de fagi.In raport cu diversitatea genelor transductoare de fagi poate fi: a)transductia specialzat transfera gena Gal/Bio/ambele; b)transductia generalizat procesul de transfer printr-un fag a (), gena a cromosomului bacterina indiferent de pozitia in genom.Ca un fag sa fie transductor ADN trebuie sa fie degradat,sa fie fragmente adegvate ca marime pentru impachetarea fagica sa aib specificitate saczuta.Cand celula se sparge rezulta ADN viral si fagi cu ADN bacterian.In capsida se incorporeaza si ADN viral/bacterian.; c)transductia abortiv molecule de ADN exogen nu se replica ei se dubleaza in populatile de celule.
27.Ciclul litic al interactiunii fag-bacterie
(multiplicarea faguli). Multiplicarea fagului are loc intro serie de etape ,identificate initial pentru cuplul fag T4E.coli.Multiplicarea proriu zisa este precedata de stabilirea contactului fizic dintre fag si celula sensibila.Adsorbtia si fixarea fagului sunt rezultatul ciocnirilor intamplatoare dintre particula fagica si celula bacteriana.Pentru fixarea fagilor din seria T-par, un rol esential par sa-l aibe crosetele placii bazale deoarece distanta dintre placa bazala si peretele celular nu eeste niciodata mai mica de 5 nm. Fixarea particulei fagice pe celula bacteriana depinde de existenta la surafata celulei a unor structuri chimice complementare denumite receptori de fagi..Receptorii s-au evidentiat pe membrana externa a peretele celular si pe stratul capsular la bact gram negatile ,pe ac teichoici ai bact gram pozitive,pe flageli si pe pili. S-au descris urmatoarele mecanisme principare de legare a fagilor :fagii cu coada contractila din seria T se fixeaza reversibil prin interm fibrelor cozii,pe catenele glucidice ale LPS la G- sau pe ac teichoici parietali la G+.Fibrele cozii fagului T4 prin capatul lor distal interactioneaza cu specificitate inalta ,cu resturile glicozi ale LPS din m.ext la E.coli ; fagii cu coada necontractila ,se leaga de componenta glucidica a LPS, din m.ext a p.c.Imediat dupa aceea are loc degradarea partiala a receptorilor sub actiunea unei endoglicozidaze virale ; capsula bacteriana blocheaza fixarea fagilor pe structurile subiacente, dar uneori fagii se leaga de receptorii capsulari si infecteaza celula ,dupa degradarea partiala a polizaharidelor ; Fagii icozaedrici ARN masculi se leaga pe suprafata pilului.Sinteza pilinei si asamblarea pilului sunt codificate de plasmidul F ;fagii filamentosi se fixeaza la extremitatea pilului prin interm prot A a capsidei virale. Infectia p-z : Dupa fixarea pe suprafata celulei bacteriene placa bazala isi schimba conformatia si induce o modificare a modului de aranjare a capsomerelor tecii cozii, teaca se contracta si se scurteaza, usurand patrunderea cilindrului axial al cozii,prin pc ADN din capul fagului trece in celula pe calea cilindrului axial tubular.La fagii din seria T-par, coada contractila infecteaza genomul in citoplasma celulei,capsida fagica ramane in intregime la ext,indeplinind numai rolul unei microseringi.Mecanismul injectarii genomului fagic nu este cunoscut cu certitudine.Memb int si cea ext par sa fuzioneze local => un canal.Ac nucleic fagic patrunde direct prin pctul de fuziune a membranelor.Genomul fagic ar fi orientat spre celula bact de molec proteice pilot asociate genomului.Ulterior canalul se inchide.Infectarea genomului fagic se realizeaza intr-un interval scurt.In procesul transferului genomul fagic,celula bact ar fi pasiva pt ca in capsida ADN fagic este pliat si impachetat f strans ceea ce ar crea o presiune dat careia ADN, in mom contractiei cozii si al scoaterii dopului proteic , ar fi propulsat energic in celula bact.Genomul fagic liber in celula corespunde starii de fag vegetativ si poate fi transcris si replicat. Infectia fagica a celulei bacteriene,det o reorganizare profunda a activitatii sale biologice.Programul genetic este transcris in 2 etape : timpurie si tardiva separate in raport de intervalul de timp al replicarii genomului.Progr timpuriu L GENOMULUI Fgic codifica urm prot :proteine de membrana ; nucleaze care degradeaza cromosomul bacteran; proteine care catalizeaza sinteza bazelor specifice AND fagic; proteine reglatoare ale transcrierii AND fagic ; enzime care catalizeaza replicarea AND fagic,AND pol,polinucleotid ligaza. Replicarea genomului fagic este mai bn cunoscuta pt fagii T4 si lambda.AND t4 se sintetizeaza din nucleotidele rezultate din degradarea AND celular,proces catalizat de endonucleazele denA si denB. ADN fagic intr-o prima etapa se replica dupa modelul bidirectional al cercului simplu,se sintetizeaza copii ale genomului ,care vor fi transcrise pt sinteza prot tardive.Ulterior ADN fagic se replica dupa modelul cercului rotativ.Rezulta o molecula poligenomica de ADN,un genom concatemer.O endonucleaza cliveaza concatemerul in molecule de lungimea genomului,ce vor fi incorporate in capsida in procesul morfogenezei.Sinteza prot tardive devine predominanta dupa 20 min dupa ce ADN a atins rata maxima de replicare,iar transcrierea genelor timpurii este stopata.Proteinele tardive : majoritatea proteine structurale ;proteine de morfogeneza ; proteine enzimatice. Mai mult de 50 de gene ale fagulu T4 sunt implicate in morfogeneza.Prima regula a morfogenezei este ca asmblarea se face pe modilestructurale.Capetele si cozile sunt primele care se asambleaza.A2-a regula este ca asamblarea se face de la capatul terminal spre punctul de jonctiune cu restul virionului. In procesul
asamblarii capului 1-a structura care se formeaza se num
este precap tip 1, alcatuit din proteine de cofraj pe care sunt inserate capsomerele si nu contine ADN,apoi este convertit in precap tip 2,si el fara ADN. Impachetarea ADN incepe prin legarea unui capat al molec de ADN poligenimic de o proteina a capului fagic. ADN patrunde pe unul din varfurile icozaedrului dupa dislocarea unei capsomere.La acelasi varf se asambleaza coada. Toate molec de ADN genomic contin aceasi secventa de nucleotide ,dar secventa initiala a genomului se repeta la capatul terminal si difera de la 1 virion la altul.Fagii maturi se acumuleaza in celula bacteriana iar cromosomu bacterian pierde treptat coordonarea activitatii celulare.Muramidaza se sintetizeaza timpuriu dupa infectie dar este inactiva cat timp celula este fiziologic activa.Enzima sectioneaza molecula de mureina,iar celula activa repara leziunile,cand ele nu mai pot fi reparate ,celula se lizeaza si elibereaza fagii progeni. Fiecare virion progen poate infecta ata celula. Fagii icozaedrici cu genom ADN m sunt totdeuna virulenti si ce cu ADN dc si lizeaza celula in 30 min.Se replica initial=> o molec scurta de ARN apoi 1 molec de ADN dc. Fagii filamentosi cu ADN circular care se dubleaza prin pliere fata de sine insusi. Virionul se adsoarbe la extremitatea unui pil F.ADN m este tapetat cu o prot.Impachetarea genomului in capsida este concomitenta cu iesirea virionului.Pe masura ce ADN fagic patrunde in membrana,este acoperit de prot capsidei.Sunt sg fagi care nu necesita iza celulei pt eliberare.
31. Organizarea functional a genomului
procariotelor (PK) Organizarea functional a genomului procariotelor are functii: 1)depoziteaza informatia genetic; 2)se replica si transmite informatia pe vertical(de la o generatie la alta); 3)coordoneaz activitatea celulelor. Celulele PK,Eubacterii si Archaea au genom relativ unic si un progenom de dimensiuni mari.Mecanismul de transfer genetic asigura un afluviu de informatie genetic neegalat la alte specii. n raport cu functile ndeplinite n structura cromosomului bacterian exista gene: a)genele structurale ce sunt transcrise coordonat si intra n alalele unui operon,codifica enzime necesare unei cai de biosinteza sau a enzimei necesare degradarii unui subatrat,energetic. b)genele reglatoare codific sinteza unei molecule cu rol reglator efector numit represor de e actionat in forma nativ sau aporepresor inactiv n nativ necesitand o alt molecul. c)represorul se fixeaza la operator pe principiul ON/OF. d)promotor-segvente la nivelul caruia se leaga ARN polimeraza; e)genele pentru sinteza ARNr; f)segventele de insertie. 32.Clasificarea plasmidelor n functie de capacitatea lor de a media transferul de material genetic prin conjugare si de a se integra n cromosomul celulei. Clasificarea plasmidelor: 1)dup efectul asupra celulelor gazd ; 2)pe baza secventelor de nucleotide. n functie de capacitate de a media transferul material genetic intre celulele prin conjugare se disting:factori de sex ( F) ce confer celulelor proprietatea de donor de material genetic - celule musculare. Plasmidele ce mediaz transferul prin conjugare se numeste conjugoni (transferoni) ,Tra-determinat genetic ex:factori F,plasmide,R,Col; plasmide neconjugative:celelalte plasmide R si Col Dupa criteriu capacitatea de integrare in cromosom:1. integrative =integrarea e reversibil,plasmida se excizeaz: -corect revine la forma fizica autonom si -incorect,ia cu ea segvente din cromosomul bacterian.(factor F prim) 2. neintegrativeau existenta fizic autonom
28. Caracterizati sin punct de vedere functional
oncogenele celulare si antioncogenele (gst) .Denumirea de oncogene semnifica faptu ca sunt gene care au potential de a determina transformarea maligna a celulei sub actiunea inductoare a unor factori de mediu.Genele oncegene sunt componente ale setului normal de gene celulare si se num oncogene celulare (c-onc) sau protooncogene.Oncogenele celulare codifica sinteza oncoproteinleor localizate in membrana,citoplasma si nucleu. In conditii normale oncogenele si oncoproteinele indeplinesc functii esentiale pentru controlul diferentierii celulelor in cursul dezvoltarii embionare,al cresterii si diviziunii celulelor diferentoate iar in conditii de dezechilibru functional ,oncogenele si oncoproteinele sunt efectorii transformarii maligne.Cresterea celulara normala ese controlata de 5 tipuri de proteine,codificate de oncogene : factorii de crestere,receptori de factori de crestere,transductori intracelulari si semnalului,factori nucleari ai reglarii transcrierii,proteine care controleaza ciclul celular.Oncoprot nucleare sunt componente terminale ale catenei proteice,ele regleaza rata de diviziune celulara.Ele controleaza intrarea celulelor in ciclu de diviziune si inchid ciclinele.Cele mai cunoscute sunt RB si p53 codificate de genele supresoare ale oncogenele (antioncogene). Ele actioneaza ca inhibitori ai diviziuni avand capacitatea de a stopa progresia celulelor spre malignizare.Genele c-onc sunt active in timul dezvoltarii embrionare si sunt esentale pentru diferentierea celulara dar ulterior ele represeaza. Toate conc isi pastreaza capacitatea de a-si relua activitatea si de a o intensifica in anumite conditii : dupa infectia cu un virus oncogen,sub actiunea unor factori de mediu,dupa mutatii punctiforme. Activarea oncogenelor sau inactivarea antioncogenelor este numitorul comun al tuturor tipurilor de cancere.Oncegenele celulare s-au izolat din t.normale.Cea mai cunoscuta oncogena este c-src,omoloaga cu v-src a virusului sarcomului Rous.Oncogenele din celulele normale au un corespondent in celulele maligne.Substitutia unui singur aminoacid in proteina codificata poate converti o protooncogena intr-o oncogena. Transformarea maligna este asociata unrmatoarele evenimente : a)schimbarea unei singure baze prin mutatie puntiforma ; b)oncoprot codificata de gena normala are o anumita rata de turn-over,activitatea sa fiind reglata de rata sintezei si degradarii.Oncoprot codificata de gena mutanta poate fi o molecula mai stabila si astfel activitatea ei biologica va creste ; c)translocatia intr-o noua localizare si trecerea unei gene sub controlul unui alt promotor poate altera expresia protooncogenelor
30.Comentati mecanismul interactiunii
oncodnavirusurilor cu substratul celular permisiv si nepermisiv. Familiele Adenovirusuri,Herpesvirusuri,Papilomavirusuri,Hepadna virusuri,Paxviridae. Spre deosebire de retravirusuri, la care oncogenele sunt de origine celular, genele transformante ale oncodnavirusurilor sunt gene virale eseniale pentru ciclul de multiplicare i nu au coresponden printre genele celulare normale.Genomul viral ADN nu se integreaz n genomul celular. n celulele permisive e transcris tot genomul viral,se sintetizeaz proteinele virusului, se asambleaz virusul progen si celula e lizat.n celulele semipermisive.n celulele semipermisive/nepermisive e transcris doar programul timpuriu ,se sintetizeaz proteine timpurii,apoi ciclul de multiplicare e blocat.Genomul viral poate fi degradat de endonucleaze/persist,nu se replic,se dilueaz n populatile de celule.Transformarea malign cu virusuri oncogene ADN este un eveniment rar (mai mic de 1/1010), ceea ce reflect ineficiena mecanismelor specifice de integrare a ADN viral n cromosomii celulei.Condiia transformrii maligne este pstrarea genomulu viral n nucleul celulei, n stare fizic autonom sau integrat i ntreruperea transcrierii programului tardiv.
a) b) c) d)
33.Structura genetic a plasmidelor.Plasmida R
ADNdublu catenar circular covalent nchis-1-2% din nr de nucleotide ale cromosomului-10% din nr de nucleotidele cromosomale.Plasmidele conin: gene eseniale pentru existena lor ca repliconi fizic independeni; gene de specificitate pentru incompatibilitate; gene structurale; elemente genetice trenspozabile (EGT), determinani genetici de transfer pentru plasmidele conjugative. Plasmidele confer proprieti noi celulelor purttoare: rezistena la antibiotice, la cationii metalelor grele, la anioni (arseniat, arsenit, borat, cromat, telurit), proprieti noi de biosintez, proprieti metabolice noi. Recombinarea interplasmidial st la baza formrii plasmidelor mari de rezisten la antibiotice. Plsamidele R- diverse la Shigella dysenteriae-bacterii enter... Plsamidele R contin gene structurale de rezistent la antibiotice (cloromfemicol,streptomicin,quinoloane,sulfamide) incluse n structura unui element genetic transpozabil. Cele 2 categori de determinanti genetici (de transfer de rezistenta)existente concomitent in structura unei plasmide mari sau se disociaz n plasmide mici: una cu determinare de rezistent si cealalt Tra, Disocierea e reversibil. 34.Recombinarea plasmidelor. Recombinarea plasmidelor prcesul reversibil cei 2 repliconi replicati se pot separa prin excizatia repliconului de dimensiune mica.Cele mai numeroase plasmide sunt factori de fertilitate (F) descris la E.coli, tulpina K12. Factorul de fertilitate F are plasmida mare de 1000Kbaze/per celula. Structura factorului F e replicon de sine stttor cu ori si elemente genetice transpozabile.Genele Tra codific plina ce trebuie asamblat n structura pililor.Pilul leag celule cu potentialitate receptoare(celula-femel).Se formeaz un canal de conjugare exista si secventele cu functi necunoscute. In functie de prezenta factorului F se descriu celulele de E.coli: F+ cu potentialitate cel-mascul F- cu potentialitate cel-receptoare, cel-femel Hfr (high freqvency of recombination)-transfera cu o mare fregvent la celulele F1. F recombinat rezulta Fprim n urm exciziei incorecte. 35. Mecanismele rezistentei bacteriilor la antibiotice.Bacteriile prezinta o multitudine de cai prin care scapa de efectele inhibitorii ale substantelor terapeutice si gasesc noi modalitati de a invada tesuturile gazdei. Mutatiile care confera rezistenta la un antibiotic, pot sa inactiveze o familie intreaga de antibiotice inrudite structural. Asfel bacteriile rezistente la o sulfamida sau la o tetraciclina sunt rezistente la toate sulfamidele respectiv la toate tetraciclinele. Uneori rezistenta la antibiotic este determinate de mutatii ale genelor cromosomale, dar de cele mai multe ori, rezistenta multipla este consecinta dobandirii unei plasmide R. Rezistenta plasmidiala la antibiotice si la agenti chimioterapeutici a celulelor bacteriene este bine cunoscuta. Prezenta plasmidelor R in celulele bacteriene se coreleaza cu rezistenta multipla la antibiotice. Eliminarea plasmidelor este urmata de redobandirea sensibilitatii la aceleasi antibiotice. Rezistenta plasmidiala la antibiotice este multipla si are capacitatea de a se transmite nu numai pe verticala ( de la o generatie la alta) ci si pe orizontala, prin mecanismele de transfer genetic intre diferite specii patogene, sau de la specii saprobionte la specii patogene. Efectul antibioticelor si al agentilor chimici antimicrobieni poate fi contracarat prin mai multe mecanisme, unele intrinsece fiziologiei bacteriei, iar altele rezulta din mutatiile genelor ce codifica pentru structurile tinta. ADN cromosomal si plasmidial bacterian poseda un rezervor de gene de rezistenta, ce codifica diferite mecanismede rezistenta la antibiotice: activarea pompelor de eflux, enzime inactivatoare ale antibioticelor, modificarea tintei actiunii antibioticului. Inactivarea enzimatica a antibioticelor, este cel mai comun mecanism al rezistentei la o varietate larga de tipuri structural de antibiotice. Genele codificatoare ale enzimelor ce inactiveaza diferite antibiotice se gasesc in rezerva naturala de gene de rezistenta. Antibioticele pot fi inactivate prin clivaj enzimatic sau prin modificare chimica( fosforilarea, acetilarea sau adenilarea aminoglicozidelor), astfel incat ele nu mai sunt transportate in celula sau nu mai interactioneaza cu tinta specifica. Modificarea chimica poate conferi rezistenta clinica la aminoglicozide (pot fi fosforilate, adenilate, acetilate), cloramfenicol(ianctivat prin acetilare), peniciline, cefalosporine. Enzimele -
lactamazele inactiveaza antibioticele -lactamice.
Efluxul activ al antibioticelor. Celulele bacteriene si eucariote au o varietate de sisteme de transport membranar, care indeplinesc functii vitale: inglobarea nutrientilor esentiali, eliminare compusilor toxici, mentinerea homeostaziei celulare. Efluxul transmembranar al antibiotecelor este un mecanism foarte eficient al rezistentei si functioneaza pentru expulzarea antibioticelor care au patruns in celula. Rezistenta la antibiotice si la antiseptice a bacteriilor patogene se datoreaza frecvent, eliminarii medicamentului. Sistemele de rezistenta prin flux sunt dependente de energie si pot fi sisteme de transport primare sau secundare. Pompele de eflux pot fi specifice pentru un anumit medicament sau transporta o larga varietate structural de medicamente si de aceea sau numit pompe cu functie transportoare multipla. Toate proteinele de eflux sunt dependente de ATP. De asemenea sa indentificat un numar mare de proteine de transport care confera rezistenta multipla la medicamente(MDR=multidrug resistance), implicate in exportul unei mari diversitati de compusi chimici antimicrobieni, neinruditi din punct de vedere structural. Transportorii multipli confera rezistenta multipla si utilizeaza gradientul electrochimic transmembranar al protonilor, sau uneori al ionilor de Na pentru a elimina medicamentul. Sistemele de eflux multiplu au o semnificatie clinica majora: dobandirea unui astfel de sistem scade sensibilitatea la un spectru larg de agenti chimioterapeutici. In celulele neoplazice umane, rezistenta la agentii chimioterapeutici antitumorali este mediate in mod obijnuit de pompa de eflux multiplu reprezentata de glicoproteina P care confera rezistenta la un spectru larg de medicamente citotoxice prin exportul dependent de ATP. Modificarea mutationala a tintei antibioticului. Multe antibiotice inactiveaza o enzima specifica sau ribosomii. Un numar mare de tulpini rezistente apar printr-un process mutational: sintetizeaza o proteina tinta care devine incapabila sa lege antibioticul sau mai rar, tinta isi pastreaza functia chiar dupa legarea antibioticului. Adeseori diferenta dintre protein de tip salbatic sic ea mutant consta in substitutia unui singur aminoacid in catena proteica. Utilizarea unei cai metabolice rezistente. Daca un medicament este activ prin inhibarea unei enzime esentiale a unei cai metabolice, celulele care produc o cantitate mai mare de enzima pot supravietui in prezenta medicamentului. Rareori medicamentul trebuie sa fie modificat de aparatul enzimatic al celulei bacteriene, pentru a devein activ. Diminuarea ratei de inglobare(inhibitia intrarii medicamentului in celula). Scaderea permeabilitatii membrane externe a bacteriilor G- si bariera periferica foarte eficienta a micobacteriilor, limiteaza difuzia medicamentelor. Permeabilitatea membrane externe a bacteriilor G- se poate diminua prin pierderea porinelor sau ca rezultat al mutatiilor care modifica porinele si astfel rata difuziei passive a medicametului scade foarte mult. Pierderea mutationala a porinelor creste rezistenta la antibioticele hidrofile, deoarece aceste molecule sunt mai mari decat nutrientii si trec greu prin canalele de transport. Structura moleculara, dar in special datele experimentale, sugereaza ca antibioticele mici(lactamice, tetraciclina, cloramfenicol,) patrund in celula pe calea porinelor. Scaderea permeabilitatii porinelor poate sa mareasca nivelul rezistentei fata de agentii antibacterieni care traverseaza membrane externa prin canalele formate de porine. In contrast , antibioticelel cu molecule mari,lipofile(rifamicinile macrolide) difuzeaza cu dificultate prin porii canalelor. Pentru ele difuzia lenta prin stratul lipidic este o cale semnificativa de patrundere in celula. Membrana externa a bacteriilor G- este o bariera eficienta pentru prevenirea influxului antibioticelor. Moleculele de LPS formeaza baza structurala a integritatii membrane externe. LPS sunt polianionice care leaga cationii bivalenti si formeaza o structura hidrofoba impermeabila pentru moleculele hidrofile. Lps favorizeaza trecerea antibioticelor policationice , acestea se complexeaza avid cu LPS si dezorganizeaza membrana externa .
36. Plasmidele Col, bacteriocinele si mecanismele lor
de actiune.Plasmidele Col sunt elemente genetice extracromosomale care codifica sinteza unor substante antibiotice de tip special, denumite colicine. Denumirea de colicine a fost atribuita unor substante cu propietatii antibiotice produse de o tulpina virulent de E. coli, care au efect letal asupra celulelor producatoare, precum si a unor tulpini strans inrudite cu cea producatoare. Producerea de colicine nu este limitata la E.coli, ci este un fenomen mult mai raspandit in lumea bacteriilor si din acest motiv, Jacob(1935) a dat denumirrile de bacteriocine, bacteriocinogeneza si factori bacteriocinogeni, pentru a desemna substantele, fenomenul si respectiv plasmidele care controleaza producerea lor. Plasmidele Col au aceleasi particularitatI, commune altor plasmide: sunt molecule de AND, circulare, dublu-catenare inchise,suprahelicale. Unele plasmide Col au functie de conjugon, deoarece poarta in structural lor genetic, determinant genetici de transfer. Bacteriocinele sunt substante antibiotice cu actiune bactericida a caror sinteza este codificata de plasmidele Col. De cele mai multe ori bacteriocinele sunt protein pure, uneori sunt glicoproteine. Bacteriocinele produse de bacteriile G- au cateva propietati generale:au un spectru de actiune foaret ingust; actiunea lor este bactericida;contin o component biologic active, de natura proteica; se leaga de celule sensibile prin intermediul unor receptori celulari cu specifitate inalta; biosinteza bacteriocinelor are efect letal asupra celulei producatoare. Bacteriocinele produse de bacteriile G+ au un spectru de actiune foarte larg. Ele sunt active asupra celulelor producatoare, dar si asupra unor specii mai indepartate si chiar asupra bacteriilor G-. Din punct de vedere chimic sunt glicoproteine sau lipoproteine. Mecanismele de actiune a bacteriocinelor. Bacteriocinele produse de celulele G- actioneaza prin mecanisme specific asupra unor tinte situate in membrane sau in citoplasma. Spetrul foarte limitat de actiune a bacteriocinelor produse de celulele G-, sugereaza existent unor receptori prin care acestea isi dobandesc accesul la structuri sensibile. De fapt moleculele care functioneaza ca receptori nu sunt specializate in acest sens ci indeplinesc diferite activitati, in special de transport cellular al unor substante nutritive. Mecanismele de actiune sau studiat pentru colicine(produse de E.coli). Dupa fixarea ireversibila la nivelul receptorilor membrane externe, colicinele isi exercita efectul bactericid prin unul din urmatoarele mecanisme: inhibarea fosforilarii oxidative, stopand astfel procesele energetice celulare. Consecutiv se produce alterarea permeabilitatii membrane plasmatice, blocarea sintezei macromoleculare ca si a transportului active al substantelor nutritive. -unele colicine se fixeaza specific pe molecula de ADN si determina aparitia inciziilor monocatenare, ceea ce deschide calea actiunii nucleazelor celulare si a degradarii AND -altele inactiveaza subunitatile ribosimale 30 S, prin clivarea ARNr 16S In concluzie, bacteriocinele au efect bactericid asupra celulelor sensibile . Ceea ce le deosebeste fundamental de alte antibiotice este faptul ca au efect letal asupra celulelor in care s-au sintetizat si din aceasta cauza, propietatea de bateriocinogeneza nu se poate perpetua intr-o celula, decat in starea ei potential.
38. Definiti fenomenul transpozitiei si consecintele
fenomenului. Transpozitia semnifica excizia EGT din situsul sau de integrare intr-un replicon si insertia intr-un alt situs al aceluiasi sau al altui replicon. Procesele de transpozitie produc o multitudine de rearanjari genetice. Nu numai ca deplaseaza diferite gene de la un situs la altul, dar transpozitia produce diferite macroleziuni:mutatii, deletii, inversii etc. Situsurile insertiei EGT sunt zone calde pentru astfel de modificari genetice. :1)mutatia polara. Insertia elementelor transpozabile perturba invariabil integritatea genei in interiorul careia s-a facut transpozitia si efectul este mutatia. Daca mutatia se produce intr-o gena proximala( in raport cu secventa operatoare) a operonului, ea xercita efecte polare intense asupra genelor situate distal fata de gena mutant. Noul tip de mutatie s-a numit mutatie polara. Concluzia a fost ca mutatiile cu efect polar intens , rezulta prin insertia unei secventa de ADN, la situsul mutatiei. 2)teminarea transcrierii. Insertia unui transpozon intr-un situs nou, prin efectele sale polare, produce frecvent o mutatie. Efectele polare se produc pentru ca EGT sunt, in general, entitati genetice de sine statatoare si adeseori semnifica terminarea transcrierii. 3)variatia de faza. Cea mai cunoscuta mutatie datorita unei inversii a secventei cromosomale este cea care determina fenomeul variatiei de faza. Transpozonii au rolul unor comutatori pentru genele adiacente situsului de insertie : in raport cu situsul integrarii, intr-o directive se initiaza transcrierea, iar in directia opusa, ori o inhiba, ori produc terminarea ei prematura. 4)fuziunea repliconilor. Un transpozon inserat intr-o plasmida, va usura integrarea ei ulterioara in cromosomul celulei, flancata fiind de 2 copii ale transpozonului. 5)plasticitate genetic. Datorita existentei elementelor genetice transpozabile, genomul bacterian a dobandit potentialul unei remarcabile plasticitati genetice. 40. Mecanismul molecular al transformarii genetice. Mecanismul molecular al transformarii genetice a fost descries la B. subtilis, Streptococcus sp., Haemophilus sp. Transformarea genetic este produsa numai de moleculele de ADN dublu catenare, lineare in timp ce ADN monocatenar, ARN, hibrizii ADN-ARN sau ADN circular inchis, nu sunt legate pe suprafata celulelor competente. Procesul transformarii poate fi impartit in 3 etape: legarea molecule de ADN pe suprafata celulei si fragmentarea ei;;inglobarea(transportul ADN prin invelisurile celulei); stabilizarea ADN transformant, fie ca replicon autonom, fie prin recombinare cu un replicon resident; Mecanismul transformarii este asemanator la bacteriile G- si la cele G+ dar exista diferente ale etapelor de legare si inglobare, datorate diferentelor structural majore ale peretelui celular. Intr-o prima etapa, fragmentul de ADN exogen este adsorbit reversibil , consecinte a unei interactiuni laxe. Peretele celulelor G+ are o sarcina neta pozitiva, iar ADN are o sarcina electica negativa. Din aceasta cauza, adsorbtia ADN este rapida. Faza adsorbtiei reversibile dureaza 4-5 seunde. Molecula de ADN poate fi indepartata prin spalare rapida. Faza de legare stransa sau de adsorbtie ireversibila corespunde ancorarii ferme a moleculei de ADN, la cateva situsuri din cele circa 50 ale celulei receptoare. Transportul ADN prin invelisul cellular(inglobarea) este putin inteles. Patrunderea ADN exogen in celula receptoare se face sub forma monocatenara. In timpul transportului, catena complementara este degradata complet. Inglobarea implica incizia unei catene a ADN exogen, la sau langa situsurile de legare la membrane, in prezenta ionilor bivalenti. Urmeaza incizii successive monocatenare, astfel incat una dintre catenele de ADN exogen este degradata complet. Inglobarea ADN monocatenar in celula receptoare poate fi rezultatul actiunii endonucleazei. Transportul se face probabil, printr-un canal membranar format prin modificarea conformatiei spatial a nucleazei. ADN monocatenar este protejat de actiunea nucleazelor in timpul transportului prin formarea unui complex cu o proteina specifica de legare, sintetizata in intervalul de competent. La bacteriile GADN exogen este legat si transportat in transformasomi(vezicule membranare de transport) alcatuiti in special din componentele membrane externe. Intransformasom ADN este protejat de actiunea DNazei exogene si de endonucleazele celulare de restrictie. La iesirea din vezicula de transport o catena a ADN exogen este degradata complet. Moleculele suprahelicale si chiar unele relaxate nu sunt transportate in citoplasma.
Structura spiralizata a plasmidelor sau absenta capetelor
libere impiedica translocatia ADN 41.Descriei experiena princeps prin care a fost demonstrat fenomenul conjugrii i precizai determinismul genetic. Conjugarea = modalitate de transfer de material genetic de la o cel.donoare, la una receptoare, prin intermediul unei legturi celulare directe. Proces condiionat de existena, n cel.donoare, a unei plasmide mobilizabile cu funcie de conjugon care trebuie s codifice structurile necesare realizrii contactului celular i s pregteasc transferul n cel.receptoare. Fenomenul conjugrii bacteriene Lederberg i Tatum (1944) au remarcat c tulpinile dublu auxotrofe complementare de E.coli K12, dup cultivarea n amestec n mediu nutritiv lichid, genereaz cel.prototrofe, care cresc pe un mediu solodificat minimal i produc colonii. De la tulpinile prototrofe,sub aciunea radiaiilor UVmutante nutriionale auxotrofe. Lederberg i Tatum au utilizat, tulpini mutante dublu i triplu auxotrofe, cu incapacitatea de a sintetiza Thr, Leu, tiamina, biotina, Phe i Cis. n experiena crucial, cei 2 au urmrit comportarea a 2 tulpini mutante A i B triplu auxotrofe. Cultivate izolat, pe mediu minimal, cele 2 tulpini bacteriene nu cresc. n experiena propriu-zis de conjugare, cele 2 tulpini bacteriene, au fost puse n contact pt.un interval, n mediul lichid i ulterior au fost nsmnate pe mediul minimal solidificat. Dup 24 de ore se nregistreaz apariia coloniilor prototrofe. n experiena de control, cultivarea tulpinilor A i B, separate, pe mediul minimal, nu genereaz apariia coloniilor. Determinismul genetic al procesului de conjugare : conjugarea e condiionat de prezena n cel.donor, a plasmidei F, care conine determinanii genetici tra i secvenele de origine a transferului oriT. Alte g.codific sinteza pilinei, a moleculelor de recunoatere ntre cel.donoare i receptoare, replicarea plasmidei. Cel puin alte 11 g.st.necesare pt. asamblarea pilului funcional. Factorul F prezint un grad important de omologie genetic cu crs.bacterian, n special pt.g.traipoteza c la origine, g.factorului F ar fi fost cromosomale, dar s-au desprins i au devenit autonome. n funcie de prezena i de raportul plasmidei F cu crs., exist 4 tipuri de cel., care se comport diferit n procesul de conjugare: 1)cel.F-(echivalenii genetici ai organismelor de sex feminin) n-au plasmida F. n procesul de conjugare st.receptoare de material genetic; 2)cel.F+(sex masculin) au plasmida de sex n stare fizic autonom. n procesul conjugrii st.donoare de material genetic;3)cel.Hfr(High frequency of recombination; fiziologic - cel.supermascul, donoare de material genetic) prezint plasmida F integrat n structura crs. Au capacitatea de a realiza cupluri de transfer, urmate de recombinare genetic, cu mare frecven .4)cel.Fconin un factor F modificat prin procesul de recombinare cu crs. Factorul F are proprieti episomale (se integreaz, reversibil, prin recombinare cu crs.). Dup excizia incorect, factorul F se desprinde mpreun cu un mic fragment de ADN cromosomal i devine factorul F. n proces.conjugrii,cel.Fse comport ca cel.F+. 45. Conversia fagic = procesul apariiei unor proprieti fenotipice noi ale cel.bacteriene, consecutiv intrrii n aciune a unor g.fagice. Fenomenul conversiei fagice se manif.la unele bact.infectate c-un fag temperat netransductor, care persist n cel., fie n stare de profag, fie n stare fizic autonom. Conversia fagic se deoseb.de transducia fagic specializat, prin 2 particularit.esen.:modificrile cel.bact.st.rezult.expresiei unor g.de origine viral; -fagii care realiz.fenomenul de conversie st.normali i posed tot setul de g., n timp ce fagii de transducie specializat st.defectivi, datorit pierderii unor g.proprii, prin nlocuirea lor cu g.ale crs.bact.Fenomenul conversiei fagice e cunoscut la Corynebacterium diphteriae. Cel.care au ca mat.gen.numai propriul crs.nu st.virulente i nu determin un proces patologic infecios. Apariia virulenei e condiionat de infecia cu fagul , al crui genom se integreaz n crs. bacterian. Sinteza toxinei difterice e codificat de o g.fagic. Alt exemplu structura chimic a lipopolizaharidului din p.c. de Salmonella. S-a descris fenomenul de conversie serologic a unei linii de S.anatum, dup infecia cu un fag, ca o reflectare a modificarii compoziiei chimice a polizaharid.din molec.de lipopolizaharid. Dup pierderea profagului prin excizie, liniile bact.respective revin la fenotipul anterior infeciei fagice: C.diphteriae pierde capacit.de a sintetiza toxina, iar S.anatum revine la tipul serologic iniial. Se consid.c aceste g.fagice, la origine au fost g.cromosomale, dar au fost ncorporate i au devenit g.fagice.
42.Mecanismul transferului de material genetic n
cuplul de conjugare F+-F- i cuplul Hfr-F-.Cuplul de conjugare F+-F- : Plasmidele conjugative pot s transfere o copie a lor, de la cel.donoare la cel.acceptoare. Transferul plasmidei F se realiz cu o frecv.mare. Dac o sg.cel. de E.coli F+ se adaug la o cultur de cel.F-, aflate n faza de cretere, dup 15-20 generaii, o mare proporie a cel.conine factorul F, ca urmare a transferului unei copii a plasmidei de la cel.F+ la cel.F-, fr ca factorul F s fie pierdut din cel.donoare. Fiecare cel.receptoare dobndete o plasmid F i devine cel.donoare. ntre 2 diviziuni, o cel.F+ realizeaz 1-2 transferuri, a.. factorul F se rspndete repede n populaia bacterian receptoare. Fenomenul s.n. masculinizare epidemic a cel.F-. Dup formarea cuplurilor eficiente, transferul conjugativ al ADN are loc n 3 etape: -mobilizarea ADN pt.transfer; -transferul propriu-zis; -formarea unei plasmide funcionale. Etapele conjugrii se succed numai dac n cel.donoare se gsete o plasmid conjugativ (poart g.ce determin formarea perechilor eficiente) i mobilizabil (pregtete ADN pt.transfer). Plasmidele autotransmisibile st.att conjugative ct i mobilizabile. O plasmid conjugativ poate s medieze transferul unei plasmide nemobilizabile/al g. cromosomale. n cuplul de conjugare F+ x F- se transfer, cu frecven mic, g.cromosomale/ plasmide neconjugative. Fenomenul s.n.conducie = proces de mobilizare pasiv a oricrui replicon, inclusive a crs.cel.F+, prin intermediul Tn(transpozon)1000. La nivel molecular, conjugarea i transferul ADN st.procese complexe, reglate de g.i proteine multiple. Genele implicate n proces.conjugrii st.organizate ntr-un sg.operon operonul tra. Dup retractarea pilului i formarea canalului de conjugare, are loc mobilizarea plasmidei F. Mobilizarea ncepe n momentul n care proteina Tra (funcie nucleazic) codificat de plasmid, realizeaz incizia unei catene, la o secven unic de baze = ori T i rmne legat covalent de captul 5P al catenei incizate. Proteina Tra are i funcie de helicaz - despiralizeaz plasmida F n timpul transferului conjugativ. Mecanismul transferului conjugativ e ipotetic. Incizia monocatenar declaneaz replicarea plasmidei dup modelul cercului simplu i ramura linear ce rezult din replicare e transferat. Proteina Tra are, probabil, rolul de protecie al ADN linear monocatenar, de aciunea nucleolitic i e transferat concomitent cu ADN, n cel.receptoare; mai are i rol de ligaz, reunind capetele catenei lineare n cel.receptoare. Una dintre proteinele codificate de operonul tra, care nsoete ADN n timpul transferului este SSB tapeteaz ADN transferat protejndu-l de aciunea endonucleazelor. n cursul transferului, sinteza ADN se desfoar att n cel.donoare (sinteza conjugativ nlocuiete catena ce se transfer), ct i n cel. receptoare (sinteza conjugativ convertete ADN monocatenar transferat, la forma dublu-catenar). Alt model al transferului consider c proteina Tra rmne n cel.donor i ADN trece n cel.receptor sub forma monocatenar circular, care nu necesit protecie fa de aciunea endonucleazelor. n cuplul de conjugare F+ x F-, g.transferate codific factori accesorii: rezistena la antibiotice, UV, metale grele/degradarea unor compui xenobiotici. Cuplul Hfr-F- : n cel.F+, cu o frecven mic, plasmida F se integrez n crs.bacterian, printr-un proces de recombinare. Situsul de recombinare a plasmidei F n crs.are loc, predominant, n transpozonul IS3. Se cunosc peste 20 de situsuri majore ale crs., la nivelul crora poate avea loc integrarea plasmidei F. Cel.bacterian purttoare a factorului F integrat devine Hfr - are o capacitate foarte ridicat de a iniia formarea cuplurilor de conjugare. n stare integrat, factorul F nu mai e infecios nu se transmite pe orizontal prin conjugare- dect n mod excepional, cnd conjugarea dureaz foarte mult.O particularitate funcional distinct a bacteriilor Hfr, decurge din tendina foarte marcat de rupere a crs.capacitatea de 100% a cuplurilor de conjugare, de a transfera g. cromosomale. Totdeauna st.transferate g.n care s-a inserat factorul F. n funcie de poziia lor fa de situsul integrrii plasmidei F, fiecare g.cromosomal are ansa s fie transferat n cel.receptoare. Mecanismul transferului de material genetic n cuplul Hfr x F- e foarte asemntor cu acela descris pt.transferul factorului F n cuplul de conjugare F+ x F-. Transferul e precedat de incizia monocatenar a crs., la nivelul plasmidei integrate. Incizia e catalizat de proteina Tra, cu activitate nucleazic. Punctul inciziei semnific ori T. Rata uniform de transfer a ADN n conjugare, face ca transferul conjugativ s fie instrumentul esenial de lucru, pt.cartarea genetic a
cromosomului. Din celula donoare se transfer ADN
monocatenar. Concomitent cu transferul are loc replicarea crs.cel.donoare, dup modelul cercului simplu. Catena rmas n cel.donoare are rol de matri pt.sinteza unei noi cateneo copie dublu catenar a ADN transferat. n cuplul Hfr x F- se transfer un mic fragment al plasmidei F, g.cromosomale i n mod excepional se transfer o copie complet a factorului F. De cele mai multe ori, conjugarea se ntrerupe datorit factorilor de mediu, la intervale variabile de timpn conjugare se transfer, de obicei, numai g.cromosomale. Nu se transfer factorul F, deoarece e localizat la captul opus al oriT, astfel cel.receptoare rmne F-.Factorul F se transfer numai dac durata procesului de conjugare e de 90-120 minute, mult mai mare dect durata unei generaii celulare. n general, conjugarea se realizeaz ntre cel.aceleiai specii, dar are loc i interspecific i chiar intergenetic, dar cu o frecven mai mic. De exemplu, E.coli formeaz cupluri de conjugare cu cel.ale propriei specii, dar i cu Salmonella sp., Proteus mirabilis etc. 43.Transpozonii conjugativi i procesul conjugrii la bacteriile Gram pozitive. Transpozonii (Tn) = segmente de ADN mobile; includ n alctuirea lor, o serie de g. structurale, delimitate la extremiti de SI(secvene de inserie), totdeauna repetate n ordine inversat. Interesul pt.studiul transpozonilor s-a amplificat odat cu descoperirea faptului c g.de rezisten la antibiotice pot s treac de la un replicon la altul. Conjugare la bGp la acestea procesul conjugrii are particulariti distincte i e mediat de plasmide i de Transpozoni conjugativi. Transpozonii conjugativi sunt .EGT (elemente genetice transpozabile), n mod obinuit integrate n genomul bacterian i au funcie de transpoziie. D.p.d.v.funcional, Transpozoni conjugativi cumuleaz proprieti ale Transpozoni propriu-zii i ale plasmidelor:- se aseamn cu Tn propriu-zii, pt.c se excizeaz i se reintegreaz n ADN; diferena fa de acetia const n existena unui intermediar dublu catenar nchis covalent; - se aseamn cu plasmidele, pt.c se excizeaz i formeaz un intermediar circular nchis covalent, fizic independent, ce se poate integra n genom.aceleiai celule ori se tranfer prin conjugare, la o cel.receptor i se integreaz n genom.ei; se deosebesc de plasmide, deoarece intermediarul nu se replic. La bGp,strategia formrii perechilor/a agregatelor de mperechere e diferit.Plasmidele i Tn conjugativi st.prea mici pt.a codifica numeroasele prot.Tra ale aparatului de conjugare.
44.Definii transducia genetic mediat de fagi:
variantele procesului de transducie. Transducia = procesul de transfer al materialului genetic ntre celule bacteriene, mediat de bacteriofagi. Zinder i Lederberg transducia generalizat la Salmonella typhimurium au pus n contact mutante auxotrofe, cu diferite incapaciti de sintez i ulterior, au izolat, pe un mediu minimal, colonii recombinante prototrofe au demonstrat c acest proces genetic nu necesit contactul fizic dintre celula donoare i cea receptoare de mat.gen. Agentul mediator al transferului genetic, trece prin porii filtrului, suficient de mici pt.a opri bacteriile. Vectorul purttor de g., de la cel.donoare la cea receptoare a fost fagul temperat P22 a fost indus spontan i astfel cel.lizogene au evoluat spre liz. S-au asamblat particule virale transductoare, care au infectat cel.celei de-a 2a tulpini de Salmonella din amestecul celular. Particulele virale erau purttoare ale g.bacteriene de tip slbatic, care s-a recombinat cu crs.cel.mutante (auxotrofe), rezultnd astfel cel.prototrofe, care cresc i se divid pe mediu minimal i fm.colonii. n raport cu diversitatea g.transduse i cu gradul de manifestare a efectului transduciei asupra cel.descendente, se descriu 3 variante ale procesului: transducie specializat; - transducie generalizat; transducie abortiv. 1.Transducia specializat Lederberg (1953); caracteristic fagului , ca o consecin a faptului c genomul su se integreaz riguros, numai ntre g.gal i bio ale crs.de la E.coli, n raport cu care prezint omologie genetic. Integrarea e rezultatul recombinrii genetice la situsuri specifice. n stare integrat, profagul se comport ca orice g.cromosomal(se replic sincron cu crs.i e transmis tuturor cel.descendente). Sub aciunea unor factori fizici/chimici, genomul viral e excizat din inseriile sale cromosomale,se circularizeaz i se replic productiv,genernd fagi progeni.Procesul s.n.inducie litic, rezultatul fiind liza cel.bacteriene.Fagul e
excizat mpreun cu g.cromosomal gal/bio/am2.
Datorit integrrii g.bacteriene n crs.fagic, are loc pierderea unei secvene echivalente ca mrime, din genomul fagic fagi transductori defectivi, incapabili s se multiplice i s lizeze cel. bacterianpt.a iniia ciclul de multiplicare i liza cel.bacteriene, necesit prezena fagilor helper. Cu o frecven mic, genomul fagului transductor se poate integra n crs.bacterian, printr-un proces de recombinare i g.transduse pot conferi noi caractere fenotipice cel.bacteriene. Cel.bacterian care a dobndit un fenotip nou s.n.transductant. Fragmentul de mat.gen. transdus de genomul fagic e adugat genomului bacterian, nu substituit. Transducia fagic = proces ce se realizeaz cu o frecven mic, dar datorit numrului mare de particule virale i a cel.bacteriene infectate, aceast modalitate de transfer de mat. gen.ntre cel.bacteriene, are rol semnificativ n condiii naturale. 2.Transducia generalizat, nelimitat/nerestrictiv = proces de tranfer, prin intermediul unui fag, a oricrei g.a crs.bacterian, indif.de poziia sa n genom. Procesul a fost descris pt. fagul P1care infecteaz E.coli, fagul P22la Salmonella i pt.unii fagi care infecteaz cel.de B. subtilis. Fagii de transducie generalizat au proprietatea, ca n ciclul litic n raport cu cel. bacterian, s ncorporeze fragm.cromosomale ale gazdei. Virusul P1 are ca genom o molec.de ADN linear, dublu catenar i o capsid icozaedric. ADN, de 100 kb, este permutat ciclic i are secvene repetitive terminale. Ca i fagul T4, dup infecie molecula se circularizeaz. Cuplul poate urma ciclul litic sau lizogenic.Varianta lizogen necesit replicarea ADN circular, n stare fizic autonom. n stare lizogen, fagul P1, sub forma moleculei circulare e meninut ntr-un numr minim de copii, datorit unui control stringent al replicrii, ca i n cazul plasmidei F. Mecanismul distribuiei poate deveni ineficient dac un proces de recombinare omoloag a creat o molecul dimeric, ce se distribuie numai n una dintre cele 2 cel.fiice. n evoluia litic, ADN fagic se replic dup modelul i al cercului rotativ. Rareori, n procesul asamblrii, sunt ncorporate i fragmente de ADN ale crs.bacterian, rezultnd fagi de transducie generalizat. Infecia cel.de Salmonella cu fagul P22 produce fragmentarea ADN celular. n cursul morfogenezei virale, n capside se mpacheteaz, uneori, exclusiv ADN bacterian i rezult fagi transductori. n capsidele goale st.ncorporate, de regul, numai g.de provenien bacterian i numai n mod excepional st.ncorporate g.celulare n asociaie cu mici fragm.de genom viral. Teoretic, oricare dintre g.cromosomale, are o ans egal de a fi transdus ( denumirea transducie generalizat), dei, practic, unii cistroni st.transdui cu o frecven mai mare. n capsida fagic st.mpachetate preferenial, fragm.de ADN care au o secven similar secvenei pac, care regleaz mpachetarea genomului fagic. Aparatul enzimatic de mpachetare a genom.fagic recunoate secvena anolog i astfel fragmentele de ADN bacterian st.ncorporate n capsida viral. Rezult astfel, particule fagice care poart diferite fragm.ale crs.bacterian. Dei n cel.exist cantiti aprox.egale de ADN fagic i ADN celular, numai un mic procent al fragmentelor crs.bacterian e mpachetat i un procent mic de particule virale st.transductoare. Factorul limitant al asamblrii fagilor transductori e frecvena secvenelor pac. Particulele fagice care ncorporeaz exclusiv/preponderent g.bacteriene st.totdeauna defective. Aceti fagi nu st.obligatoriu lizogenizani. Dup ce infecteaz o nou cel.bacterian, nu se multiplic i nu au efect litic, deoarece lipsesc g.virale eseniale. Genele transduse pot fi integrate prin procese de recombinare, n crs.bacterian. Procesul se realizeaz prin nlocuirea unor determinani genetici ai cel.receptoare,cu cei transdui. Recombinarea necesit omologie genetic ntre secvenele de ADN participante i e dependent de proteina Rec A. 3.Transducia abortiv (incomplet) genomul virusului transductor nu determin liza, dar nici nu se integreaz n crs.celulei infectate. Recombinarea fragm.de ADN transduse, de origine bacterian, are loc cu o frecven foarte mic. Majoritatea fragm.transduse rmn n citoplasma cel.receptoare. Nu se replic, deoarece conin o origine a replicrii i astfel st.motenite numai de una dintre cele 2 cel. surori care rezult la fiecare diviziune. Totui, st.g.fucionale i codific produsul lor n cel. receptoare, n care determin o stare de diploidie parial. Genele transduse se dilueaz treptat n populaia celular, prin diviziune. Dac cel.e mutant nutriional, iar fragm.transdus i are originea ntr-o cel.prototrof, se produce complementarea genic i reversia la prototrofie a cel.receptoare. La fiecare diviziune celular, produsul de sintez a g.transduse poate fi distribuit n cele 2 cel.surori i astfel, cel. care nu primete fragm.de ADN,
fenotipic poate rmne de tip slbatic, pn cnd
produsul e degradat/diluat prin diviziuni succesive