Apoptoza. Implicatii in patologia maligna 1.

Introducere
Moartea celulara fiziologica este esentiala pentru dezvoltarea si functionarea normala a organismelor multicelulare. Celulele non-necesare, deteriorate si potential nocive trebuie inlaturate din microclimatul celular sanatos pentru asigurarea homeostaziei structurale si functionale a tesutului. Exemple ale mortii celulare fiziologice au fost observate la aproape toate tipurile celulare pe parcursul dezvoltarii si maturarii. Conceptul unificator al tuturor acestor circumstante diverse este acela ca procesul de moarte celulara este mediat de un set comun de evenimente si se desfasoara pe cai biochimice similare conducand la o dispunere stereotipa a modificarilor structurale. Aceasta moarte celulara este numita apoptoza. Importanta apoptozei deriva din natura sa activa si din potentialul sau de a controla sistemele biologice. Ingestia celulelor apoptotice de catre macrofage nu induce eliberarea enzimelor proteolitice sau a oxigenului singlet care e toxic. Fragmentarea celulelor are loc fara scurgerea continutului celular in spatiul extracelular, iar indepartarea celulelor apoptotice nu provoaca un raspuns inflamator.

2. Apoptoza versus necroza

Moartea celulara poate fi accidentala sau programata intr-un organism multicelular. In tesuturile vertebratelor s-au descris doua modele de moarte celulara cu morfologie distincta: apoptoza si necroza ,insa mecanismele lor la nivel molecular nu sunt inca complet intelese. NECROZA poate fi descrisa ca si colapsul metabolic celular si apare cand celula nu-si mai poate mentine homeostazia ionica. Pe masura ce nivelurile de ATP se epuizeaza si gradientul ionic transmembranar se disipa, celulele se umfla si organitele intracelulare se dilata. Necroza este indusa tipic de modificari extreme in mediul inconjurator al celulei, ce determina leziuni severe si bruste, provocate de exemplu de ischemie, hipertermie mentinuta sau traume fizice sau chimice. Se presupune ca necroza nu este influentata genetic, (figura 1).

Figura 1. Ilustrarea secventei de modificari ultrastructurale care au loc in apoptoza (2-6) si necroza (7 si 8). (1)Celula normala. Apoptoza timpurie (2) se caracterizeaza prin compactarea si marginalizarea cromatinei, condensarea citoplasmei si plierea membranelor, nucleara si plasmatica (3). In ultima etapa, nucleul se fragmenteaza si protuberantele formate pe suprafata celulei se separa pentru a forma corpii apoptotici, care (4), sunt fagocitati de celulele vecine si (5 si 6) degradate in lizozomi (7). Necroza este asociata cu gruparea neregulata a cromatinei, umflarea organitelor si distrugerea focala a membranelor (8). Apoi membranele se dezintegreaza dar, in general, celula isi mentine intreaga conformatie pana la indepartarea ei de catre fagocitele mononucleare.

APOPTOZA este o forma de moarte celulara in care procesul este mult mai subtil. Este adesea echivalata cu moartea celulara programata, dar este bine sa mentinem cele doua concepte distincte - cel morfologic si cel escatologic. Apoptoza se refera la o serie de modificari morfologice pe parcursul procesului de moarte celulara, modificari diferite de cele observate in necroza, fiind asociata cu procesul normal de reglare a tesuturilor (fig. 1).

3. Fazele procesului apoptotic

Controlul general al numarului de celule ce se efectueaza prin intermediul ciclului celular este compus dintr-un sistem multicompartimentat in interiorul caruia celula are cel putin 3 optiuni posibile (fig.2). Celula poate fi: 1) metabolic activa dar nu desfasoara nici procesul de proliferare si nici cel de apoptoza (celula aflata in faza G0); 2) in curs de desfasurare a procesului de proliferare (G0G1SG2mitoza) 3) pe punctul de a desfasura procesul de moarte celulara fie pe calea programata (G0D1FD2fragmentare celulara apoptotica), fie pe calea neprogramata (necroza) (figura 2).

Figura 2. Schema desfasurarii ciclului celular care arata optiunile unei celule aflate in faza G0. D1 defineste perioada pe parcursul careia se activeaza noi gene a caror expresie proteica este ceruta pentru inducerea fragmentarii ADN (faza F). D 2 defineste perioada insasi celula se fragmenteaza in corpi apoptotici.

Procesul apoptotic poate fi impartit in trei etape distincte: - angajarea, in care celula care a primit un stimul apoptotic letal devine ireversibil angajata pe calea mortii; - executarea, pe parcursul careia apar majoritatea modificarilor structurale; - clearance-ul, in cadrul caruia resturile celulare sunt indepartate prin fagocitoza.

4. Morfologia apoptozei
Pe parcursul fazei de executie, apar modificari morfologice si biochimice coordonate in interiorul nucleului, citoplasmei, organitelor si membranei plasmatice. Modificarile morfologice care se observa cel mai usor sunt cele care apar in interiorul nucleului. Cromatina condenseaza si formeaza agregate de-a lungul periferiei nucleare relevand un model conformational semilunar. Caracterizarea morfologica a cromatinei demonstreaza o degradare ordonata a ADN-ului de catre o nucleaza endogena dependenta de cation , intai in fragmente mari de 30-50 kilobaze pana la fragmente nucleozomale de 180-200 perechi de baze . Celelalte organite citoplasmatice raman intacte din punct de vedere structural cu toate ca difunctiile mitocondriale sunt asociate cu apoptoza (figura 3).

Figura 3. Stadiile apoptozei intr-un limfocit. Aceste stadii sunt observate mai bine in culturi izolate atata vreme cat in vivo ar interveni fagocitoza: (a) Celula normala are o citoplasma dispersata si cromatina nucleara heterogena. Volumul celulei e de aproximativ 90 fL. (b) Celula a pierdut o parte din volum si organitele citoplasmatice sunt strans impachetate, se observa ingramadiri ale cromatinei. In acest stadiu sunt prezente modificarile membranare care duc la fagocitoza. (c) Celula etaleaza zeioza. (d) Colapsul cromatinei cu aranjarea ei in forma de semiluna de-a lungul anvelopei nucleare. Volumul celular este acum de 70 fL. (e) Nucleul are acum aspectul unei gauri negre. (f) Nucleul se fragmenteaza in sfere, iar membrana se cuteaza vormand vezicule. (g) Fragmentele celulare continute in corpii apoptotici care, pentru o vreme, continua sa excluda colorantul vital.

5. Biochimia apoptozei
Celulele care sufera apoptoza, se contracta considerabil, iar electrono-micrografiile evidentiaza o citoplasma extrem de condensata cu organite ce par a fi normale. Cea mai plauzibila explicatie ar fi aceea ca celula a pierdut apa si, cum nu se evidentiaza o umflare imediata, probabil a pierdut ioni izoosmotic. De asemenea, nu au fost descrise leziuni specifice ale organitelor citoplasmatice, sau ele nu au fost cautate intrun mod adecvat. A fost observata umflarea cisternelor reticului endoplasmic. Proteazele calciu dependente (calpaina) degradeaza citoscheletul (figura 4)

Figura 4. Evenimente metabolice ce au loc in apoptoza.

6. Recunoasterea si inlaturarea celulelor apoptotice

Exista mai multe mecanisme posibile de recunoastere a celulelor apoptotice de catre fagocite si de asemenea, mai multe statusuri tinta etalate de celulele apoptotice. Lectinele fagocitelor Un mecanism obisnuit de interactie intercelulara il reprezinta legarea carbohidratilor de la suprafata celulara a unei celule de lectinele altei celule, mecanism ce poate fi inhibat specific de catre zaharuri simple recunoscute de lectine. Unele din consecintele apoptozei sunt reprezentate de modificarile specifice ale carbohidratilor de pe suprafata membranei celulare. Se presupune ca pierderea, printr-un mecanism inca necunoscut, a unui reziduu terminal de acid sialic din lanturile laterale glicoproteice ar putea sa expuna N-acetilglucozamina, N-acetilgalactozamina si galactoza, mascate in conditii normale, restituind aceste reziduuri accesibilitatii interactiunii cu presupusele lectine macrofagice (figura 5).

Figura 5. Trei mecanisme prin intermediul carora fagocitele ar putea recunoaste celulele ce intra in apoptoza.

Receptori trombospondinici ai fagocitelor Acesti receptori se leaga de trombospondina ce serveste drept punte intre macrofage si celulele apoptotice. Receptorii pentru fosfatidilserina Foarte multi ani semnificatia fagocitarii celulelor intacte nedorite a fost subestimata. Pana nu demult, inglobarea celulelor apototice a fost considerata ca o inlaturare protectiva a celulelor nedorite. Recent clearance-ului celulelor apoptotice i-a fost atribuit o noua semnificatie. In functie de context, inlaturarea celulelor apoptotice de catre fagocite poate supresa inflamatia, poate modula deletia directionata a celulelor gazda sau a parazitilor invadanti de catre macrofage si poate regla raspunsul imun (figura 6).

Figura 6. Clearance-ul fagocitic al celulelor apoptotice.

7. Genetica apoptozei
In pofida numeroaselor progrese ce s-au realizat in cercetarea stiintifica este foarte dificila identificarea moleculelor responsabile de apoptoza cu ajutorul demersurilor biochimice si moleculare in sistemele mamaliene.Astfel, s-a identificat un numar mare de mutatii ce afecteaza stadii specifice ale procesului apoptotic si genele corespunzatoare care au fost ordonate intr-o schema genetica (figura 7). Aceste gene sunt implicate in decizia de a intra pe calea mortii, in executia acestei cai, in inglobarea celulelor muribunde si in degradarea resturilor celulare din cadrul inglobarii.

Figura 7. Schema genetica a apoptozei in C. elegans. Au fost izolate mutatiile din 14 gene diferite ce afecteaza apoptoza in diferitele ei etape. Mutatiile ce influenteaza decizia de a murii afecteaza doar un numar mic de gene. Genele implicate in etapele ulterioare sunt comune tuturor celulelor somatice din organism angajate pe calea mortii. Activitatea lui ced-3 si ced-4 promoveaza moartea celulara, iar ced-9 previne acest proces.

8. Semnificatia apoptozei in cancer si in terapia cancerului

Apoptoza si cancerul Oncologii au fost traditional preocupati in principal de proliferarea celulara, cu toate acestea in ultimul timp atentia lor se indreapta, cu un interes din ce in ce mai mare, spre studiul apoptozei. Apoptoza este o metoda eficienta de prevenire a transformarii maligne deoarece ea indeparteaza celulele care poseda alterari genetice. Apoptoza anormala poate promova dezvoltarea cancerului, atat prin permiterea acumularii de celule in diviziune, cat si prin blocarea indepartarii variantelor genetice cu potential malign ridicat. Produsul proteic al genei supresoare tumorale p53 poate intarzia progresia ciclului celular inaintea initierii sintezei replicative de ADN. Multe cancere umane poseda mutatii sau deletii la nivelul genei p53. Proteinele codificate de virusurile oncogene pot de asemenea lega si inactiva proteina p53. Proasta functionare a p53 poate promova dezvoltarea cancerului prin permiterea duplicarii DNA in celulele cu mutatii secundare, inainte de o reparare completa. Totusi, p53 este doar un inhibitor al diviziunii celulare, in alte situatii se comporta ca o apoptogena directa (o gena ce cauzeaza apoptoza). Superproducerea proteinei p53 normale, in linia celulara leucemica mieloida, induce rapid moartea celulara prin apoptoza (figura 8).

Figura 8. Relatia dintre proliferarea celulara si apoptoza.

Aparitia spontana a apoptozei in tumori Apoptoza poate fi gasita in toate tumorile virtuale, netratate. Desi s-au efectuat putine studii cantitative precise, evaluarile histologice indica faptul ca extinderea apoptozei in anumite tumori umane se apropie de ceea ce s-a observat in tesuturile cu involutie rapida evidentiind semnificatia sa cinetica, uneori considerabila. Factorii responsabili pentru aparitia spontana a apoptozei in tumori sunt, indubitabil, diversi. Apoptoza, deseori este proeminenta mai ales la locusul de confluenta cu necroza, unde se presupune ca ischemia moderata este implicata in initierea ei, aceasta este o cauza cunoscuta a activarii apoptozei in tesuturile non-neoplazice .

Bibliografie
1. T.S. Griffith, T. Brunner, S.M. Fletcher, D.R. Green, and T.A. Ferguson, Science 270, 1189-1192 (1995). 2. A. H. Wyllie, Cell death in Biology and Pathology, 9-34 (1981) 3. C. Dive and J.A. Hickman, Br. J. Cancer 64, 192-196 (1991) 4. C. Dive, C.D. Gregory, D.J. Phipps, D.L. Evans, A.E. Milner and A. H. Wyllie, Bioch. Biophy. Acta 1133, 275-282 (1992) 5. H.M. Ellis, and H.R.Horvitz, Cell 44, 817-829 (1986) 6. R.S. Malyapa, and S. Sawada, Radiat. Res.,125 , 134-140 (1991) 7. J.Y. Yuan, and H.R. Horvitz, Dev. Biol. 138, 33-41 (1990) 8. A. H. Wyllie, J.F.R. Keer, and A. R. Currie, Int. Rev. Cytol. 68, 251-305 (1980). 9. F. Oberhammer, J. W. Wilson, C. Dive, I. D. Morris, J. A. Hickman, A. E. Wakeling, P. R. Walker, and M. Sikorska, EMBO J. 12, 3679-36-84 (1993). 10. A. H. Wyllie, Nature 284, 555-556 (1980).