Biologie celulara si moleculara

APOPTOZA

Moartea celulara fiziologica este esentiala pentru dezvoltarea si functionarea normala a

organismelor multicelulare. Celulele non-necesare, deteriorate si potential nocive trebuie inlaturate
din microclimatul celular sanatos pentru asigurarea homeostaziei structurale si functionale a
tesutului. Exemple ale mortii celulare fiziologice au fost observate la aproape toate tipurile celulare
pe parcursul dezvoltarii si maturarii.
Pe parcursul dezvoltarii embrionare modelarea celulara specifica si organogeneza sunt
asigurate de un program spatio-temporal definit genetic de proliferare si moarte celulara.
In tesuturile adulte, moartea celulara fiziologica apare de asemenea, proeminent in interiorul
tesuturilor ciclic stimulate sau dependente hormonal, cum sunt endometrul, prostata si glanda
mamara, dar si in turnoverul “stady-state” al multor alte tesuturi.
Moartea selectiva a celulelor este fundamentala pentru dezvoltarea, reglarea si functionarea
sistemului imun, incluzand eliminarea timocitelor auto-reactive, selectia negativa a limfocitelor T
si B si distrugerea celulelor realizata de limfocitele T citotoxice. Celulele ce au suferit deteriorari
genetice ireparabile sunt de asemenea, detectate de procese endogene, probabil limitandu-se astfel
diseminarea leziunilor genetice potential nocive. Limfocitele ce invadeaza tesuturi privilegiate din
punct de vedere imunologic sunt rapid eliminate, astfel protejandu-se regiunile sensibile de o
deteriorare produsa printr-un raspuns inflamator .
Conceptul unificator al tuturor acestor circumstante diverse este acela ca procesul de moarte
celulara este mediat de un set comun de evenimente si se desfasoara pe cai biochimice similare
conducand la o dispunere stereotipa a modificarilor structurale. Aceasta moarte celulara este numita
apoptoza.
Apoptoza este un proces innascut, conservat din punct de vedere evolutiv, prin care
celulele sistematic isi inactiveaza, isi dezasambleza si isi degradeaza propriile componente
structurale si functionale pentru desavarsirea propriului lor deces.
Acest proces poate fi activat intracelular printr-un program de dezvoltare definit genetic sau
extracelular prin intermediul proteinelor endogene, citokinelor si hormonilor ca si de componente
xenobiotice, radiatii, stresul oxidativ si hipoxia.
Abilitatea unei celule de a intra in apoptoza ca raspuns la un semnal de “moarte” depinde de
statusul său proliferativ, pozitia ciclului celular si de expresia controlata a genelor care promoveaza,
inhibă și afectează programul de moarte.
Reglarea stricta a acestor parametri modulatori ai mortii trebuie mentinuta pentru asigurarea
contextului fiziologic propice aparitiei apoptozei.
Disfunctiile ce apar in oricare dintre punctele caii de moarte programata, pot duce la un
proces apoptotic eronat determinand astfel la exprimarea unor conditii fiziopatologice.
Importanta apoptozei deriva din natura sa activa si din potentialul sau de a controla
sistemele biologice.
Moartea celulara a fost considerata la inceput un proces haotic. Totusi, asa cum o celula isi
poate echilibra metabolismul, penduland intre anabolic si catabolic, tot astfel un organism

1
 Biologie celulara si moleculara

multicelular trebuie sa echilibreze ratele de proliferare celulara si de moarte celulara pentru

mentinerea homeostaziei.
De asemenea, un organism trebuie sa indeparteze celulele senescente, deteriorate sau
anormale care ar putea sa interfere cu buna functionare a unui organ sau s-ar putea transforma
malign.
Ca urmare, alterarile survenite in domeniul reglarii mortii celulare ar putea contribui la
patogeneza bolilor degenerative si neoplazice. Desi moartea celulara “fiziologica” se cunoaste de
decenii, interesul pentru aceasta problema a fost reactualizat in 1972, cand Kerr, Wyllie si Currie au
descris in detaliu modificarile ultrastructurale caracteristice celulelor muribunde si au propus
termenul de apoptoza pentru descrierea acestui proces. Ei au evidentiat faptul că, moartea celulară
fiziologică nu este un proces randomic, ci are trăsături morfologice distincte.
De obicei apoptoza afecteaza celule individuale si, odata initiata, se propagă rapid.
Ingestia celulelor apoptotice de către macrofage nu induce eliberarea enzimelor proteolitice sau a
oxigenului singlet care e toxic. Fragmentarea celulelor are loc fără scurgerea continutului celular în
spațiul extracelular, iar îndepărtarea celulelor apoptotice nu provoacă un raspuns inflamator.
Absenta inflamatiei reprezintă o trăsătură crucială permițându-se astfel, moartea celulei fără
deteriorarea celulelor adiacente.

APOPTOZA VERSUS NECROZA

Moartea celulara poate fi accidentala sau programata intr-un organism multicelular.

Dovezile sprijina ipoteza existentei unui “program de sinucidere” inerent in celulele vertebratelor
care este activat atunci cand moartea celulei este dorita pentru binele restului comunitatii celulare.
In tesuturile vertebratelor s-au descris doua modele de moarte celulara cu morfologie
distincta: apoptoza si necroza , insa mecanismele lor la nivel molecular nu sunt inca complet
intelese.
Necroza poate fi descrisa ca si colapsul metabolic celular si apare cand celula nu-si mai
poate mentine homeostazia ionica. Pe masura ce nivelurile de ATP se epuizeaza si gradientul ionic
transmembranar se disipa, celulele se umfla si organitele intracelulare se dilata.
Initial se observa inmuguriri reversibile ale membranei, modificari timpurii in conformatia si
functia mitocondriilor si celula devine rapid incapabila de a mentine homeostazia. Depasind un
prag, procesul devinde ireversibil.
Membrana celulara poate deveni situsul major al alterarilor pierzandu-si astfel capacitatea
de reglare a presiunii osmotice, celula se umfla si crapa.
Deteriorarile membranelor interne permit eliberarea enzimelor lizozomale, continutul celulei
este imprastiat in spatiul tisular inconjurator si provoaca un raspuns inflamator nespecific.
Necroza este indusa tipic de modificari extreme in mediul inconjurator al celulei, ce
determina leziuni severe si bruste, provocate de exemplu de ischemie, hipertermie mentinuta sau
traume fizice sau chimice. Se presupune ca necroza nu este influentata genetic.

2
 Biologie celulara si moleculara

Figura 1. Ilustrarea secventei de modificari ultrastructurale care au loc in apoptoza (2-6) si necroza
(7 si (1)Celula normala. Apoptoza timpurie (2) se caracterizeaza prin compactarea si
marginalizarea cromatinei, condensarea citoplasmei si plierea membranelor, nucleara si plasmatica
(3). In ultima etapa, nucleul se fragmenteaza si protuberantele formate pe suprafata celulei se separa
pentru a forma corpii apoptotici, care (4), sunt fagocitati de celulele vecine si (5 si 6) degradate in
lizozomi (7). Necroza este asociata cu gruparea neregulata a cromatinei, umflarea organitelor si
distrugerea focala a membranelor (8). Apoi membranele se dezintegreaza dar, in general, celula isi
mentine intreaga conformatie pana la indepartarea ei de catre fagocitele mononucleare.
Apoptoza este o forma de moarte celulara in care procesul este mult mai subtil. Este adesea
echivalata cu moartea celulara programata, dar este bine sa mentinem cele doua concepte distincte -
cel morfologic si cel escatologic.
Apoptoza se refera la o serie de modificari morfologice pe parcursul procesului de moarte
celulara, modificari diferite de cele observate in necroza, fiind asociata cu procesul normal de
reglare a tesuturilor (fig. 1).
La vertebrate, moartea celulara este acceptata ca un proces obisnuit si chiar accentuat
previzibil, dar “programarea” ei nu se face in sensul acceptat la nevertebrate, ca o moarte a
celulelor individuale, care in anumite cazuri poate fi apreciata, cu mare acuratete, ca fiind
programata.
In ultima vreme suntem fortati sa acceptam observatia, aparent paradoxala, ca moartea
celulara este atat programata cat si stohastica. De exemplu, pe parcursul dezvoltarii populatiilor de
celule B, aproximativ 95 % din celule vor muri dintr-unul dintr-o varietate de motive (rearanjament
genic imperfect sau absenta stimularii) dar este imposibil de prevazut dinainte care dintre ele se va
produce.
Apoptoza apare in celule individuale dispersate, nu in grupuri de celule invecinate, asa cum
se intampla in necroza.

3
 Biologie celulara si moleculara

Se pare ca apoptoza prezinta cea mai comuna morfologie atunci cand moartea celulara este
determinata fiziologic. Referindu-ne la mamifere, exemplele includ moartea celulelor cu perioada
de injumatatire scurta (neutrofile); eliminarea celulelor T autoreactive; involutia celulelor lipsite de
factorii de crestere necesari; moartea morfologica a celulelor pe parcursul evolutiei embrionare si
postembrionare timpurii; si omorarea celulelor care servesc drept tinte celulelor T, celulelor natural
ucigase (NK), sau mecanisme citotoxice mediate celular dependente de anticorpi.
Motivul pentru care celulele trebuie sa moara este diferit de la un tip celular la altul la fel si
mecanismul de declansare. Deseori semnalul de sinucidere provine din mediul inconjurator, ca in
expunerea la sau retragerea dintr-un mediu cu hormoni sau factori de crestere.
Acest aspect este incitant din punct de vedere conceptual, atata vreme cat se traduce prin
faptul ca soarta unei celule este dependenta de activitatea alteia; chiar daca moartea este
programata, locusul programului este in afara celulei care trebuie sa moara.
In alte cazuri, de exemplu turnoverul neutrofilelor, se pare ca celula are un ceas intern
autonom care ar controla programul de moarte a celulei (adevaratul program de moarte celulara
autonom a fost identificat la nematode si genele ce controleaza acest proces au fost elucidate.
Caile de activare a apoptozei vor fi diferite in diferite celule, dar mecanismul de moarte in
sine va fi mereu acelasi, ceea ce inseamna ca exista o cale finala comuna. Este foarte important ca
in studiul apoptozei sa incercam sa facem distinctia dintre procesele care sunt specifice celulei de
cele care sunt specifice mortii.
Se pare ca exista multe mecanisme declansatoare ale cailor de sinucidere, chiar si intr-un
singur tip de celula. Nu toate acestea vor fi recunoscute imediat ca fiind “programate”.
De exemplu, pentru a activa calea apoptotica, timocitele pot fi semnalizate de catre
glucocorticoizi sau de o cross-linkare a receptorului pentru antigen, in acest caz, ambii stimuli fiind
considerati fiziologici. Dar, timocitele vor suferi un proces apoptotic identic dupa expunerea la o
doza mica de radiatii ionizante sau la o otrava. Deoarece nici unul dintre acesti agenti nu este
fiziologic, in acest caz moartea celulelor nu poate fi strict definita ca fiind programata.
Totusi definitia poate fi largita in sensul ca in anumite celule, cand sunt deteriorate nespecific,
se poate activa fiziologic o “moarte programata”. Aceasta presupune ca deteriorarea sa nu fie foarte
severa pentru ca programul sa poata fi exprimat: daca timocitele sunt mentinute la 43ºC vor muri
prin necroza, dar daca se revine, suficient de rapid, la o temperatura de 37ºC, vor muri prin
apoptoza.
S-a sugerat ca, ar fi prea periculos pentru limfocite sa incerce repararea unor astfel de tipuri
de leziuni, atata vreme cat o reparare imperfecta ar putea duce la instalarea autoimunitatii sau a
leucemiei in astfel de cazuri celulele activandu-si mecanismul apoptotic.

FAZELE PROCESULUI APOPTOTIC

Controlul general al numarului de celule ce se efectueaza prin intermediul ciclului celular

este compus dintr-un sistem multicompartimentat in interiorul caruia celula are cel putin 3 optiuni
posibile (fig.2).

4
 Biologie celulara si moleculara

Celula poate fi:

1) metabolic activa dar nu desfasoara nici procesul de proliferare si nici cel de apoptoza
(celula aflata in faza G0);
2) in curs de desfasurare a procesului de proliferare (G0→G1→S→G2→mitoza)
3) pe punctul de a desfasura procesul de moarte celulara fie pe calea programata
(G0→D1→F→D2→fragmentare celulara apoptotica), fie pe calea neprogramata (necroza)

Figura 2. Schema desfasurarii ciclului celular care arata optiunile unei celule aflate in faza G0. D1
defineste perioada pe parcursul careia se activeaza noi gene a caror expresie proteica este ceruta
pentru inducerea fragmentarii ADN (faza F).
D2 defineste perioada insasi celula se fragmenteaza in corpi apoptotici.
Celulele pot fi induse sa intre pe calea mortii celulare programate din orice faza a ciclului celular de
proliferare (G1, S sau G2).
Semnalele locale sau sistemice ale factorilor de crestere ce regleaza progresia in interiorul
ciclului celular sunt specifice tipului celular si sunt independent determinate ca parte a fenotipului
de diferentiere a celulei in cauza.
Astfel, acelasi factor de crestere (ex: factorul transformant de crestere – β1) poate avea efecte
agoniste sau antagoniste in cadrul ciclului celular al diferitelor tipuri de celule (ex: inductor al
proliferarii celulare in celulele mezenchimale sau inductor al arestului in G0 sau progresia prin
fazele apoptozei pentru celulele epiteliale).
Procesul apoptotic poate fi impartit in trei etape distincte:
- angajarea, in care celula care a primit un stimul apoptotic letal devine ireversibil angajata
pe calea mortii;
- executarea, pe parcursul careia apar majoritatea modificarilor structurale;
-clearance-ul, in cadrul caruia resturile celulare sunt indepartate prin fagocitoza.
Modificarile structurale ce apar pe parcursul fazei executorii au fost descrise pentru prima data de

5
 Biologie celulara si moleculara

Kerr si colaboratorii, iar acum sunt din ce in ce mai bine intelese din punct de vedere al
mecanismului.

MORFOLOGIA APOPTOZEI

Pe parcursul fazei de executie, apar modificari morfologice si biochimice coordonate in

interiorul nucleului, citoplasmei, organitelor si membranei plasmatice. Modificarile morfologice
care se observa cel mai usor sunt cele care apar in interiorul nucleului.
Cromatina condenseaza si formeaza agregate de-a lungul periferiei nucleare relevand un
model conformational semilunar. Caracterizarea morfologica a cromatinei demonstreaza o
degradare ordonata a ADN-ului de catre o nucleaza endogena dependenta de cation, intai in
fragmente mari de 30-50 kilobaze pana la fragmente nucleozomale de 180-200 perechi de baze.
Totusi, clivarea cromatinei la fragmente nucleozomale nu are loc in toate tipurile celulare si
poate fi inhibata fara a bloca celelalte modificari ale apoptozei. Odata cu condensarea cromatinei
este alterata ultrastructura nucleara. Lamina nucleara si reteaua de filamente intermediare care
mentine integritatea anvelopei nucleare si distributia porilor nucleari sunt clivate proteolitic. Astfel,
distrugerea structurii retelei nucleare ar putea permite alaturarea porilor nucleari si faramitarea
nucleului in fragmente ce contin cromatina, care, majoritatea mentin vestigii ale membranei
nucleare.
Celelalte organite citoplasmatice raman intacte din punct de vedere structural cu toate ca
disfunctiile mitocondriale sunt asociate cu apoptoza (figura 3).
Modificarile nucleare sunt precedate de reducerea potentialului transmembranar mitocondrial,
necuplarea transportului de electroni de la sinteza ATP-ului si cresterea generarii de specii reactive
de oxigen.

In citoplasma apare cross-linkarea de proteine prin actiunea transglutaminazelor, filamentele

citoscheletale se agrega in formatiuni paralele si reticulul endoplasmic se dilata si fuzioneaza cu
membrana plasmatica creand cratere in forma de sac la nivelul fuziunii.
In apoptoza, membrana celulara se umfla si se cuteaza intr-o masura mult mai mare decat in
necroza, fenomenul a fost numit zeioza. Integritatea structurala a membranei este ulterior
compromisa prin pierderea asimetriei fosfolipidice, a microvililor si a jonctiunilor intercelulare.
Celula se sfericizeaza, se indeparteaza de vecinii sai si se contracta dramatic si expulzeaza
protuberante care se separa in “corpi apoptotici” inveliti in membrana.
In interiorul tesuturilor, celulele apoptotice si corpii apoptotici sunt recunoscuti si fagocitati
rapid de catre celulele vecine sau macrofage.

6
 Biologie celulara si moleculara

Figura 3. Stadiile apoptozei intr-un limfocit. Aceste stadii sunt observate mai bine in culturi izolate
atata vreme cat in vivo ar interveni fagocitoza: (a) Celula normala are o citoplasma dispersata si
cromatina nucleara heterogena. Volumul celulei e de aproximativ 90 fL. (b) Celula a pierdut o parte
din volum si organitele citoplasmatice sunt strans impachetate, se observa ingramadiri ale
cromatinei. In acest stadiu sunt prezente modificarile membranare care duc la fagocitoza. (c) Celula
etaleaza zeioza. (d) Colapsul cromatinei cu aranjarea ei in forma de semiluna de-a lungul anvelopei
nucleare. Volumul celular este acum de 70 fL. (e) Nucleul are acum aspectul unei gauri negre. (f)
Nucleul se fragmenteaza in sfere, iar membrana se cuteaza vormand vezicule. (g) Fragmentele
celulare continute in corpii apoptotici care, pentru o vreme, continua sa excluda colorantul vital.

Recunoasterea celulelor apoptotice de catre fagocite poate implica interactii ale lectinelor
macrofagelor endogene cu resturi zaharidice N-acetil specifice exprimate pe suprafata celulelor
apoptotice, interactiile specific mediate de receptori cu fosfatidilserina din stratul exterior al
membranei plasmatice si interactiile trombospondina/receptori de suprafata celulara, ce contin
resturi incomplet caracterizate, de pe suprafata celulelor apoptotice.
Exista evidente ce sugereaza ca mecanismul de recunoastere poate fi diferit in functie de
populatia de fagocite. Semnificativ pentru strategia centrala a acestui tip de moarte celulara este
clerance-ul rapid si eficient al resturilor apoptotice de catre fagocitele vecine, amatoare sau
profesioniste, deoarece previne raspunsul inflamator care, altminteri, ar urma calea distrugerii
celulare si deversarea proteinelor intracelulare si a acizilor nucleici in spatiul extracelular.
Odata ce faza de executie a apoptozei este activata, intregul proces demareaza rapid si este
complet terminat in cateva ore. Durata acestei faze este relativ invariabil in raport cu tipul celular si
stimulul apoptotic sugerand ca stadiul final al apoptozei trece printr-o cale comuna. Totusi, stadiul
de angajare, timpul de la receptarea stimulului apoptotic pana la initierea fazei ireversibile de
executie este extrem de variabil si depinde de tipul celular, de stimulul apoptotic, de situarea in
cadrul ciclului celular si de expresia diversilor factori modulatori ai mortii.
Multi factori care influenteaza angajarea sau susceptibilitatea celulara la apoptoza sunt
implicati direct in receptia si transmiterea semnalului apoptotic. Acesti factori reglatori sunt

7
 Biologie celulara si moleculara

frecvent selectati pentru a bloca procesul pe parcursul transformarii neoplazice sau dezvoltarii
rezistentei la medicamente si sunt subiectul modificarii virale.
Perioada de fragmentare a ADN (figura 2, faza F) poate fi utilizata pentru dividerea in serii
temporale a evenimentelor implicate in apoptoza mai mult decat perioada sintezei de ADN (figura
2, faza S) ce este utilizata pentru impartirea ciclului celular proliferativ.
Pe parcursul fazei D1 apoptotice, celula sufera o reprogramare genetica, proces pe parcursul
caruia gene care erau normal exprimate acum sunt supresate si invers. Aceste modificari
epigenetice au ca rezultat fragmentarea dublu catenara a ADN pe parcursul fazei F. Pe parcursul
acestei faze F morfologia nucleara se schimba (marginalizarea nucleara a cromatinei urmata de
condensarea nucleara si eventual de fragmentarea nucleului insusi), cu toate ca membranele
plasmatica si lizozomala sunt inca intacte si mitocondria inca functionala. Pe parcursul urmatoarei
faze, portiunea D2, apare inmugurirea membranei si eventual fragmentarea.

BIOCHIMIA APOPTOZEI

Celulele care sufera apoptoza, se contracta considerabil, iar electrono-micrografiile

evidentiaza o citoplasma extrem de condensata cu organite ce par a fi normale. Cea mai plauzibila
explicatie ar fi aceea ca celula a pierdut apa si, cum nu se evidentiaza o umflare imediata, probabil a
pierdut ioni izoosmotic.
De asemenea, nu au fost descrise leziuni specifice ale organitelor citoplasmatice, sau ele nu
au fost cautate intr-un mod adecvat. A fost observata umflarea cisternelor reticului endoplasmic.
Biochimic, in celula are loc reducerea sintezei de ARN si proteine urmata de degradarea lor, dar
sincronizarea acestor evenimente in raport cu modificarile morfologice nu este inca bine
caracterizata.
Totusi, initial s-a crezut ca tranzitia de la normal la contractarea apoptotica se realizeaza atat
de rapid incat nu poate fi observata o stare intermediara, citometria in flux poate ajuta la
caracterizarea modificarii si in combinatie cu sortarea celulara poate inlesni o patrundere mai
profunda in ordinea evenimentelor.
Desi apoptoza este un proces opus necrozei, reprezentand calea fiziologica de moarte
celulara, poate fi de asemenea provocata de stimuli patologici. In general, orice stimul ce produce
necroza prin distrugere celulara directa poate induce apoptoza, in cazul in care celula initial
supravietuieste. In acest sens, apoptoza reprezinta un raspuns celular coordonat la stimuli
vatamatori care nu sunt imediat letali.
Nu se poate vorbi de o serie invariabila de evenimente metabolice ce au loc in cursul
apoptozei. Totusi, timpuriu, in apoptoza, in multe tipuri celulare apare o crestere sustinuta a
nivelului de calciu ionizat citosolic.
Calciul, poate activa latent enzime care contribuie la modificarile structurale din cursul
apoptozei. Aceste enzime includ o endonucleaza nucleara calciu dependenta care cliveaza
invariabil ADN si o transglutaminaza care crosslinkeaza proteine citosolice. Proteazele calciu
dependente (calpaina) degradeaza citoscheletul (figura 4).
In general, procesul apoptotic are nevoie de energie sub forma de ATP, reclama sinteza activa
a ARN si proteina depinde de tipul celular si stimulul apoptotic. In limfocitele mature, agentii care
inhiba ARN-ul sau sinteza proteica in general duc la blocarea apoptozei; din contra, in neutrofilele
imature si in unele linii celulare leucemice, aceeasi compusi amplifica apoptoza.

8
 Biologie celulara si moleculara

Una din explicatiile acestei contradictii este ca majoritatea celulelor contin proteine reglatoare
care pot inhiba sau promova moartea celulara fiziologica. Intr-un tip particular celular, comparand
ratele catabolice ale inhibitorilor si promotorilor se poate determina daca sistarea sintezei de ARN
si celei proteice previne sau induce apoptoza.

Figura 4. Evenimente metabolice ce au loc in apoptoza.

In celulele destinate sa sufere apoptoza creste mRNA pentru β-tubulina inainte de aparitia
modificarilor morfologice si a clivajului DNA. Intr-o etapa ulterioara, apar si in citoplasma cantitati
crescute de β -tubulina. Probabil ca, genele pentru β-tubulina sunt degradate impreuna cu restul
DNA-ului nuclear indata ce endonucleaza devine activa. Agentii care interfera cu polimerizarea
actinei, cum ar fi citocalasina B, s-a aratat ca previn inmugurirea celulara ce duce la formarea
corpilor apoptotici fara a bloca fragmentarea nucleului sau clivajul DNA.

ACTIVITATEA ENDONUCLEAZICA, STRUCTURA CROMATINEI SI DEGRADAREA ADN

IN APOPTOZA

Nucleul este locul producerii majoritatii modificarilor dramatice ce au loc in apoptoza.

Modificarile sunt studiate mai bine cu ajutorul microscopiei electronice de transmisie (figura 5), dar
au fost deja vizualizate in celule vii in urma utilizarii colorantilor fluorescenti cum sunt acridin
oranjul sau Hoechst 33342. Modelul modificarilor difera de la un tip celular la altul dar, in general,

9
 Biologie celulara si moleculara

nucleul se contracta si cromatina devine foarte densa, se fragmenteaza si, in final se leaga strans de
anvelopa nucleara.
Aceasta modificare este adesea acompaniata de fragmentarea ADN in subunitati regulate ce
formeaza o “scara” ca rezultat al ruperii dublu catenare, aparent randomice la nivelul regiunilor
linker dintre miezurile nucleozomale. In fiecare celula exista peste un milion de astfel de rupturi
ceea ce releva o situatie imposibil de reparat si ca urmare are loc sistarea transcriptiei.
In ultimii ani a existat o controversa cu privire la dimensiunile fragmentelor de ADN,
produse pe parcursul apoptozei, responsabile de angajamentul ireversibil pe calea mortii celulare.

Figura 5. Modificarile structurale ale celulei pe parcursul apoptozei. Imaginea superioara reprezinta
o celula normala. Imaginea inferioara reprezinta o celula in cursul procesului de apoptoza; sagetile
indica fragmente de cromatina condensate

Exista o serie de rapoarte ce precizeaza ca atunci cand celula intra in apoptoza ADN-ul
genomic este degradat in fragmente mici nucleozomale (repetari de cate 200 pb). Totusi au existat
rapoarte ce sustineau ca celulele pot intra in apoptoza pe criterii morfologice fara producerea
“scarii” de ADN nucleozomal .
O serie de investigatii au sugerat ca proteinele responsabile de fragmentarea letala a ADN in
apoptoza sunt endonucleaze de tip DNaza I care, pentru activare, depind de calciu (Ca 2+). De
asemenea, intr-o serie de tipuri celulare, in care a fost indusa apoptoza sub diferite forme, s-a
demonstrat elevarea sustinuta a nivelului de ioni liberi de calciu intracelular (Cai) care s-a sugerat
ca ar fi necesari pentru activarea endonucleazelor de aproximativ 23 kD. Celulele raspund la o
crestere a Cai prin pomparea calciului in interiorul unei organite intracelulare sau in afara celulei
prin membrana citoplasmatica.
Astfel de transport de Ca2+ este catalizat de schimbul membranar de Na2+ - Ca2+ si de
proteinele ATP-aze Ca2+. Deoarece ATP-aze Ca2+cere un proton pentru transportul vectorial al Ca2+
in afara celulei un astfel de transport ar putea acidifia celula daca nu ar fi imediat tamponat sau
transportat in afara celulei.
Totusi, utilizand chelatori ai Ca2+ intracelular s-a observat ca pentru degradarea ADN de
masa moleculara mare sunt de asemenea, necesare cantitati nanomolare de calciu, complicand astfel

10
 Biologie celulara si moleculara

explicatia fenomenului de clivare. De asemenea. s-a observat ca fragmentarea internucleozomala de

ADN poate fi blocata de catre zinc, cunoscut inhibitor al endonucleazelor Ca2+ si Mg2+ dependente .
Luand in considerare toate aceste date se poate spune ca fragmentarea endogena a ADN pe
parcursul apoptozei se produce in 3 etape (fig. 6). Prima etapa incepe cu activarea unei
endonucleaze legata constitutiv de o clasa de SAR (regiuni de atasare a matricei si citoscheletului)
bogate in legaturi A-T, care ataseaza domenii mari ale cromozomului la matricea nucleara.
Concentratia nucleara endogena de Mg2+ este suficienta pentru activitatea ei. Nu este nici o cerinta
de Ca2+ atat timp cat ADN este monocatenar.
S-au evidentiat astfel o serie de fragmente monocatenare de ADN pe parcursul procesului de
apoptoza. A doua etapa implica propagarea acestei degradari la alte clase de SAR. Aceasta
propagare are o dependenta de Ca2+ sugerand ca situsurile si-au imbogatit compozitia in C-G si
toata cromatina este redusa la fragmente de ~ 300 kb.
In etapa a treia se cliveaza ADN internucleozomal la regiunile linker din interiorul “buclelor”
si genereaza “scara” ADN. Aceasta clivare este relativ independenta de secventa (in termeni legati
de situsurile ce leaga nucleaza) dar necesita Ca2+ pentru cinetica.
De asemenea, aceasta etapa necesita proteoliza. Factorii aditionali implicati in aceasta etapa
ar putea realiza extensia finala a fragmentarii ADN ce difera mult de la un tip celular la altul.
ADN-ul mitocondrial nu sufera fragmentare. Se presupune ca aceasta clivare a ADN-ului
nuclear, intr-o etapa timpurie a procesului, poate avea un rol protector prin evitarea transferului de
material genetic potential activ celulelor vecine dupa fagocitarea corpilor apoptotici . Exista si
tipuri celulare in care apoptoza tipica, care include modificarile nucleare, este observata
microscopic ca fiind lipsita de clivajul nucleozomilor ADN.
Totusi, in putinele sisteme in care a fost studiata, au fost observate anumite forme de
deteriorare a ADN (ruptura monocatenara extinsa, rare fragmentari dublu-catenare), necesare
modificarilor morfologice profunde. Nu exista un consens privind rolul pe care il joaca
fragmentarea ADN ce are loc inaintea mortii celulare.
Desi transcriptia este oprita, ea insasi nu este atat de rapid letala precum este apoptoza, ceea
ce inseamna ca sunt implicate si alte procese. S-a constatat faptul ca acidul aurin tricarboxilic, care
inhiba nucleaza, este un inhibitor al tuturor aspectelor legate de apoptoza; dar este incorect sa
concluzionam ca, prin urmare, distrugera ADN este pasul critic in procesul apoptozei, atata vreme
cat aurinul inhiba multe alte reactii metabolice celulare.

MODIFICARILE MEMBRANEI PLASMATICE

Fagocitarea rapida a corpilor apoptotici de catre celulele adiacente, cat timp membranele lor
celulare sunt intacte (pentru prevenirea inflamatiei si lezarii tesuturilor in care se formeaza, in
special cand procesul apare in conditii fiziologice) implica operarea unui mecanism de recunoastere
foarte specific si exista dovezi care sustin existenta mai multor astfel de mecanisme.
In mod normal, fosfolipidele membranei plasmatice sunt distribuite asimetric. Lipidele ce
contin colina, cum ar fi fosfatidilcolina (FC) si sfingomielina sunt concentrate pe fata externa a
membranei plasmatice in timp ce aminofosfolipidele cum sunt fosfatidiletanolamina (FEA) si
fosfatidilserina (FS) abunda pe fata interna a membranei plasmatice. Dintre toate fosfatidilserina
(FS) este restrictata in majoritatea celulelor exclusiv la fata interna a membrane.

11
 Biologie celulara si moleculara

Pierderea asimetriei fosfolipidice si expunerea FS a fost prima oara demonstrata pentru

limfocite, dar aceasta descoperire a fost confirmata intr-o serie de tipuri celulare.
Externalizarea FS este rapida sugerand mai degraba un transport facilitat decat o difuzie pasiva a
lipidelor prin bistrat. Aceasta activitate se presupune ca este mediata de o proteina enzimatica
activata de calciu, ATP independenta si nespecifica din punct de vedere al fosfolipidelor
transportate .
Din punct de vedere biologic, expunerea FS la suprafata e considerata a fi un ligand pentru
inlaturarea rapida a celulelor ce-l exprima. O alta consecinta biologica este legata de faptul ca FS
serveste drept cofactor pentru cascada de coagulare domeniu in care datele incep sa se contureze
sugerand ca FS poate avea o serie de efecte anti-inflamatoare sau imunosupresive.

CAILE DECLANSARII APOPTOZEI

1. Extrinseci- consta in activarea unor receptori pro-apoptotici. Substantele care se leaga la

acestia se numesc liganzi apoptotici si cunt de tipul: Apo2L/TRAIL, CD95/FasL. Acestia
construiesc receptorii de recunoastere de tipul: DR4/DR5 și CD95/Fas.

12
 Biologie celulara si moleculara

Fig. 6

2. Intrinseci-sunt mecanisme declansate ca si raspuns la distrugerea ADN, dereglarea ciclului

cellular, detasarea de matricea extracelulara, hypoxia celulara si alti factori de stress.
Acesta cale dezvolta sinteza de protein pro-apoptotice care activeaza enzimele caspase din
mitocondrii.
Proteinele pro-apoptotice sunt reglate de catre permeabilitatea membranei mitocondriene.
Mitocondriile elibereaza citocrom c, care se asociaza cu un adaptor apoptotic (Apaf-1=protease
activating factor 1). Acesta asociere permite formarea unui complex multiproteic numit
apoptosome (cu rol de reglare enzimatica a caspasone 9). Initiatorul caspasone 9 se afla in
interiorul complexului multiproteic apoptosome.

Fig. 7 Apoptosome

3- Cascadele de caspase –joaca un rol vital in inductia, transductia, amplificarea si

realizarea semnalelor apoptice. Caspase sunt un grup de enzime –cysteine care sub actiunea
factorilor externi si interni distrug proteinele esentiale din celula.

13
 Biologie celulara si moleculara

Fig. 8

Fig. 9

Bcl-2=Pro-apoptotic proteins
SMAC/DIABLO =pro-apoptotic protein
IAPs= inhibitors of apoptosis proteins

Caspasele potr fi de 2 tipuri: initiatori și efectori. Initiatorii se afla in apoptosome.

Enzimele caspase intervin în: distrugerea ADN, distrugerea laminei, a proteinelor
citoscheletului (miozina, actina, α-actinina, tubulina, vimentina) și proteinele aparatului Golgi

14
 Biologie celulara si moleculara

RECUNOASTEREA SI INLATURAREA CELULELOR APOPTOTICE

Evenimentul final, comun pentru majoritatea celulelor apoptotice este reprezentat de

recunoasterea si indepartarea lor de catre fagocite. Celulele apoptotice sunt indepartate inaintea lizei
lor, acest eveniment sugerand ca ele exprima modificari specifice pe suprafata ce semnalizeaza
fagocitelor legarea si inglobarea lor.
Aceste fagocite pot fi profesioniste (macrofagele) sau amatoare (fibroblaste, celule epiteliale
si celule musculare netede din peretii vaselor de sange). Pana acum au fost descrisi mai multi
receptori pe macrofage si alte celule ce leaga celulele apoptotice si mediaza inglobarea lor. Acestia
sunt reprezentati de receptori lectin-like, receptorul pentru vitronectine αvβ3 , CD36, receptorul de
recunoastere al fosfatidilserinei, inca necaracterizat, CD14 si receptori scavanger.
De curand, s-a demonstrat ca transportorul ABC1, de asemenea implicat in inglobarea
celulelor mamaliene apoptotice, mediaza transportul anionic fiind omolog genei ced-7 asociata cu
fagocitoza corpilor apoptotici in C. elegans.
Mecanismul prin care acesti receptori mediaza fagocitoza celulelor apoptotice nu este
cunoscut, iar liganzii acestor receptori nu sunt inca bine caracterizati. Cu toate acestea comun
multor celule ramane expunerea fosfatidilserinei pe fata externa a membranei plasmatice, acest
fosfolipid parand a fi recunoscut intr-o maniera stereospecifica de catre subseturi de macrofage, de
catre celule melanoma, de celule musculare netede din peretii vaselor de sange si de celule Sertoli.
In mod normal, fosfolipidele de membrana sunt distribuite asimetric.
Macrofagele sunt “fagocite profesioniste” ce indeparteaza celulele si corpii apoptotici, dar la acest
proces pot participa si alte tipuri celulare, ca de exemplu celule epiteliale si tumorale ce pot ingloba
celule apoptotice vecine. In timpul inglobarii celulelor apoptotice, macrofagele nu elibereaza agenti
de tipul eicosanoizilor si citokinelor.
Lipsa acestui raspuns pare a fi determinata de mecanismul prin care celulele apoptotice sunt
ingerate, dat fiind ca celulele apoptotice, opsonizate pentru a putea fi preluate de receptorii Fc ai
macrofagelor, induc, de exemplu, eliberarea de tromboxan. Totusi, daca celulele apoptotice nu sunt
preluate de catre macrofage, ele se umfla si se dezintegreaza eliberandu-si continutul.
Daca ar avea loc un astfel de eveniment pe parcursul clearance-ului neutrofilelor din situsurile
inflamate, eliberarea continutului granulelor citoplasmatice ar avea consecinte nefaste. Mai mult
decat atat, evadarea nedorita a materialului nuclear din leucocitele moarte, poate fi de asemenea
periculoasa, nucleozomii eliberati din limfocitele apoptotice neingerate pot stimula sinteza de ADN
si imunoglobuline in limfocitele viabile.
Prin urmare, este posibil ca dezintegrarea limfocitelor apoptotice (presupus neingerate) sa
constituie o sursa de ADN nucleozomal circulant, observat de altfel la anumiti pacientii cu lupus
sistemic eritematos, contribuind la stimularea policlonala a celulelor B tipica pentru aceasta
afectiune autoimuna si tintind autoanticorpi catre paturile vasculare, cum ar fi glomerulii renali, in
care componentele nucleozomale circulante s-ar putea lega .
Exista mai multe mecanisme posibile de recunoastere a celulelor apoptotice de catre fagocite
si de asemenea, mai multe statusuri tinta etalate de celulele apoptotice.

15