GENETICA METODE DE STUDIU

CICLUL CELULAR MITOTIC

Diviziunea nucleului a fost observat pentru prima dat n 1832, de ctre Dumortier, la alga Conferva aurea. Prin diviziunea nucleului se asigur distribuia egal a genelor la cele dou celule fiice, aceasta fiind condiionat de existena ADN dublu catenar i de mecanismul semiconservativ de replicare a acestuia. n diviziunea celular se disting dou categorii de evenimente: evenimente reproductive, prin care sunt dublate structurile funcionale ale celulei, esenial fiind dublarea cromosomilor, i evenimente distributive, prin care materialul rezultat n urma replicaiei este repartizat celulelor fiice (Tudose, 1992). Celulele fiice rezultate n urma diviziunii celulare, pot urma un proces de difereniere sau pot da natere, n urma repetrii diviziunii, la alte celule noi. Posibilitatea de a se divide este pstrat i de ctre celulele difereniate, dar ea se realizeaz n fapt, foarte rar, i numai atunci cnd este indus secundar. Celulele nedifereniate, meristematice, pstreaz ns permanent aceast capacitate de a se divide. Diviziunea mitotic a fost pentru prima dat, descris n anul 1879, la celula animal, de ctre Flemming i n 1884 la celula vegetal, de ctre Strasburger (Lewin, 1994, Snustad i colab., 1997).

GENETICA METODE DE STUDIU

Mitoza (gr. mitosis = fir) sau diviziunea ecvaional, este modalitatea de diviziune celular prin care, dintr-o celul somatic rezult dou celule fiice cu numr egal de cromosomi, att ntre ele, ct i cu celula mam. Mitoza este diviziunea celular care are loc n celule somatice i asigur transmiterea fidel a caracterelor la celulele fiice; ea poate suferi ns, diferite influene care adaug aparentei stabiliti a caracterelor, noi valene. n reproducerea celulelor, apar greelifenomene mutaionale pe care evoluia le poate perpetua sau nu. Caracteristica principal a diviziunii celulare este diviziunea nucleului, urmat de i diviziunea citoplasmei. Relaia nucleu citoplasm (evideniat nc din 1893, de ctre Strasburger) prezint implicaii majore n determinarea momentului diviziunii. Ciclul celular mitotic, la plante i animale, cuprinde n principal urmtoarele procese: duplicarea cromosomilor unicromatidici (i a centrozomului la animale) i deplasarea spre poli a cromosomilor fii, dup care, urmeaz diviziunea citoplasmei. n procesul mitozei se organizeaz aparatul mitotic alctuit din structuri cromatice i acromatice, care este complet n metafaz. Pentru realizarea acestuia, sunt necesare proteine specifice, a cror sintez necesit un mare consum de energie. Totalitatea proceselor prin care trece celula somatic de la formare i pn la scindarea ei n dou celule fiice, cu numr de cromosomi egal cu numrul de cromosomi al celulei din care au provenit, alctuiesc ciclul celular. Ciclul mitotic (Fig.1) cuprinde: interfaza (perioada dintre dou diviziuni succesive) i cele patru faze ale diviziunii mitotice propriu-zise profaza, metafaza, anafaza i telofaza avnd o durat variabil, n funcie

GENETICA METODE DE STUDIU

de specie, tipul de celule, temperatur etc., de la cteva ore, la zeci i sute de ore.

Interfaza
Interfaza are cea mai mare durat n timp n ciclul mitotic i este caracterizat de procese de biosintez. Durata interfazei este variabil, de la cteva ore pn la zile. La plante, la un ciclu tipic de 20-24 de ore, mitoza dureaz 70-110 minute (profaza = 30 - 45 min., metafaza = 5 - 10 min., anafaza = 15 - 20 min. i telofaza = 20 - 30 min.) (Toma i Ni, 1995). La celula animal, un ciclu tipic dureaz 18 - 24 de ore, din care durata fazei G1 este de aproximativ 6 ore (n general variaz cel mai mult), faza S (timpul necesar replicrii genomului) dureaz 6 - 8 ore, iar faza G2 este, de regul, cea mai scurt (mai ales cnd mitozele se succed rapid). Mitoza, de obicei dureaz mai puin de o or (Lewin, 1994). Dup Essad (1964, cf. Raicu, 1973) ciclul mitotic la Vicia faba L. dureaz 18 ore din care mitoza cuprinde 1,5 ore, restul revenind interfazei. Cercetrile microfotografice i microradiografice au demonstrat c interfaza este foarte puin activ din punct de vedere morfologic, dar este cea mai activ din punct de vedere metabolic; cantitatea de ADN se dubleaz de la 2C la 4C. Pe baza acestor observaii, Howard i Pelc, n 1953 au mprit interfaza n trei perioade: - perioada G1 (engl. gap = gol) perioad presintetic, n care nu are loc sinteza de ADN, ci doar o activare a enzimelor. Cromosomii sunt monocromatidici; se sintetizeaz ARN (n special ARNm) i proteine; - perioada S (engl. synthesis = sintez) perioada de sintez a ADN; pn la sfritul fazei S toat cantitatea de ADN se replic (pe parcursul fazei S cantitatea total de ADN crete de la 2C la 4C). La

GENETICA METODE DE STUDIU

sfritul acestei perioade, cromosomii sunt alctuii din dou cromatide foarte lungi i subiri; - perioada G2 perioad postsintetic, cnd sinteza ADN se oprete; are loc biosinteza proteinelor i a ARN, care se desfoar i n celelalte perioade ale interfazei. Celula conine cromosomi bicromatidici.
celule fiice

4cADN

2cADN

2cADN

diviziunea mitotic

interfaza

2cADN

Fig. 1 Ciclul celular mitotic (dup Alberts i colab., 1994)

Pe

parcursul

interfazei

(Fig.2),

cromosomii

sunt

hidratai,

despiralizai i nu se observ la microscopul optic (Watson, 1974).

GENETICA METODE DE STUDIU

Fig. 2 Aspectul nucleului n interfaz, n celulele meristemului radicular la Allium cepa L. (2n=16) (dup Hartl i Jones, 1998)

n afar de celulele la care ciclul mitotic se desfoar n mod normal, exist celule n repaus sau n perioada G0, asemntoare fazei G1, dar diferit prin faptul c celulele nu pot intra n faza S. n faza G0 intr celulele neproliferative. Uneori, celulele se pot afla n repaus n faza 4C (exemplu: celulele embrionare din semine), astfel nct, intr direct din G0 n G2; alteori, din G0 pot intra n G1 timpuriu (Lewin, 1994). n explicarea cauzelor ce determin intrarea celulei n diviziune mitotic (trecerea din G2 n mitoz) exist diferite ipoteze. Se pare c declanarea mitozei este determinat de modificarea raportului nucleu / citoplasm. Schmucker, Dean i Hinshelwood consider c declanarea mitozei este determinat de modificarea raporturilor ntre coninutul nucleului i membrana sa. Dup Haberlandt, diviziunea poate fi declanat introducnd n celulele sntoase anumii necrohormoni provenii din celulele rnite. Schmucker presupune c mitoza este indus de o radiaie specific a razelor mitotice (cu intensitate foarte redus i lungime scurt

GENETICA METODE DE STUDIU

de und) emise de celulele vii; ele acioneaz asupra celulelor care au atins un anumit stadiu pregtitor. n ultimul timp, este susinut cauzalitatea chimic a diviziunii celulare; declanarea mitozei este produs de anumite substane organice (stimulatoare de cretere n concentraie mare) i substane anorganice (de exemplu cobaltul inhib trecerea celulelor din interfaz n profaz). Se pare c intervine o kinaz (protein preexistent cu dou subuniti: una ce se activeaz la modificrile de la nceputul mitozei i o ciclin ce se acumuleaz n interfaz i este distrus n mitoz) (Lewin, 1994).

Profaza
n profaz au loc procesele: stabilirea mrirea polilor volumului pentru nucleului, diviziune, condensarea cromosomilor,

dezorganizarea membranei nucleare, dispariia nucleolilor i formarea fusului acromatic. La nceputul acestei faze, cromosomii se prezint sub form de filamente subiri, lungi, alctuind un spirem. n profaza timpurie (Fig.3) ei se dispun n tot spaiul nuclear (n celulele vii se observ uor, avnd indicele de refracie 1,50 fa de cel al carioplasmei de 1,37). n profaza trzie (Fig.4), gradul de spiralizare al cromosomilor crete i ei devin mai scuri i mai compaci, aprnd formai din dou cromatide, foarte apropiate ntre ele i nfurate una n jurul celeilalte. La nceputul profazei, are loc o prim spiralizare a cromosomilor denumit spiralizarea mic, ce se realizeaz prin micorarea numrului de spire i mrirea diametrului lor. Spre sfritul profazei, are loc a doua spiralizare denumit spiralizare somatic, n care numrul de spire continu s scad, ele apropiindu-se tot mai mult. Se admite i existena celei de a treia spiralizri. Semnificaia funcional a

GENETICA METODE DE STUDIU

acestor procese este aceea de a facilita deplasarea cromosomilor i de a pstra integritatea acestora. n profaz, distana dintre cromosomi crete treptat i are loc dezorganizarea nucleului i a membranei nucleare, dispariia nucleolilor i formarea fusului mitotic. Centriolii migreaz spre polii celulei, plasndu-se n dou puncte opuse. ntre centrioli se organizeaz fusul de diviziune (fus acromatic, fus mitotic sau fus nuclear), alctuit dintr-un numr mare de filamente, cu extremitile inserate pe centrioli. Fusul nuclear este un organit tranzitoriu, cu ajutorul cruia se realizeaz distribuirea egal a cromosomilor n cele dou celule fiice. Filamentele fusului de diviziune sunt de dou tipuri: filamente fusoriale de sprijin (continue) de la un centriol la altul ce condiioneaz structura fusului i filamente cromosomiale (kinetice), care sunt sintetizate i pleac de la centromerul fiecrui cromosom i nainteaz simultan, cu aceeai vitez, spre cei doi poli ai celulei.

Fig. 3 Aspect al nucleului unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n profaz timpurie (dup Hartl i Jones, 1998)

GENETICA METODE DE STUDIU

Fig. 4 Aspect al nucleului unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n profaz trzie (dup Hartl i Jones, 1998)

La plantele superioare, centriolii lipsesc din celul, rolul lor fiind preluat de calotele polare ce se alungesc n form de conuri, atingnd polii celulei n timp ce bazele lor se confund. Calotele polare sunt reprezentate de citoplasma perinuclear difereniat ntr-o zon clar, care crete treptat spre polii viitorului fus acromatic. Mitoza ce se desfoar n aceste condiii se numete mitoz anastral (Toma i Ni, 1995). Stadiul final al profazei prometafaza, se caracterizeaz prin totala dezorganizare a membranei nucleare, care se fragmenteaz n poriuni relativ mari, ce pstreaz infrastructura de membran dubl i rmn, n parte, n interiorul fusului de diviziune, participnd mai trziu la formarea membranelor nucleilor fii. Cromosomii exercit micri neregulate ntre polii celulei i planul ecuatorial al acesteia.

Metafaza
n aceast faz are loc desvrirea aparatului mitotic, iar cromosomii, spiralizai la maxim, se dispun n placa ecuatorial metafazic (Fig.5). Micarea de dispunere a cromosomilor n placa ecuatorial, la

GENETICA METODE DE STUDIU

distan egal de polii fusului de diviziune prezint, dup Darlington, trei componente:

adunarea cromosomilor ntr-o poziie de echilibru ntre cei doi

poli, micare datorat interaciunii ntre polii fusului i centromeri;

orientarea cromosomilor n placa ecuatorial astfel ca,

centromerii s fie situai n axul longitudinal al fusului de diviziune, cromatidele fiind orientate lateral;

distribuirea cromosomilor n placa metafazic se realizeaz n

jurul unui fus central gol (n seciune transversal apare ca un halo), cromosomii fiind dispui la periferia fusului, cu braele orientate n afar. Forma plcii metafazice este variabil de la un tip celular la altul, dar constant pentru acelai tip de celule. La organismele cu cromosomi scuri i celule mari, ntregul cromosom poate fi ncadrat n placa metafazic, n acelai plan cu centromerii. La alte tipuri de celule, se remarc tendina cromosomilor mici de a se dispune n axa central a fusului, iar a celor mari, periferic. Cnd cromosomii sunt lungi, braele lor se orienteaz, de regul, spre unul din cei doi poli, uneori chiar spre ambii poli. Anumii factori influeneaz configuraia plcii ecuatoriale, determinnd modificri n diviziune. Distrugerea experimental a fusului duce la desprinderea cromosomilor din placa ecuatorial; meninerea lor n placa ecuatorial se datoreaz unei fore alternative de repulsie i de atracie dintre poli i centromeri. Dup Ostergren, exist un echilibru al acestor fore; aceleai fore care in cromosomii n placa ecuatorial, ct timp centromerul este nedivizat, sunt responsabile de atracia centromerilor fii spre polii opui. Dup Darlington, separarea cromosomilor fii n anafaz

GENETICA METODE DE STUDIU

se datoreaz unei fore de repulsie aprute imediat dup diviziunea centromerului. Morfologia cromosomilor se studiaz n metafaz, deoarece n aceast faz ei sunt condensai n cel mai nalt grad. Fiecare cromosom este alctuit din dou cromatide i prezint n lungul acestora, spre sfritul metafazei, o fisur longitudinal, care reprezint spaiul dintre cele dou cromatide surori. La sfritul metafazei (Fig.6), cromatidele surori ncep s se separe (clivarea longitudinal), fcndu-se trecerea spre anafaz.

Fig. 5 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n metafaz timpurie (dup Hartl i Jones, 1998)

10

GENETICA METODE DE STUDIU

Fig. 6 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n metafaz trzie(dup Hartl i Jones, 1998)

Anafaza
Anafaza se caracterizeaz prin formarea, din cromatidele surori, a cromosomilor fii i migrarea lor spre cei doi poli ai celulei. Formarea cromosomilor fii debuteaz n anafaza timpurie, cnd are loc clivarea centromerilor, cromatidele rmnnd nc apropiate unele de altele. O dat terminat clivarea centromerilor, ncepe separarea cromatidelor n lungul fisurii longitudinale evideniate n metafaz (Fig.7). Dup Lewin (1994), la celulele animale, n anafaz, centromerul este duplicat funcional. Cnd i acest proces se ncheie, cromatidele fiice, fiecare cu cte un centromer propriu, ncep migrarea spre poli (Fig.8), devenind cromosomi fii. Se admite c micarea cromosomilor spre poli este o consecin a scurtrii filamentelor fusoriale de sprijin, care leag polii fusului (prin pierderea sau adiia de tubulin din microtubuli). Alungirea determin stabilitatea fusului, iar scurtarea este mecanismul implicat n micarea cromosomilor spre poli. Aceast micare este posibil datorit existenei n structura fusului mitotic a unor proteine de natur actinic. Cromosomii se pot deplasa la perioade diferite de timp i cu viteze diferite; de regul, micarea anafazic ncepe simultan la toi cromosomii, indiferent de mrimea lor. Micarea cromosomilor este continu, liniar. Fragmentele acentrice (lipsite de centromer) ale cromosomilor, nu pot migra la poli, dar ajung aici datorit curenilor citoplasmatici. Viteza de migrare a cromosomilor este de 0,2-5m / min. n cazul n care setul de cromosomi migreaz aproape perfect sincron, se formeaz placa anafazic sau

11

GENETICA METODE DE STUDIU

dublul aster. Chiar dac micarea cromosomilor nu este sincron, ea nu ncepe dect dup ce toi cromosomii sunt plasai n placa ecuatorial. n celulele animale, de regul, autosomii migreaz concomitent, iar heterosomii au o vitez de migrare diferit. n celulele plantelor, spre sfritul anafazei, fusul mitotic se mrete n volum n regiunea ecuatorial i ia form de butoia, formnd ulterior fragmoplastul. Pentru a explica mecanismul micrii anafazice a cromosomilor au fost emise i alte ipoteze. Astfel, Lillie, Bernstein, Kuwada i Darlington, explic aceast micare prin existena unor fore electrice i magnetice. Metz, susine idea c, cromosomii ar poseda fore proprii de locomoie, putnd migra independent spre poli. Mazia a emis n 1961, ipoteza c micarea anafazic a cromosomilor s-ar datora unor fore de atracie i de repulsie ntre cromosomi i polii fusului; cromosomii fiind ncrcai electric pozitiv, se resping ntre ei, n acelai timp fiind atrai de poli, care sunt ncrcai electric negativ.

Fig. 7 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n anafaz timpurie (dup Hartl i Jones, 1998)

Milovidov i Perakis au artat c celulele aflate n diviziune i supuse aciunii unui cmp magnetic, nu sunt influenate de acesta, deci

12

GENETICA METODE DE STUDIU

interaciunea cromosom pol nu implic fore de atracie sau respingere electromagnetic. Schaede, Burton i Haynes consider c micarea anafazic a cromosomilor este determinat de curenii citoplasmatici, direcionarea fiind realizat de aparatul mitotic.

Fig.8 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n anafaz trzie (dup Hartl i Jones, 1998)

O alt ipotez este aceea susinut de Szent-Gyorgyi i HoffmanBerling, dup care, aparatul mitotic este un gel n care funcioneaz filamente de tip actomiozinic, ce implic contractilitatea fibrelor cromosomiale, ca urmare a modificrii gradului de hidratare a aparatului mitotic. Chimic ns, proteinele izolate din aparatul mitotic au puine asemnri cu actomiozina.

Telofaza
Telofaza este ultima faz a mitozei, caracterizat prin prezena fenomenelor opuse celor din profaz. Cromosomii sufer un proces de despiralizare i revin la aspectul interfazic. Fragmentele de membran nuclear migreaz spre periferia fusului de diviziune; numrul lor crete

13

GENETICA METODE DE STUDIU

printr-o sintez suplimentar. Aceste vezicule se agreg n jurul masei cromosomiale, se turtesc, nconjoar nucleul interfazic i formeaz noua membran nuclear. O parte din veziculele membranoase ajung la nivelul liniei de demarcaie dintre cele dou celule fiice. Are loc i reorganizarea nucleolilor la nivelul regiunilor ce ndeplinesc funcia de organizatori nucleolari (Fig.9 i Fig.10).

Fig.9 Celul din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n telofaz timpurie (dup Hartl i Jones, 1998)

Fig.10 Aspect al nucleilor fii, aparinnd unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n telofaz trzie (dup Hartl i Jones, 1998)

14

GENETICA METODE DE STUDIU

Citochineza
n cazul creterii plasmodiale, diviziunile nucleare pot s nu fie urmate de citochinez (de exemplu: diviziunea celulelor la plantele inferioare alge Siphonales, la unele ciuperci, sau la formarea endospermului n sacul embrionar). n mod obinuit ns, diviziunea nuclear este urmat de citochinez (plasmodierez, citodierez sau plasmotomie). Citochineza poate avea loc centripet la plantele inferioare (Cladophora, Spirogyra), cnd membrana ce separ cele dou celule fiice apare sub forma unui inel ce crete centripetal, asemntor unei diafragme ()Toma i Ni, 1995). La plantele superioare, citochineza are loc centrifug. Dup Buvat, n zona ecuatorial a fragmoplastului, se dispun vezicule proteice, printre care se intercaleaz fragmente ale reticulului endoplasmic, ce migreaz n aceast regiune dinspre poli. mpreun cu elementele microtubulare, se formeaz o structur fibrilar. n jurul fibrelor microtubulare se aglomereaz vezicule mici golgiene (Fig.11a,b). Veziculele se mresc, se contopesc i vin n contact cu pereii celulei mame, formnd lamela median (Fig.11c). Celulele fiice formate, elaboreaz membrana primar, strbtut de plasmodesme (Fig.11d,e). La animale, separarea celulelor fiice se face prin formarea unui inel contractil, deci prin trangulare(Fig.12 a, b).

15

GENETICA METODE DE STUDIU

Fig. 11 Formarea peretelui despritor, ntre celulele-fiice, consecutiv diviziunii mitotice la plantele superioare (dup De Robertis i De Robertis,1983)

Fig.12 Separarea celulelor-fiice, prin intermediul formrii inelului contractil, consecutiv diviziunii mitotice, la organismele animale (dup De Robertis i De Robertis,1983)

Poziia aparatului mitotic determin desfurarea egal sau inegal a citochinezei. Doar la Spirogyra, la care n mod normal nucleul este situat n mijlocul celulei, deplasarea nucleului are drept consecin o diviziune inegal a citoplasmei. Prin experiene de micromanipulare, Kawamura a stabilit c exist o relaie riguroas ntre aparatul mitotic i planul citochinezei, aceasta realizndu-se perpendicular pe ecuatorul fusului de diviziune. n celulele normale, mitoza i citochineza sunt riguros coordonate. Dac are loc blocarea citochinezei, mitoza se desfoar normal, producndu-se o celul binucleat. Odat cu replicarea cromosomilor, are loc i replicarea organitelor citoplasmatice sau separarea lor din celula mam n celulele fiice, dup

16

GENETICA METODE DE STUDIU

care acestea i completeaz, prin noi sinteze, setul de organite intracitoplasmatice. n profaz, reticulul endoplasmic este transformat ntrun sistem discontinuu de vezicule sferice, dispuse n special n regiunile periferice ale citoplasmei. n metafaz, mitocondriile se adun n jurul fusului; n anafaz, ele se grupeaz n jurul regiunii ecuatoriale, odat cu separarea celulelor fiice avnd loc i repartizarea acestora. n interfaza celulelor fiice, el revine la forma tipic. n diviziunea mitotic, metafaza i anafaza sunt fazele cele mai scurte ale diviziunii, n timp ce profaza, uneori i telofaza, sunt cele mai lungi. Desfurarea n timp a mitozei depinde i de tipul celulei, vrst, starea fiziologic, condiii de mediu (mai ales temperatura). Influena temperaturii asupra ciclului mitotic a fost demonstrat de ctre Brown, la meristemul rdcinilor de mazre Pisum sativum L., unde viteza ciclului mitotic crete proporional cu temperatura (la 15C dureaz 177 min., iar la 30C doar 65,5 min.). Mitoza poate fi blocat prin aciunea ocurilor de temperatur, narcoticelor, otrvurilor etc. (Raicu i colab., 1973) Durata fazelor ciclului mitotic (n minute), n funcie de tipul celulei, dup Lobaev (1963) (cf. Raicu i colab., 1973) este:

Fazele ciclului mitotic Interfaz Profaz Metafaz Anafaz Telofaz

esut - Drosophila (min.) 2,9 3,6 0,5 1,2 0,9

Mezenchim - pui de gin (min.) 30-120 30-60 2-10 2-3 3-12

esut vegetal (min.) Variabil 36-45 7-10 15-20 20-35

17

GENETICA METODE DE STUDIU

METODE DE STUDIU A CROMOSOMILOR N MITOZ

Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la plantele superioare
Cromosomii la plantele superioare se evideniaz n celulele aflate n diviziune mitotic din esuturile meristematice, din zonele de cretere ale organelor vegetative (apex radicular, apex caulinar), sau n celulele meristemoide din calus. n lucrrile practice de citogenetic vegetal se folosesc mai ales specii de plante cu cromosomi de dimensiuni mari i n numr relativ mic. Pentru evidenierea cromosomilor, n celulele aflate n diviziune mitotic, se folosesc esuturile meristematice din zona de cretere a rdcinii de ceap Allium cepa L. (2n = 16), secar Secale cereale L. (2n = 14), bob Vicia faba L. (2n = 12) etc. Materialul biologic tipic, este reprezentat de esutul meristematic din apexul radicular al rdcinii de ceap Allium cepa L. (2n = 16).

18

GENETICA METODE DE STUDIU

Rdcinile de ceap se obin dup o perioad de 2-3 zile de la punerea ntr-un pahar cu ap a bulbului de ceap, astfel ca numai discul s ptrund n lichid. La temperatura camerei, rdcinile ating n 2-3 zile, lungimea de 10-15 mm i pot fi detaate (Fig.13).

Fig. 13 Germinarea unui bulb de ceap, n laborator

Pentru obinerea rdcinielor embrionare, seminele se pun la germinat pe hrtie de filtru, umectat cu ap, n cutii Petri, la temperatura camerei. Germinarea seminelor la unele specii de plante se face n nisip umed , n condiii speciale. Recoltarea rdcinilor se realizeaz cnd acestea ating lungimea de 10-15 mm. Momentul optim de recoltare cnd un numr mare de celule se afl n diviziune se determin prin tatonare. Timpul optim de recoltare pe parcursul unei zile este ntre orele 7 - 10, funcie de durata ciclului celular la specia respectiv.

19

GENETICA METODE DE STUDIU

Metode de evideniere a cromosomilor la plante

Metoda rapid Feulgen de colorare a cromosomilor la ceap Allium cepa L. (2n = 16)
Metodele rapide de colorare sunt bazate pe hidroliza substanelor pectice din pereii celulari i colorarea difereniat a constituenilor celulari. Principiul metodei: n celulele n diviziune, doar ADN-ul cromosomial este colorat selectiv n rou violaceu, de ctre o soluie de fuxin bazic decolorat (reactiv Schiff). Metoda a fost elaborat de Feulgen i Rossenbeck (1924) i modificat de Tomasi (1936); se aplic pentru evidenierea cromosomilor mitotici la diferite specii de plante (Tudose, 1967). Materiale necesare: material biologic (rdcini de ceap de 1-1,5 cm);

prefixatori:

sticlrie

(pahare

Berzelius,

flacoane,

lame

de

microscop, lamele, pipete); instrumentar (pensete, lame, bee de chibrit); aparatur (microscop optic, termostat, frigider); hrtie de filtru reactivi soluie apoas de colchicin (0,01 - 0,2%);

emulsie de - bromnaftalen (25 ml bromnaftalen C10H7Br n 75 ml ap distilat; se agit bine, se las n repaus pentru depunerea excesului de bromnaftalen i se folosete doar partea superioar a emulsiei);

20

GENETICA METODE DE STUDIU

cloronaftalen (C10H7Cl); iodonaftalen (C10H7I); ap rece la 2-4C

fixatori nucleari: alcool etilic absolut acid acetic glacial (3 :1); fixator Carnoy (6 pri alcool etilic absolut : 3 pri cloroform : 1 parte acid acetic glacial);

fixator Battaglia (5 pri alcool etilic absolut : 1 parte

acid acetic glacial : 1 parte formol : 1 parte cloroform) colorani:

reactiv Schiff - preparat dup Darlington i La Cour (1960) (cf.

Tudose, 1967): 1 g cristale de fuxin bazic se piseaz n mojar, apoi se introduc ntr-un balon de sticl, adugndu-se 200 cm3 ap distilat, la temperatura de 1000C; se agit puternic i se las la rcit pn ajunge la temperatura de 500C. Se filtreaz, se adaug 30 cm3 HCl 1N i 3 g metabisulfit de potasiu cristale. Soluia se las 24 de ore ntr-o sticl bine nchis, la ntuneric i la rece, timp n care culoarea sa devine glbui deschis; pentru decolorare se adaug 0,5 g crbune vegetal i se filtreaz dup 1 min., printr-o hrtie de filtru grosier. Reactivul se poate pstra timp ndelungat la ntuneric i la rece, la 40C. Dac soluia nu este pstrat la rece, se poate observa nceperea recolorrii. Pentru a evita recolorarea, se adaug n soluie, 2 - 4 g metabisulfit de potasiu.

preparat dup Pekov (1943) (cf. Tudose, 1967): ntr-un balon

de sticl se pun 0,5 g fuxin bazic, peste care se adaug 90

21

GENETICA METODE DE STUDIU

cm

de ap distilat la 1000C; se astup balonul cu un dop de

vat i se fierbe la o plit electric nc 3 - 4 min. Se las s se rceasc pn la 500C i se adaug 2 cm3 HCl cu =1,19 g / cm3. Se continu rcirea pn la 25C i se adaug 10 cm3 ap distilat, coninnd 2 g bisulfit de sodiu (Na 2SO3) sau 4 g de bisulfit de sodiu cristalizat (Na2SO3 x 7 H2O). Amestecul se las s se rceasc, apoi se filtreaz i se pstreaz la ntuneric i la rece, la 40C, putnd fi folosit timp ndelungat. Soluia folosit la colorare se recomand s nu se arunce, deoarece poate fi folosit de nenumrate ori, pn cnd capacitatea ei de colorare scade. Etape de lucru: Prefixarea Prefixarea este necesar pentru a inhiba formarea fusului de diviziune, determinnd acumularea de celule n metafaz. Aceast etap nu se recomand s se execute cnd se urmrete observarea tuturor etapelor diviziunii. Prefixarea este absolut necesar ns, la efectuarea preparatelor folosite pentru studierea cariotipului, realiznd o scurtare prin spiralizare, a cromosomilor. Materialul biologic (rdcinile de ceap de 1 - 1,5 cm lungime) se introduce n flacoane mici de sticl, adugndu-se 2 - 3 ml de prefixator. Dup trecerea timpului necesar prefixrii, prefixatorul se ndeprteaz cu o pipet sau prin decantare. Ca prefixatori se folosesc: soluie apoas de colchicin 0,01-0,2%, n care materialul se ine 2 - 3 ore la temperatura camerei; emulsie de bromnaftalen, 4 - 5 ore la temperatura camerei; ap rece la 2 40C, 4 - 24 ore, la frigider. Pentru studiul cromosomilor n mitoz la ceap, recomandm prefixarea bulbilor de ceap germinai, cu rdcini

22

GENETICA METODE DE STUDIU

de 1 - 1,5 cm, timp de 24 de ore la frigider (3-40C), sau prefixarea cu soluie de colchicin, 0,2%, timp de 2 ore la temperatura camerei. Fixarea Fixarea are rolul de a omor celulele, n starea n care se afl n acel moment i de a coagula constituenii celulari, fr a modifica structura intern i extern a celulelor. Prin fixare, biocoloizii celulei se coaguleaz, constituenii celulari putndu-se colora cu diferii colorani. Fixarea se realizeaz prin adugarea peste materialul biologic a 2-3 ml de fixator, dup ndeprtarea substanei de prefixare. La ceap, se preleveaz rdcinile i se plaseaz ntr-un flacon de sticl, n vederea efecturii fixrii cu fixator Battaglia, timp de 12 min., la temperatura camerei. n general, timpul de fixare variaz n funcie de soluia de fixare i de consistena materialului fixat. Dac prelucrarea materialului biologic nu se continu imediat, el se conserv la frigider (2 40C), n alcool etilic 70%. Splarea Rolul splrii este de a ndeprta urmele de fixator. Splarea se realizeaz cu soluie de HCl 1N, la temperatura camerei, timp de 5 min. Din flacoane, se ndeprteaz soluia de fixare i se adaug soluia de splare. Hidroliza Rolul hidrolizei este de a uura colorarea, prin dizolvarea parial a substanelor pectice intercelulare, distrugerea parial a pecto-celulozei parietale, precum i uurarea etalrii celulelor ntre lam i lamel. Dup ndeprtarea soluiei de fixare, sau a alcoolului, se realizeaz hidroliza la cald sau la rece. Hidroliza la cald se realizeaz la temperatura de 600C, prin adugarea de 2 - 3 ml HCl 1N. Timpul este variabil, funcie de duritatea esuturilor; se stabilete prin tatonri (la ceap, 7 - 8 min.). Hidroliza la cald

23

GENETICA METODE DE STUDIU

este anevoioas i nu d cele mai bune rezultate, deoarece, n general, cnd esuturile sunt destul de moi, se macereaz prea tare, se coaguleaz i materialul este compromis. De aceea, la ceap se folosete, de preferin, hidroliza la rece. Hidroliza la rece se realizeaz prin adugarea de soluie HCl 50%, dup ndeprtarea soluiei de splare. La ceap, hidroliza se realizeaz timp de 10-15 min., la temperatura camerei. Colorarea Dup ndeprtarea soluiei de hidroliz (cu ajutorul unei hrtii de filtru se ndeprteaz urmele de soluie de hidroliz), se adaug 2-3 ml de reactiv Schiff, astfel nct rdcinile s fie scufundate n colorant, iar colorantul s rmn incolor. Dup 15-20 de min., zona meristematic din vrful rdcinii ncepe s se coloreze n rou-violaceu, apoi n violet intens, deoarece aici se afl celule n diviziune; restul rdcinii, unde frecvena diviziunilor este sczut, iar celulele sunt mari i alungite, rmne vizibil necolorat. Pentru o bun colorare sunt necesare 30 min. - 1 or, la temperatura camerei. O colorare intens, uniform, se obine dac materialul introdus n colorant se pstreaz la frigider, cteva ore. Pentru mrirea contrastului ntre cromosomi i citoplasm se recomand meninerea rdcinilor scoase din colorant ntr-o soluie de acid acetic 45%, timp de 10 - 15 min. sau n ap, timp de 30 de min., splnd astfel excesul de colorant. n cazul n care nu s-a realizat o colorare satisfctoare, intensificarea ei se realizeaz prin executarea preparatului ntr-o pictur de carmin acetic. n colorant, la frigider, materialul se poate pstra maxim 1-2 zile, dup care se degradeaz, avnd loc i colorarea citoplasmei.

24

GENETICA METODE DE STUDIU

Efectuarea preparatelor microscopice Efectuarea preparatelor temporare rapide (tip squash) Preparatele microscopice rapide se obin prin etalarea vrfului colorat al rdcinii (de preferin o poriune de 1-2 mm), pe o lam de microscop curat i degresat (prin splarea lamelor n amestecuri oxidante speciale folosite n lucrrile de citologie, n alcool etilic 96%, sau n spirt sanitar, urmate de o bun tergere cu o bucat de tifon, naintea efecturii preparatului), ntr-o pictur de acid acetic 45%. n prealabil, vrful colorat al rdcinii se poate trece printr-un cristalizor cu ap. Aeznd deasupra vrfului detaat al rdcinii o lamel i innd cu un deget o latur a lamelei, se etaleaz preparatul prin bti ritmice i sistematice n lamel, cu un b de chibrit, pentru dispunerea celulelor ntrun singur strat i dispersarea cromosomilor n celule. Eliminarea excesului de soluie i desvrirea dispersrii celulelor i a cromosomilor se realizeaz cu ajutorul unei hrtii de filtru, apsnd cu degetul mare peste lamel, fr a o mica. Pentru a mpiedica mprtierea cromosomilor i pentru o bun fixare a celulelor pe lam, se recomand ungerea acesteia naintea executrii preparatului cu albumin glicerinat. Lama uns este trecut cu partea uscat deasupra unei flcri, evitnd coagularea albuminei glicerinate. Cu ct etalarea se efectueaz mai bine, cu att preparatul este mai bun, prezentnd cromosomii bine dispersai i individualizai. Trebuie evitat deplasarea lamelei pe lam n timpul etalrii, fapt ce duce la rostogolirea celulelor i la compromiterea parial sau total a preparatului. Dup etalare, ntre lam i lamel, trebuie s se observe cu ochiul liber un strat foarte fin de material celular colorat n violet.

25

GENETICA METODE DE STUDIU

Preparatele astfel obinute, se pot observa la microscop imediat dup efectuare, timp de cteva ore, deoarece la lumin i la temperatura camerei, colorantul va dispersa n citoplasm. Efectuarea preparatelor semipermanente Pentru studiul preparatelor i n ziua urmtoare, acestea se efectueaz semipermanent, pentru a evita evaporarea acidului acetic 45%, ceea ce ar duce la deshidratarea celulelor. Astfel de preparate se realizeaz prin parafinarea marginilor lamelei, sau prin adugare de glicerin pe marginile acesteia, la contactul cu lama i ndeprtarea excesului de glicerin cu ajutorul unei hrtii de filtru. Lamele semipermanente se pot pstra la frigider timp de 24 - 48 de ore. Dup o pstrare ndelungat, colorarea se intensific, cuprinznd i citoplasma. Efectuarea preparatelor permanente prin includere n balsam de Canada Preparatele microscopice pe care dorim s le pstrm timp ndelungat, cu scopul de a servi drept model, sau ca dovad a unei cercetri tiinifice, se monteaz n balsam de Canada (rin miscibil cu xilenul sau toluenul). n jurul lamelei se pune o pictur de alcool 96% i cu ajutorul unei lame de ras, se desprinde cu atenie lamela de pe lam, printro micare de ridicare a lamelei. Materialul de studiu rmne prins de lam i de lamel. Att lama, ct i lamela, se trec prin dou bi succesive de alcool etilic absolut sau alcool butilic i dou bi de xilen sau toluen, timp de 2-5 min., pentru fiecare baie. Rolul alcoolului este acela de a deshidrata esuturile i de a le spla de acidul acetic; xilenul va nlocui apa din esuturi; de asemenea, balsamul de Canada este miscibil cu xilenul. Lamele se introduc n pahare Borel sau orice alt tip de pahar, iar lamelele n capsule de sticl sau porelan, ntotdeauna cu preparatul biologic plasat la faa superioar. Pe lama umed, n regiunea unde sunt

26

GENETICA METODE DE STUDIU

celule, se pune o pictur de balsam de Canada, iar deasupra se aplic o lamel curat i degresat. Pe aceeai lam, alturi (n regiunea fr celule) se pune o alt pictur de balsam de Canada peste care se aeaz lamela iniial, cu faa ce conine celulele, n jos. Se ndeprteaz excesul de balsam de Canada printr-o uoar apsare pe lamele, cu o bucat de hrtie de filtru, realizndu-se astfel, i prinderea lamelelor de lam. Preparatul se usuc la termostat, la 400C, timp de cteva zile i se eticheteaz (se noteaz specia i esutul din care s-a efectuat preparatul, metoda de colorare, data, eventual numele persoanei care a efectuat preparatul etc.), putnd fi pstrat apoi timp ndelungat. Examinarea preparatelor la microscopul optic Examinarea preparatelor se efectueaz n lumin puternic, cu folosirea unui filtru verde, care mrete contrastul ntre cromosomi i citoplasm. Se recomand ca observarea s nceap cu obiectivul 10x, apoi, se schimb obiectivele 20x, 40x i chiar 90x (cu imersie n ulei de cedru). Deoarece reactivul Schiff coloreaz selectiv numai ADN-ul, la microscopul optic, se vor observa cromosomii colorai n rou-violet; nucleolii, citoplasma i organitele celulare rmnnd incolore. Pereii celulari nu se coloreaz, fiind greu vizibili, de culoare glbuie; uneori se observ doar cromosomii celulelor n diviziune i nucleii celulelor n interfaz. Pentru a delimita celulele, se poate realiza o uoar colorare a citoplasmei, cu o soluie alcoolic foarte slab de verde de metil. Aceast colorare se realizeaz naintea efecturii preparatului permanent, prin trecerea lamei i a lamelei pentru un timp foarte scurt (cteva secunde), prin soluie alcoolic de verde de metil. Astfel, citoplasma se coloreaz n

27

GENETICA METODE DE STUDIU

verde deschis i celulele pot fi uor delimitate, iar cromosomii se observ mai bine, datorit contrastului de culoare. La microscopul optic se vor observa celule n interfaz cu nuclei mici, colorai n rou-violet, cu nucleoli incolori, ce apar ca nite corpusculi luminoi de form mai mult sau mai puin rotund. Se observ i celule n diferite faze ale diviziunii mitotice:

celule n profaz timpurie, cnd cromosomii ncep s devin

vizibili la microscopul optic i au aspectul unor filamente fine i subiri; n profaza trzie, cnd cromosomii se individualizeaz, fiind situai n nucleu. Spre sfritul profazei se dezorganizeaz membrana nuclear;

celule n metafaz (faz cu frecven ridicat n preparatele

microscopice, n cazul n care s-a efectuat prefixarea); se pot numra i observa morfologic cromosomii care au atins maximul spiralizrii, fiind bine individualizai. La Allium cepa L. (2n = 16) se pot observa cu uurin i se pot numra 16 cromosomi, de forma unor bastonae, cu capetele mai mult sau mai puin ndoite. Prin studiu mai amnunit cu obiectivul de imersie se poate observa morfologia fiecrui cromosom n parte, putndu-se executa microfotografii; celule n anafaz n anafaz timpurie, cu cromosomii fii unicromatidici ce se deplaseaz spre polii celulei i anafaz trzie, cu cromosomii fii la cei doi poli ai celulei, sub form de stea - diaster;

celule n telofaz timpurie, cnd cromosomii fii au ajuns la

polii celulei i telofaz trzie, caracterizat prin formarea nucleilor fii i apariia peretelui despritor (fragmoplastul). Folosirea noniusului n studiul preparatelor microscopice De o mare importan n studiul preparatelor microscopice este folosirea noniusului, ntocmit cu ajutorul scalelor gradate pe care le prezint

28

GENETICA METODE DE STUDIU

microscopul pe masa mobil ce determin micarea preparatului, n direcie transversal i longitudinal. Noniusul se folosete pentru a marca poziia celulelor ce prezint interes deosebit n studiul efectuat, celule la care se va reveni pentru studiu mai amnunit, sau care urmeaz a fi fotografiate. ntocmirea noniusului se realizeaz, de preferin, la obiectivul 10x. Practic, este foarte simplu de notat noniusul pentru oricare celul de interes deosebit n studiul efectuat. O prim condiie este aceea de a utiliza mereu acelai microscop, la care s-au fixat foarte bine susintoarele lamei; a doua condiie este aceea a aezrii preparatului pe masa mobil n aceeai poziie (de exemplu, cu eticheta n dreapta). Stabilirea noniusului se realizeaz prin notarea coordonatelor indicate de scalele gradate. De regul, se noteaz mai nti cifrele de pe abscis, apoi de pe ordonat. De exemplu, notarea se face astfel: 40,7 x 74,3. Citirea se efectueaz ca la citirea ublerului: se citesc ntregi sutele, zecile i unitile, iar subunitile se citesc pe scara mic, unde coincid dou gradaii ale scalei mici i mari. Noniusul se noteaz n caietul de observaii, dup ce s-a notat numrul preparatului studiat (Tudose, 1967). n laboratorul nostru, pentru studiul cromosomilor n mitoz la alte specii de plante, se utilizeaz metoda Feulgen, n diverse variante, adaptate pentru diferite tipuri de material biologic (orz, bob, secar, gru i mac). Etapele de lucru generale, sunt:

prefixare la temperatura camerei, n soluie de colchicin 0,2% i

splare 2 ore cu ap distilat (pentru studiul cromosomilor n metafaz);

fixare cu fixator Battaglia, la temperatura camerei, timp de 30 min.

la orz, bob, secar i gru i 20 de min. la mac;

29

GENETICA METODE DE STUDIU

splare cu HCl 1N timp de 5 min.; hidroliz cu HCl 50%, 12 min. la bob, 20 min. la orz, 30 min. la
secar i gru i 5 min. la mac;

colorare cu reactiv Schiff, la temperatura camerei, ntre 20 - 30 min.,

pn la 2 - 3 ore.

Metoda rapid de colorare a cromosomilor la ceap Allium cepa L. (2n=16) n mitoz cu soluie carmin-acetic
Metoda a fost elaborat n 1926 de ctre Belling (cf. Tudose, 1967)i se bazeaz pe faptul c acidul carminic (din colorantul natural carmin, extras din femelele homopterului Coccus cacti), se comport ca un colorant acid n soluie alcalin i se ncarc negativ, iar n soluie acid, ca un colorant bazic, ncrcndu-se pozitiv. Aceast metod este des folosit n studiile de citogenetic vegetal, deoarece este uor de efectuat, necesitnd un timp scurt. Materialul biologic, sticlria, instrumentarul i reactivii utilizai sunt identici cu cei folosii n cazul metodei Feulgen. Colorantul utilizat este soluia carmin acetic (55 cm3 ap distilat la 1000C, 45 cm3 acid acetic glacial i 0,5 g carmin). Amestecul se pune ntrun balon de sticl, se agit i se aeaz n bain-marie, lsndu-se s fiarb cteva minute. Se agit din nou i se las s se rceasc; se filtreaz i se adaug cteva cristale de acetat de fier (cu rol de mordant), ce se dizolv ncet n soluie, excesul depunndu-se la baza vasului. Se pstreaz la ntuneric i la rece (la frigider).

30

GENETICA METODE DE STUDIU

Etape de lucru: Prefixarea Prefixarea materialului biologic lipsete, sau poate fi efectuat la fel ca la metoda Feulgen. Fixarea Fixarea nu este necesar; se poate realiza n fixator alcool : acid acetic (3 : 1), timp de 2 - 12 ore, sau cu alt fixator. Dac nu se continu lucrul, materialul poate fi pstrat la rece, n fiole cu alcool 70%, bine nchise. Hidroliza i colorarea Hidroliza i colorarea se efectueaz simultan, n soluia carminacetic. ntr-o sticl de ceas sau o capsul de porelan, se pun 3 - 5 cm 3 colorant carmin acetic, peste materialul de studiat (rdcinie de 10 - 15 mm lungime). Pentru realizarea hidrolizei se adaug cteva picturi (10 15) de HCl 1N; se nclzete 20 - 25 min. la flacra unei lmpi de spirt sau a unui bec de gaz, evitnd fierberea i agitnd, pn cnd materialul capt culoarea rou nchis, devine moale i se las la baza vasului. Efectuarea preparatelor microscopice Preparatele microscopice se realizeaz pe o lam de microscop, ntr-o pictur de carmin acetic, n care se aeaz vrful unei rdcinie. Pentru intensificarea culorii, se amestec uor colorantul cu ajutorul unei spatule metalice. Se aeaz deasupra o lamel, se etaleaz i se ndeprteaz excesul de colorant, n acelai mod ca la metoda Feulgen.

Metoda de colorare a cromosomilor cu orcein acetic

Metoda a fost elaborat n 1941 de ctre La Cour (cf. Tudose, 1967)i d bune rezultate n cazul plantelor cu cromosomi de dimensiuni mici (de exemplu, la Zea mays). Se folosete la studiul cromosomilor n

31

GENETICA METODE DE STUDIU

mitoz, dar i pentru alctuirea cariotipului, deoarece orceina este un colorant puternic i coloreaz foarte bine cromosomii. Materialul biologic, sticlria, instrumentarul i reactivii utilizai sunt identici cu cei folosii n cazul metodei Feulgen. Colorantul utilizat este orceina acetic (2,2 g orcein n 100 cm3 acid acetic glacial). Orceina se dizolv n acid acetic glacial la temperatura de fierbere, dup care se continu fierberea 2 - 3 minute, se las s se rceasc i se filtreaz. Din aceast soluie (soluie de rezerv) se prepar soluia standard (45 pri de soluie de rezerv i 55 pri ap distilat). n aceast soluie standard de orcein acetic 1%, care se prepar n momentul colorrii, se adaug 1/10 pri HCl 1N, pentru a grbi hidroliza. Etape de lucru: Prefixarea Prefixarea se realizeaz n emulsie de bromnaftalen, timp de 5 ore, la rece (0 40C). Fixarea Fixarea se realizeaz n fixator alcool : acid acetic (3 : 1), timp de 24 - 48 de ore, sau n alt fixator. Att fixarea, ct i prefixarea pot lipsi, dar efectundu-se, se obin o hidroliz i o colorare mai bune. Hidroliza i colorarea Soluia standard de orcein acetic cu HCl 1N se pune peste materialul de studiat, ntr-o capsul de porelan; se nclzete cteva minute, evitnd fierberea, pn cnd esuturile devin moi i capt culoare nchis. Efectuarea preparatelor temporare, rapide (de tip squash) Preparatele microscopice se realizeaz pe o lam de microscop, dup rcirea materialului, ntr-o pictur proaspt de orcein acetic (fr HCl). Pentru obinerea preparatelor permanente nu se pot folosi tehnicile

32

GENETICA METODE DE STUDIU

cunoscute, deoarece are loc un proces de micorare a contrastului dintre cromosomi i citoplasm. Preparatele pot fi pstrate cteva zile, la frigider, prin efectuarea lor semipermanente. Se recomand studierea imediat dup prelucrare i efectuarea microfotografiilor.

Metoda Carr de colorare a cromosomilor la Papaver somniferum L. (2n=22)

Materialul biologic este reprezentat de radicule de mac - Papaver somniferum L., n vrst de 3 - 5 zile, cu lungimea de 0,5 - 1 cm. Sticlria, instrumentarul i reactivii utilizai sunt identici cu cei folosii n cazul metodei Feulgen. Colorantul utilizat este carbol fuxina modificat colorant Carr (Gamborg i Wetter, 1975): 1. Carbol fuxin (Carr i Walker, 1961)

soluia stoc A 3 g fuxin bazic, n 100 ml alcool

etilic 70% (se pstreaz timp nelimitat);

soluia stoc B 10 ml soluie stoc A se adaug la 90

ml fenol 5%, n ap distilat (se folosete dou sptmni);

soluia carbol fuxin pentru colorare 45 ml soluie

stoc B se adaug la 6 ml acid acetic glacial i 6 ml formaldehid 37%. 2. Carbol fuxin modificat la 2 - 10 ml soluie carbol fuxin pentru colorare se adug 90-98 ml acid acetic 45% i 1,8 g sorbitol. O colorare mai bun a nucleilor s-a obinut folosind carbol fuxin modificat, preparat de timp ndelungat (soluia modificat se pstreaz la

33

GENETICA METODE DE STUDIU

temperatura camerei cel puin dou sptmni, n recipiente de culoare nchis). Soluia de colorare este stabil i nu s-au observat modificri (precipitare sau decolorare), timp de doi ani de pstrare la temperatura camerei. Etape de lucru: Prefixare Prefixarea se realizeaz cu soluie de colchicin 0,2%, timp de 2 ore (pentru studiul cromosomilor metafazici). Fixare Fixarea se realizeaz cu fixator Battaglia, timp de 20 de min., la temperatura camerei. Se nltur soluia de fixare i se adaug alcool etilic 70%, n cazul n care se dorete pstrarea ndelungat la frigider. Hidroliz Hidroliza se realizeaz cu HCl 50%, 5 min., la temperatura camerei. Anterior hidrolizei se poate realiza i o splare cu HCl 1N, 5 min. la temperatura camerei. Colorare Colorarea se realizeaz cu colorant Carr, dup ndeprtarea soluiei de hidroliz. Se cltete materialul biologic cu colorant i apoi se adaug din nou colorant; se pstreaz 24 de ore la frigider, timp n care se realizeaz colorarea materialului nuclear. Materialul biologic se poate pstra n colorant, la frigider, timp ndelungat. Efectuarea preparatelor microscopice Preparatele se realizeaz pe o lam de microscop, ntr-o pictur de acid acetic 45%, n care se plaseaz 3 - 5 rdcinie; se secioneaz 1 mm din apexul radicular al fiecrei rdcinie (se ndeprteaz restul materialului biologic), se acoper cu lamela i se realizeaz etalarea.

34

GENETICA METODE DE STUDIU

Preparatele microscopice se studiaz la microscopul optic; se pot realiza i preparate permanente n balsam de Canada, dup tehnica descris anterior.

Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la animale

Studiul cromosomilor la animale se poate realiza direct n esuturile cu activitate mitotic intens (esut hematopoetic, hepatic, splenic, gonadal, epiteliul cornean, esuturi embrionare sau de regenerare, ct i indirect n culturi de esuturi.

Metode pentru studiul cromosomilor n diferite esuturi provenite de la animale adulte

Studiul cromosomilor la peti (Fam. Cyprinidae) Tehnica Ohno (1965)
Material biologic: splin, rinichi, gonade, branhii. Reactivi: colchicin 0,5%, ap distilat, acid acetic 50%, HCl 1N, colorant Giemsa. Instrumentar: lame de microscop, lamele, sering, foarfece, ac spatulat, pensete etc. Etape de lucru: Pretratament Pretratamentul se realizeaz cu colchicin. Colchicina blocheaz celulele n diviziune n stadiul de metafaz, prin inhibarea activitii fusului

35

GENETICA METODE DE STUDIU

nuclear, determinnd acumularea n esuturile tratate a unui numr sporit de metafaze, cu cromosomii bine individualizai, liberi n citoplasm. Se injecteaz animalele adulte intramuscular (n musculatura dorsal) cu soluie de colchicin 0,5%, n cantitate de 0,5-1 ml. (n funcie de talie), cu dou ore nainte de sacrificare. Tratament Tratamentul se realizeaz cu soluie hipotonic (hipoton), ce determin o umflare i o fluidizare a citoplasmei celulare, permind astfel dispersarea cromosomilor, deci o etalare superioar. Dup sacrificarea animalului se recolteaz splina, rinichiul, gonadele i branhiile, care se fragmenteaz n buci de aproximativ 2 mm3. Hipotonia se realizeaz n ap distilat, la pH neutru, timp de 15 min., la temperatura camerei. Fixare Fixarea are rolul de a omor celulele, fr s altereze componentele celulare. Drept fixator se folosete soluia de acid acetic 50%, timp de 1530 min., la temperatura camerei. Hidroliz Hidroliza se efectueaz n scopul macerrii esuturilor, n vederea facilitrii ptrunderii colorantului n nucleu; se realizeaz cu HCl 1N, la 600C, timp de 10-15 min. Colorare Colorarea se realizeaz cu soluie Giemsa, n scopul obinerii contrastului necesar examinrii microscopice a cromosomilor. Efectuare de preparate microscopice de tip squash Pe o lam de microscop, ntr-o pictur de acid acetic 45%, se plaseaz un fragment de esut, se acoper cu lamela i se etaleaz prin bti ritmice cu un b de chibrit.

36

GENETICA METODE DE STUDIU

Preparatele se pot realiza permanente n balsam de Canada, dup tehnica descris.

Tehnica Ojima i Hitotsumachi (1967)

Aceast tehnic este o variant a metodei anterioare. Dup tratamentul cu soluie hipotonic materialul se recolteaz printr-o centrifugare uoar i se trateaz cu fixator alcool / acid acetic 3/1, timp de 24 de ore. Colorarea se realizeaz cu reactiv Schiff sau cu soluie de carmin acetic 2%, apoi se efectueaz preparate microscopice de tip squash. Se pot efectua preparate permanente n balsam de Canada.

Tehnica Raicu i Taisescu (1972)

Pretratament Pretratamentul se realizeaz cu soluie de colchicin 0,5%, prin injectare intramuscular, cu dou ore nainte de sacrificare. Tratament cu soluie hipotonic Se prelev splina, ficatul, rinichiul, gonadele i branhiile, se fragmenteaz i se introduc n soluie hipoton de citrat de sodiu 0,4-0,7%; tratamentul se efectueaz timp de 45 de minute, pe un agitator magnetic, la temperatura camerei. Filtrare Filtrarea se realizeaz prin tifon dublu ntr-o eprubet de centrifug; se centrifugheaz timp de 15 min., la 1500 rpm i se decanteaz supernatantul. Fixare Sedimentul celular se resuspend n fixator (alcool etilic / acid acetic 3/1); se picur fixator pe pereii eprubetei i se las or la frigider,

37

GENETICA METODE DE STUDIU

apoi se centrifugheaz. Dup centrifugare se elimin supernatantul i se repet de 3-5 ori fixarea. Efectuarea frotiurilor Din ultima suspensie celular se efectueaz frotiuri pe lame ngheate, dup tehnica uscrii la aer. Colorare Colorarea se realizeaz cu soluie Giemsa 15%, timp de 20 min.

Studiul cromosomilor la amfibieni Tehnica Spurway i Callan (1960)

Aceast tehnic este utilizat pentru evidenierea cromosomilor din celulele esutului gonadal (testicul), la diferite specii de Triturus. Etape de lucru: Tratament Pentru studiul cromosomilor metafazici este necesar nlocuirea tratamentului hipotonic cu o colchicinizare cu soluie de colchicin 0,04% n ap distilat, timp de 30 min., la 370C. Fixare esutul gonadal fragmentat se fixeaz 2-3 ore n fixator alcool acetic 3/1. Colorare Colorarea se realizeaz cu soluie carmin acetic 2%, cu acetat de fier, timp de 10 min. Efectuarea preparatelor microscopice Preparatele se efectueaz prin tehnica squash. Se plaseaz o poriune din esutul colorat pe lam i se acoper cu lamela, apoi se preseaz uor pentru etalare.

38

GENETICA METODE DE STUDIU

Efectuarea preparatelor permanente Preparatul se introduce n acid acetic 10% pentru desprinderea lamelei i se trece n alcool acetic 3/1, timp de cteva secunde. Ulterior se trec att lama, ct i lamela prin dou bi de alcool i dou bi de xilol, apoi se monteaz preparatul n balsam de Canada.

Studiul cromosomilor la mamifere Tehnica Fredga (1964)

Material biologic: cornee de obolan, oarece, hamster, cobai. Hipotonia Se asfixiaz animalul (obolan, oarece, hamster, cobai) cu eter sau cloroform i se extirp globii oculari cu un foarfece fin i o pens curb, evitnd atingerea corneei. Globii oculari se plaseaz ntr-un vas cu soluie hipoton de citrat de sodiu 0,7% (n ap distilat), la 370C, timp de 30 min. Fixarea Fixarea materialului se realizeaz n soluie de acid acetic 50% - 9 pri i o parte HCl 1N, 5 min. Colorarea Colorarea se realizeaz n soluie de orcein acetic 2%, 2 min. Efectuarea preparatelor microscopice Globul ocular se plaseaz pe o lam de microscop curat i cu un ac spatulat se rzuie celulele din epiteliul cornean ntr-o pictur de colorant. Se acoper cu lamela i se preseaz cu grij, realizndu-se un preparat de tip squash.

Tehnica Meylan (1964, 1967)

Material biologic: splin, testicul de obolan, oarece etc.

39

GENETICA METODE DE STUDIU

Pretratament Animalul se injecteaz intraperitoneal cu 2 ml soluie colcemid 0,1% pentru 100 g animal viu. Pretratamentul se realizeaz timp de 90 min. Hipotonia Animalul se anesteziaz cu eter, se sacrific i se recolteaz splina i testiculul, care se introduc 10 min. n cuve cu ap distilat i se fragmenteaz n buci mici. Fixare Pentru fixarea materialului, se ndeprteaz apa distilat i se adaug fixatorul (acid acetic 50%); fixarea se realizeaz timp de 40 min. Etalarea Pe o lam albuminat se plaseaz un fragment de splin sau testicul i se acoper cu lamela uns cu vaselin. Materialul se strivete ntre lam i lamel prin apsare cu degetul mare al minii. Splarea Lamele se introduc ntr-o baie de alcool etilic 70%, pn la desprinderea lamelelor. Lamele se aeaz n stativ n poziie vertical i se las 24 de ore, la temperatura camerei, pentru uscare. Astfel se pot conserva cteva luni. Pentru efectuarea studiului preparatelor, lamele se rehidrateaz n ap distilat timp de 20 min. Dac lamele nu au fost uscate, se efectueaz o splare rapid n ap distilat. Hidroliza Hidroliza se realizeaz n HCl 1N, timp de 13 min., la 560C. Colorarea Colorarea se realizeaz cu hematoxilin Erlich, 20 min. sau cu reactiv Schiff, timp de 2-6 ore. Efectuarea preparatelor permanente Se efectueaz o splare cu ap de robinet, urmat de o trecere n dou bi de alcool i apoi n dou bi de xilen. Preparatul se monteaz n balsam de Canada.

40

GENETICA METODE DE STUDIU

Tehnica rapid Fredga (1968)

Material biologic: splin de oarece, obolan, etc. Pretratament Se injecteaz animalul intraperitoneal cu soluie colchicin 0,04%, cu 1-1 or nainte de sacrificare. Hipotonia Se sacrific animalul, se recolteaz splina i se introduce ntr-un vas cu soluie izoton de citrat de sodiu 2,2%. Se mrunete cu foarfecele pn la obinerea unei suspensii celulare. Se elimin esuturile rmase i se adaug dou volume de ap distilat. Astfel, soluia de citrat de sodiu devine hipoton. Tratamentul dureaz 10 min. Fixarea Se elimin supernatantul i peste suspensia de celule dizolvate se adaug fixatorul (9 pri acid acetic 60% i 1 parte HCl 1N), lsndu-se 1015 min. Colorarea Colorarea se realizeaz cu soluie de orcein acetic 2%, lsnduse 2-3 min. Efectuarea preparatelor microscopice Preparatele se efectueaz prin tehnica squash (etalarea

materialului ntre lam i lamel prin strivire).

41