APOPTOZA. IMPLICAII N PATOLOGIA MALIGN 1.

Introducere Moartea celular fiziologic este esenial pentru dezvoltarea i funcionarea normal a organismelor multicelulare. Celulele non-necesare, deteriorate i potenial nocive trebuie nlturate din microclimatul celular sntos pentru asigurarea homeostaziei structurale i funcionale a esutului. Exemple ale morii celulare fiziologice au fost observate la aproape toate tipurile celulare pe parcursul dezvoltrii i maturrii. Pe parcursul dezvoltrii embrionare, modelarea celular specific i organogenez sunt asigurate de un program spaio-temporal definit genetic de proliferare i moarte celular. n esuturile adulte, moartea celular fiziologic apare, de asemenea, proeminent n interiorul esuturilor ciclic stimulate sau dependente hormonal, cum sunt endometrul,prostata i glanda mamar, dar i n turnoverul stady-state al multor alte esuturi. Moartea selectiv a celulelor este fundamental pentru dezvoltarea, reglarea i funcionarea sistemului imun, incluznd eliminarea timocitelor auto-reactive, selecia negativ a limfocitelor T i B i distrugerea celulelor realizat de limfocitele T citotoxice. Celulele ce au suferit deteriorri genetice ireparabile sunt, de asemenea, detectate de procese endogene, probabil limitndu-se astfel diseminarea leziunilor genetice potenial nocive. Limfocitele care invadeaz esuturi privilegiate din punct de vedere imunologic sunt rapid eliminate, astfel protejndu-se regiunile sensibile de o deteriorare produs printr-un rspuns inflamator (1). Conceptul unificator al tuturor acestor circumstane diverse este acela c procesul de moarte celular este mediat de un set comun de evenimente i se desfoar pe ci biochimice similare, conducnd la o dispunere stereotip a modificrilor structurale. Aceast moarte celular este numit apoptoz.

Apoptoza este un proces nnscut, conservat din punct de vedere evolutiv prin care celulele sistematic i inactiveaz, i dezasambleaz i i degradeaz propriile componente structurale i funcionale pentru desvrirea propriului lor deces. Acest proces poate fi activat intracelular printr-un program de dezvoltare definit genetic sau extracelular prin intermediul proteinelor endogene, citokinelor i hormonilor, ca i de componente xenobiotice, radiaii, stresul oxidativ i hipoxia. Abilitatea unei celule de a intra n apoptoz ca rspuns la un semnal de moarte depinde de statusul su proliferativ, poziia ciclului celular i de expresia controlat a genelor care promoveaz, inhib i afecteaz programul de moarte. Reglarea strict a acestor parametri modulatori ai morii trebuie meninut pentru asigurarea contextului fiziologic propice apariiei apoptozei. Disfunciile care apar n oricare dintre punctele cii de moarte programat, pot duce la un proces apoptotic eronat, determinnd astfel la exprimarea unor condiii fiziopatologice. Importana apoptozei deriv din natura sa activ i din potenialul su de a controla sistemele biologice. Moartea celular a fost considerat la nceput un proces haotic. Totui, aa cum o celul i poate echilibra metabolismul, pendulnd ntre anabolic i catabolic, tot astfel un organism multicelular trebuie s echilibreze ratele de proliferare celular i de moarte celular pentru meninerea homeostaziei. De asemenea, un organism trebuie s ndeprteze celulele senescente, deteriorate sau anormale care ar putea s interfereze cu buna funcionare a unui organ sau s-ar putea transforma malign. Ca urmare, alterrile survenite n domeniul reglrii morii celulare ar putea contribui la patogeneza bolilor degenerative i neoplazice. Dei moartea celular fiziologic se cunoate de decenii, interesul pentru aceast problem a fost reactualizat n 1972, cnd Kerr, Wyllie i Currie au descris n detaliu modificrile ultrastructurale caracteristice celulelor muribunde i au propus termenul de apoptoz pentru descrierea acestui proces (2). Ei au evideniat faptul c moartea celular fiziologic nu este un proces
2

randomic, ci are trsturi morfologice distincte. De obicei apoptoza afecteaz celule individuale i, odat iniiat, se propag rapid. Ingestia celulelor apoptotice de ctre macrofage nu induce eliberarea enzimelor proteolitice sau a oxigenului singlet care e toxic. Fragmentarea celulelor are loc fr scurgerea coninutului celular n spaiul extracelular, iar ndeprtarea celulelor apoptotice nu provoac un rspuns inflamator. Absena inflamaiei reprezint o trstur crucial, permindu-se astfel moartea celulei fr deteriorarea celulelor adiacent. 2. Apoptoza versus necroza Moartea celular poate fi accidental sau programat ntr-un organism multicelular. Dovezile sprijin ipoteza existenei unui program de sinucidere inerent n celulele vertebratelor care este activat atunci cnd moartea celulei este dorit pentru binele restului comunitii celulare. n esuturile vertebratelor s-au descris dou modele de moarte celular cu morfologie distinct: apoptoza i necroza (3, 4), ns mecanismele lor la nivel molecular nu sunt nc complet nelese. NECROZA poate fi descris ca i colapsul metabolic celular i apare cnd celula nu-i mai poate menine homeostazia ionic. Pe msur ce nivelurile de ATP se epuizeaz i gradientul ionic transmembranar se disipa, celulele se umfla i organitele intracelulare se dilat. Iniial se observ nmuguriri reversibile ale membranei, modificri timpurii n conformaia i funcia mitocondriilor i celula devine rapid incapabil de a menine homeostazia. Depind un prag, procesul devine ireversibil. Membrana celular poate deveni situsul major al alterrilor pierzndu-i astfel capacitatea de reglare a presiunii osmotice, celula se umfl i crap. Deteriorrile membranelor interne permit eliberarea enzimelor lizozomale, coninutul celulei este mprtiat n spaiul tisular nconjurtor i provoac un rspuns inflamator nespecific.

Necroza este indus tipic de modificri extreme n mediul nconjurtor al celulei, care determin leziuni severe i brute, provocate de exemplu de ischemie, hipertermie meninut sau traume fizice sau chimice. Se presupune nu este influenat genetic (5) (figura 1).

Figura 1. Ilustrarea secvenei de modificri ultrastructurale care au loc n apoptoz (2-6) i necroz (7 i 8). (1) Celula normal. Apoptoza timpurie (2) se caracterizeaz prin compactarea i marginalizarea cromatinei, condensarea citoplasmei i plierea membranelor, nuclear i plasmatic (3). n ultima etap, nucleul se fragmenteaz i protuberanele formate pe suprafaa celulei se separ pentru a forma corpii apoptotici, care (4), sunt fagocitai de celulele vecine i (5 i 6) degradate n lizozomi (7). Necroza este asociat cu gruparea neregulat a cromatinei, umflarea organitelor i distrugerea focal a membranelor (8). Apoi membranele se dezintegreaz dar, n general, celula i menine ntreaga conformaie pn la ndeprtarea ei de ctre fagocitele mononucleare.

APOPTOZA este o form de moarte celular n care procesul este mult mai subtil. Este adesea echivalat cu moartea celular programat, dar este bine s meninem cele dou concepte distincte cel morfologic i cel escatologic. Apoptoza se refer la o serie de modificri morfologice pe parcursul procesului de moarte celular, modificri diferite de cele observate n necroz, fiind asociat cu procesul normal de reglare a esuturilor (fig. 1). La vertebrate, moartea celular este acceptat ca un proces obinuit i chiar accentuat previzibil, dar programarea ei nu se face n sensul acceptat la nevertebrate, ca o moarte a celulelor individuale, care n anumite cazuri poate fi apreciat, cu mare acuratee, ca fiind programat (6, 7). n ultima vreme suntem forai s acceptm observaia, aparent paradoxal, ca moartea celular este att programat, ct i stohastic. De exemplu, pe parcursul dezvoltrii populaiilor de celule B, aproximativ 96% din celule vor muri dintr-unul dintr-o varietate de

motive (rearanjate genic imperfect sau absena stimulrii) dar este imposibil de prevzut dinainte care dintre ele se va produce. Apoptoza apare n celule individuale dispersate, nu n grupuri de celule nvecinate, aa cum se ntmpl n necroz. Se pare c apoptoza prezint cea mai comun morfologie atunci cnd moartea celular este determinat fiziologic. Referindu-ne la mamifere, exemplele includ moartea celulelor cu perioada de njumtire scurt (neutrofile); eliminarea celulelor T autoreactive; involuia celulelor lipsite de factorii de cretere necesari; moartea morfologic a celulelor pe parcursul evoluiei embrionare i postembrionare timpurii; i omorrea celulelor care servesc drept inte celulelor T, celulelor natural ucigae (NK), sau mecanisme citotoxice mediate celular dependente de anticorpi. Motivul pentru care celulele trebuie s moar este diferit de la un tip celular la altul la fel i mecanismul de declanare. Deseori semnalul de sinucidere provine din mediul nconjurtor, ca n expunerea la sau retragerea dintr-un mediu cu hormoni sau factori de cretere. Acest aspect este incitant din punct de vedere conceptual, atta vreme ct se traduce prin faptul c soarta unei celule este dependen de activitatea alteia; chiar dac moartea este programat, locusul programului este n afara celulei care trebuie s moart. n alte cazuri, de exemplu turnoverul neutrofilelor, se pare c celula are un ceas intern autonom care ar controla programul de moarte a celulei (adevratul program de moarte celular autonom a fost identificat la nematode i genele ce controleaz acest proces au fost elucidate (8). Cile de activare a apoptozei vor fi diferite n diferite celule, dar mecanismul de moarte n sine va fi mereu acelai, ceea ce nseamn c exist o cale final comun. Este foarte important ca n studiul apoptozei s ncercm s facem distincia dintre procesele car sunt specifice celulei de cele care sunt specifice morii. Se pare c exist multe mecanisme declanatoare ale cilor de sinucidere, chiar i ntr-un singur tip de celul. Nu toate acestea vor fi recunoscute imediat ca fiind programate. De exemplu,
5

pentru a activa calea apoptotic, timocitele pot fi semnalizate de ctre glucocortioizi sau de o cross-linkare a receptorului pentru antigen, n acest caz, ambii stimuli fiind considerai fiziologici. Dar timocitele vor suferi un proces apoptotic identic dup expunerea la o doz mic de radiaii ionizante sau la o otrav. Deoarece nici unul dintre aceti ageni nu este fiziologic, n acest caz moartea celulelor nu poate fi strict definit ca fiind programat. Totui definiia poate fi lrgit n sensul c n anumite celule, cnd sunt deteriorate nespecific, se poate activa fiziologic o moarte programat. Aceasta presupune c deteriorarea s nu fie foarte sever pentru ca programul s poat fi exprimat: dac timocitele sunt meninute la 430 C vor muri prin necroz, dar dac se revine, suficient de rapid, la o temperatur de 370 C, vor muri prin apoptoz. S-a sugerat c ar fi prea periculos pentru limfocite s ncerce repararea unor astfel de tipuri de leziuni, atta vreme ct o reparare imperfect ar putea duce la instalarea autoimunitii sau a leucemiei n astfel de cazuri celulele activndu-i mecanismul apoptotic. 3. Fazele procesului apoptotic Controlul general al numrului de celule care se efectueaz prin intermediul ciclului celular este compus dintr-un sistem multicompartiment n interiorul cruia celula are cel puin 3 opiuni posibile (fig. 2). Celula poate fi:
1) metabolic activ, dar nu desfoar nici procesul de proliferare i nici

cel de apoptoz (celul aflat n faza G0;

2) n

curs

de

desfurare

procesului

de

proliferare

(G0G1SG2MITOZ)
3) pe punctul de a desfura procesul de moarte celular fie pe calea

programat (G0D1FD2fragmentare celular apoptotic), fie pe calea neprogramat (necroz) (figura 2)

6

Figura 2. Schema desfurrii ciclului celular care arat opiunile unei celule aflate n faza G0. D1 definete perioada pe parcursul creia se activeaz noi gene a cror expresie proteic este cerut pentru inducerea fragmentrii ADN (faza F). D2 definete perioada nsi celula se fragmenteaz n corpi apoptotici.

Celulele pot fi induse s intre pe calea morii celulare programate din orice faz a ciclului celular de proliferare (G1, S sau G2). Semnalele locale sau sistemice ale factorilor de cretere ce regleaz progresia n interiorul ciclului celular sunt specifice tipului celular i sunt independent determinate ca parte a fenotipului de difereniere a celulei n cauz. Astfel acelai factor de cretere (ex.: factorul transformant de cretere 1) poate avea efecte agoniste sau antagoniste n cadrul ciclului celular al diferitelor tipuri de celule (ex.: inductor al proliferrii celulare n celulele mezemhimale sau inductor al arestului n G0 sau progresia prin fazele apoptozei pentru celulele epiteliale). Procesul apoptotic poate fi mprit n trei etape distincte: - angajarea, n care celula care a primit un stimul apoptotic letal devine ireversibil angajat pe calea morii: - executarea, pe parcursul creia apar majoritatea modificrilor structurale; - clearance-ul, n cadrul cruia resturile celulare sunt ndeprtate prin fagocitoz. Modificrile structurale care apar pe parcursul fazei executorii au fost descrise pentru prima dat de Ker i colaboratorii (2), iar acum sunt din ce n ce mai bine nelese din punctul de vedere al mecanismului.

4. Morfologia apoptozei Pe parcursul fazei de execuie, apar modificri morfologice i biochimice coordonate n interiorul nucleului, citoplasmei, organitelor i membranei plasmatice. Modificrile morfologice care se observ cel mai uor sunt cele care apar n interiorul nucleului. Cromatina condenseaz i formeaz agretate de-a lungul periferiei nucleare, relevnd un model conformaional semilunar. Caracterizarea morfologic a cromatinei demonstreaz o degradare ordonat a ADN-ului de ctre o nucleaz endogen dependent de cation (9), nti n fragmente mari de 30-50 kilobaze (10) pn la fragmente nucleozomale de 180200 perechi de baze (11). Totui clivarea cromatinei la fragmente nucleozomale nu are loc n toate tipurile celulare i poate fi inhibat fr a bloca celelalte modificri ale apoptozei (12, 13). Odat cu condensarea cromatinei este alterat ultrastructura nuclear. Lamina nuclear i reeaua de filamente intermediare care menine integritatea anvelopei nucleare i distribuia porilor nucleari sunt clivate proteolitic (14-16). Astfel distrugerea structurii reelei nucleare ar putea permite alturarea porilor nucleari (17) i frmiarea nucleului n fragmente care conin cromatina, care, majoritatea menin vestigii ale membranei nucleare. Celelalte organite citoplasmatice rmn intacte din punct de vedere structural cu toate c disfunciile mitocondriale sunt asociate cu apoptoza (18) (figura 3). Modificrile nucleare sunt precedate de reducerea potenialului transmembranar mitocondrial, necuplarea tarnsportuliu de electroni de la sinteza ATP-ului i cretrea generrii de specii reactive de oxigen. n citoplasm apare cross-linkarea de proteine prin aciunea transglutaminazelor (19), filamentele citoscheletale se agreg n formaiuni paralele i reticulul endoplasmic se dilat i fuzioneaz cu membrana plasmatic, crend cratere n form de sac la nivelul fuziunii. Se poate specula faptul c celula sufer o alterare profund a citoscheletului. Cu toate c, pn n momentul de fa, aceast problem nu a
8

fost studiat n detaliu, exist exemple n care distrugerea citoscheletului duce la angajarea celulei pe calea apoptotic, n timp ce stabilizarea citoscheletului inhib apoptoza. n apoptoz, membrana celular se umfl i se cuteaz ntr-o msur mult mai mare dect n necroz, fenomenul a fost numit zeioz. Integritatea structural a membranei este ulterior compromis prin pierderea asimetriei fosfolipidice, a microvililor i a jonciunilor intercelulare. Celula se sfericizeaz, se ndeprteaz de vecinii si i se contract dramatic i expulzeaz protuberane care se separ n corpi apoptotici nvelii n membran. n interiorul esuturilor, celulele apoptotice i corpii apoptotici sunt recunoscui i fagocitai rapid de ctre celulele vecine sau macrofage.

Figura 3. stadiile apoptozei ntr-un limfocit. Aceste stadii sunt observate mai bine n culturi izolate atta vreme ct in vivo ar interveni fagocitoza: (a) Celula normal are o citoplasm dispersat i cromatina nuclear heterogen. Volumul celulei e de aproximativ 90 fL. (b) Celula a pierdut o parte din volum i organitele citoplasmatice sunt strns mpachetate, se observ ngrmdiri ale cromatinei. n acest stadiu sunt prezente modificrile membranare care duc la fagocitoz. (c) Celula etaleaz zeioza. (d) Colapsul cromatinei cu aranjarea ei n form de semilun de-a lungul anvelopei nucleare. Volumul celular este acum de 70 fL. (e) Nucleul are acum aspectul unei guri negre. (f) Nucleul se fragmenteaz n sfere, iar membrana se cuteaz formnd vezicule. (g) Fragmentele celulare coninute n corpii apoptotici care, pentru o vreme, continu s exclud colorantul vital.

Recunoaterea celulelor apoptotice de ctre fagocite poate implica interacii ale lectinelor macrofagelor endogene cu resturi zaharidice. N-acetil specifice exprimate pe suprafaa celulelor apoptotice, interaciile specific mediate de receptori cu fosfatidilserina din stratul exterior al membranei plasmatice i interaciile trombospondina/receptori de suprafa celular, care conin resturi incomplet caracterizate de pe suprafaa celulelor apoptotice (20). Exist evidene ce sugereaz c mecanismul de recunoatere poate fi diferit n funcie de populaia de fagocite. Semnificativ pentru strategia central a acestui

tip de moarte celular este clearance-ul rapid i eficient al resturilor apoptotice de ctre fagocitele vecine,amatoare sau profesioniste, deoarece previne rspunsul inflamator care, altminteri, ar urma calea distrugerii celulare i deversarea proteinelor intracelulare i a acizilor nucleici n spaiul extracelular. Odat ce faza de execuie a apoptozei este activat, ntregul proces demareaz rapid i este complet terminat n cteva ore (21). Durata acestei faze este relativ invariabil n raport cu tipul celular i stimulul apoptotic, sugernd c stadiul final al apoptozei trece printr-o cale comun. Totui stadiul de angajare, timpul de la receptarea stimulului apoptotic pn la iniierea fazei ireversibile de execuie este extrem de variabil i depinde de tipul celular, de stimulul apoptotic, de situarea n cadrul ciclului celular i de expresia diverilor factori modulatori ai morii. Muli factori care influeneaz angajarea sau susceptibilitatea celular la apoptoz sunt implicai direct n recepia i transmiterea semnalului apoptotic. Aceti factori reglatori sunt frecvent selectai pentru a bloca procesul pe parcursul transformrii neoplazice sau dezvoltrii rezistenei la medicamente i sunt obiectul modificrii virale. Perioada de fragmentare a ADN (figura 2, faza F) poate fi utilizat pentru dividerea n serii temporale a evenimentelor implicate n apoptoz mai mult dect perioada sintezei de ADN (figura 2, faza S) care este utilizat pentru mprirea ciclului celular proliferativ (22). Pe parcursul fazei D1 apoptotice, celula sufer o reprogramare genetic, proces pe parcursul cruia gene care erau normal exprimate acum sunt supresate i invers (23-26). Aceste modificri epigenetice au ca rezultat fragmentarea dublu catenar a ADN pe parcursul fazei F. Pe parcursul acestei faze F, morfologia nuclear se schimb (marginalizarea nuclear a cromatinei urmat de condensarea nuclear i eventual de fragmentarea nucleului nsui), cu toate c membranele plasmatic i lizozomal sunt nc intacte i mitocondria nc funcional. Pe parcursul urmtoarei faze, poriunea D2, apare nmugurirea membranei i eventual fragmentarea celular n clustere de corpi apoptotici nvelii n membran.
10

5. Biochimia apoptozei Celulele care sufer apoptoz se contract considerabil, iar electronomicrografiile evideniaz o citoplasm extrem de condensat cu organite care par a fi normale. Cea mai plauzibil explicaie ar fi aceea c celula a pierdut apa i, cum nu se evideniaz o umflare imediat, probabil a pierdut ioni izoosmotic. De asemenea, nu au fost descrise leziuni specifice ale organitelor citoplasmatice sau ele nu au fost cutate ntr-un mod adecvat. A fost observat umflarea cisternelor reticului endoplasmic. Biochimic, n celul are loc reducerea sintezei de ARN i proteine urmat de degradarea lor, dar sincronizarea acestor evenimente n raport cu modificrile morfologice nu este nc bine caracterizat. Totui iniial s-a crezut c tranziia de la normal la contractarea apoptotic se realizeaz att de rapid nct nu poate fi observat o stare intermediar, citometria n flux poate ajuta la caracterizarea modificrii i n combinaie cu sortarea celular poate nlesni o ptrundere mai profund n ordinea evenimentelor. Dei apoptoza este un proces opus necrozei, reprezentnd calea fiziologic de moarte celular, poate fi, de asemenea, provocat de stimuli patologic. n general, orice stimul care produce necroz prin distrugere celular direct poate induce apoptoza, n cazul n care celula iniial supravieuiete. n acest sens apoptoza reprezint un rspuns celular coordonat la stimuli vtmtori care nu sunt imediat letali. Nu se poate vorbi de o serie invariabil de evenimente metabolice care au loc n cursul apoptozei. Totui timpuriu, n apoptoz, n multe tipuri celulare, apare o cretere susinut a nivelului de calciu ionizat citosolic. Calciul poate activa latent enzime care contribuie la modificrile structurale din cursul apoptozei. Aceste enzime includ o endonucleaz nuclear calciu dependent care cliveaz invariabil ADN i o

11

transglutaminaz care crosslinkeaz proteine citosolice. Proteazele calciu dependente (calpaina) degradeaz citoscheletul (figura 4) (27-29) n general,procesul apoptotic are nevoie de energie sub form de ATP, reclam sinteza activ a ARN i proteina depinde de tipul celular i stimulul apoptotic. n limfocitele mature, agenii care inhib ARN-ul sau sinteza proteic n general duc la blocarea apoptozei; din contr, n neurofilele imature i n unele linii celulare leucemice, aceiai compui amplific apoptoza. Una din explicaiile acestei contradicii este c majoritatea celulelor conin proteine reglatoare care pot inhiba sau promova moarta celular fiziologic. ntr-un tip particular celular, comparnd ratele catabolice ale inhibitorilor i promotorilor, se poate determina dac sistarea sintezei de ARN i proteice previne sau induce apoptoza.

Figura 4. Evenimente metabolice care au loc n apoptoz.

n celulele destinate s sufere apoptoza crete mRNA pentru -tubulin. Probabil c genele pentru -tubulin sunt degradate mpreun cu restul DNAului nuclear ndat ce endocnucleaza devine activ (30). Agenii care interfer cu polimerizarea actinei, cum ar fi citocalasina B, s-a artat c previn nmugurirea celular care duce la formarea corpilor apoptotici fr a bloca fragmentarea nucleului sau clivajul DNA (31). 5.1. Activitatesa endonucleazic, structura cromatinei i degradarea ADN n apoptoz

12

Nucleul este locul producerii majoritii modificrilor dramatice care au loc n apoptoz. Modificrile sunt studiate mai bine cu ajutorul microscopiei electronice de transmisie (figura 5), dar au fost deja vizualizate n celule vii n urma utilizrii coloranilor fluoresceni cum sunt acridin oranjul sau Hoechst 33342. Modelul modificrilor difer de la un tip celular la altul, dar, n general, nucleul se contract i cromatina devine foarte dens, se fragmenteaz i, n final, se leag strns de anvelopa nuclear. Aceast modificare este adesea acompaniat de fragmentarea ADN n subuniti regulate care formeaz o scar, ca rezultat al ruperii dublu catenare, aparent randomice la nivelul regiunilor linker dintre miezurile nucleozomale. n fiecare celul exist peste un milion de astfel de rupturi, ceea ce relev o situaie imposibil de reparat i, ca urmare, are loc sistarea transcripiei (32). n ultimii ani a existat o controvers cu privire la dimensiunile fragmentelor de ADN produse pe parcursul apoptozei, responsabile de angajamentul ireversibil pe calea morii celulare.

Figura 5. Modificrile structurale ale celulei pe parcursul apoptozei. Imaginea superioar reprezint o celul normal. Imaginea inferioar reprezint o celul n cursul procesului de apoptoz; sgeile indic fragmente de cromatin condensat.

Exist o serie de rapoarte care precizeaz c, atunci cnd celula intr n apoptoz, ADN-ul genomic este degradat n fragmente mici nucleozomale (repetri de cte 200 pb). Totui au existat rapoarte care susineau c celulele pot intra n apoptoz pe criterii morfologice fr producerea scrii de ADN nucleozomal (33-36, 37).

13

O serie de investigaii au sugerat c proteinele responsabile de fragmentarea letal a ADN n apopotoz sunt endonucleaze de tip DNaza I care, pentru activare, depind de calciu (Ca2+), (11, 38). De asemenea, ntr-o serie de tipuri celulare, n care a fost indus apoptoza sub diferite forme, s-a demonstrat elevarea susinut a nivelului de ioni liberi de calciu intracelular (Cai) (39-43) care s-a sugerat c ar fi necesar pentru activarea endonucleazelor de aproximativ 23 kD (44, 45). Celulele rspunde la o cretere a Ca i prin pomparea calciului n interiorul unei organite intracelulare sau n afara celulei prin membrana citoplasmatic. Astfel de transport de Ca2+ este catalizat de schimbul membranar de Na2+ - Ca2+ i de proteinele ATP-aze Ca2+. Deoarece ATP-aze Ca2+ cere un proton pentru transportul vectorial al Ca2+ n interiorul celulei, un astfel de transport ar putea acidifia celula, dac nu ar fi imediat tamponat sau transportat n afara celulei (46). n modelul propus de Filipski n 1990 (figura 6), este privit ca fiind ordonat n bucle de cromatin bine stabilizate de cte 50 Kb, aceste bucle sunt nfurate n structuri hexamerice numite rozete i coninnd aproximativ 300 Kb de ADN. Rozetele formeaz subunitatea de baz a cromatidei rsucite. Au fost studiate activitile endonucleolitice asociate cu fragmentarea ADN cu masa molecular mare cu ajutorul tehnicii PFGE (pulsed field gradient gel electrophoresis). S-a observat, n toate tipurile de celule studiate, o activitate dependent de Mg2+ capabil de producerea fragmentelor de la 50 50 Kb la 300 Kb, iar ionii de Ca au fost necesari pentru fragmentarea ulterioar la oligonucleozomi (47-49). Aceste experimente au sugerat c ar putea fi necesare dou enzime separate pentru fragmentarea complet a ADN pe parcursul apoptozei. Totui, utiliznd chelatori ai Ca2+ intracelular (50), s-a observat c, pentru degradarea ADN de masa molecular mare, sunt, de asemenea, necesare cantiti nanomolare de calciu, complicnd astfel explicaia fenomenului de clivare. De asemenea, s-a observat c fragmentarea internucleozomal de ADN

14

poate fi blocat de ctre zinc, cunoscut inhibitor al endonucleazelor Ca2+ i Mg2+ dependente (51, 52). n continuare s-a demonstrat faptul c fragmentarea internucleozomal a ADN n apoptoz nu este randomic (53). Fragmentarea apare preferenial n elementele repetate ale ADN care au un rol n organizarea structural a cromatinei.

Figura 6. Modelul Filipski et al. (1990) care prezint structura cromatinei. Sgeile corespund situsurilor de clivare ale cromatinei.

De asemenea,, se pare c nucleozomii sunt eliberai de preferin din regiunea domeniilor rozet i/sau bucl, care conin elemente repetitive ale ADN pe parcursul fazei secundare de degradare. S-a artat c sensibilitatea general a cromatinei la nucleaze nu este alterat pe parcursul apoptozei (54). Aceasta indic faptul c, n condiiile unui nivel ridicat de Ca2+ fragmentarea de ADN are loc n interiorul buclelor de ADN la un numr strict de loci i nu e dependent de gradul de pliere al fibrei de 30-nm care determin accesibilitatea general a regiunilor linker (55). Lund n considerare toate aceste date, se poate spune c fragmentarea endogen a ADN pe parcursul apoptozei se produce n 3 etape (fig. 6). Prima etap ncepe cu activarea unei endonucleaze legate constitutiv de o clas de SAR (regiuni de ataare a matricei i citoscheletului) bogate n legturi A-T, care ataeaz domenii mari ale cromozomului la matricea nuclear. Concentraia nuclear endogen de Mg2+ este suficient pentru activitatea ei. nu este nici o cerin de Ca2+ att timp ct ADN este monocatenar. S-au evideniat astfel o serie de fragmente monocatenare de ADN pe parcursul procesului de apoptoz. A doua etap implic propagarea acestei degradri la alte clase de SAR. Aceast propagare are o dependen de Ca2+, sugernd ca situsurile i-au mbogit compoziia n
15

C-G i toat cromatina este redus la fragmente de ~300 kb. n etapa a treia se cliveaz ADN internucleozomal la regiunile linker din interiorul buclelor i genereaz scara ADN. Aceast clivare este relativ independent de secven (n termeni legai de situsurile care leag nucleaza), dar necesit Ca2+ pentru cinetica. De asemenea, aceast etap necesit proteoliza (56). Factorii adiionali implicai n aceast etap ar putea realiza extensia final a fragmentrii ADN care difer mult de la un tip celular la altul. Toate aceste etape de degradare sunt catalizate de o enzim sau dou pool-uri de enzime cu proprieti DNaza-I like. ADN-ul mitocondrial nu sufer fragmentare (57). Se presupune c aceast clivare a ADN-ului nuclear, ntr-o etap timpurie a procesului, poate avea un rol protector prin evitarea transferului de material genetic potenial activ celulelor vecine dup fagocitarea corpilor apoptotici (58). Exist i tipuri celulare n care apoptozatipic, care include modificrile nucleare, este observat microscopic ca fiind lipsit de clivajul nucleozomilor ADN. Totui, n puinele sisteme n care a fost studiat, au fost observate anumite forme de deteriorare a ADN (ruptura monocatenar extins, rare fragmentri dublucatenare), necesare modificrilor morfologice profunde. Nu exist un consens privind rolul pe care l joac fragmentarea ADN care are loc naintea morii celulare. Dei transcripia este oprit, ea nsi nu este att de rapid letal, precum este apoptoza, ceea ce nseamn c sunt implicate i alte procese. S-a stabilit faptul c acidul aurin tricarboxilic, care inhib nucleaza, este un inhibitor al tuturor aspectelor legate de apoptoza; dar este incorect s concluzionm c, prin urmare, distrugerea ADN este pasul critic n procesul apoptozei, atta vreme ct aurinul inhib multe alte reacii metabolice celulare. 5.2. Modificrile membranei plasmatice Fagocitarea rapid a corpilor apoptotici de ctre celulele adiacente, ct timp membranele lor celulare sunt intacte (pentru prevenirea inflamaiei i
16

lezrii esuturilor n care se formeaz, n special cnd procesul apare n condiii fiziologice) implic operarea unui mecanism de recunoatere foarte specific i exist dovezi care susin existena mai multor astfel de mecanisme (59). n mod normal, fosfolipidele membranei plasmatice sunt distribuite asimetric. Lipidele care conin colin, cum ar fi fosfatidilcolina (FC) i sfingomielina sunt concentrate pe faa extern a membranei plasmatice n timp ce aminofosfolipidele cum sunt fosfatidiletanolamina (FEA) i fosfatidilsesrina (FS) abund pe faa intern a membranei plasmatice. Dintre toate, fosfatidilserina (FS) este restrictat n majoritatea celulelor exclusiv la faa intern a membranei (60). Pierderea asimetriei fosfolipidice i expunerea FS a fost prima oar demonstrat pentru limfotice (61), dar aceast descoperire a fost confirmat ntr-o serie de tipuri celulare (62). Externalizarea FS este rapid, sugernd mai degrab un transport facilitat dect o difuziune pasiv a lipidelor prin bistrat. Aceast activitate se presupune c este mediat de o protein enzimatic activat de calciu, ATP independent i nespecific din punctul de vedere al fosfolipidelor transportate (63). Din punct de vedere biologic, expunerea FS la suprafa e considerat a fi un ligand pentru nlturarea rapid a celulelor care-l exprim. O alt consecin biologic este legat de faptul c FS servete drept cofactor pentru cascada de coagulare (64), domeniu n care datele ncep s se contureze, sugernd c FS poate avea o serie de efecte anti-inflamatoare sau imunosupresive. 6. Recunoaterea i nlturarea celulelor apoptotice Evenimentul final, comun pentru majoritatea celulelor apoptotice este reprezentat de recunoaterea i ndeprtarea lor de ctre fagocite. Celulele apoptotice sunt ndeprtate naintea lizei lor, acest eveniment sugernd c ele exprim modificri specifice pe suprafaa care semnalizeaz fagocitelor legarea
17

i nglobarea lor. Aceste fagocite pot fi profesioniste (macrofagele) sau amatoare (fibroblaste, celule epiteliale i celule musculare netede din pereii vaselor de snge). Pn acum au fost descrii mai muli receptori pe macrofage i alte celule care leag celulele apoptotice i mediaz nglobarea lor. Acetia sunt reprezentai de receptori lectin-like (65), receptorul pentru vitronectine v3 (66), CD36, receptorul de recunoatere al fosfatidilserinei (67), nc necaracterizat, CD14 (68) i receptori scavanger (69). De curnd, s-a demonstrat c transportorul ABC1, de asemenea, implicat n nglobarea celulelor mamaliene apoptotice, mediaz transportul anionic fiind omolog genei ced-7 asociat cu fagocitoza corpilor apoptotice n C. elegans. Mecanismul prin care aceti receptori mediaz fagocitoza celulelor apoptotice nu este cunoscut, iar liganzii acestor receptori nu sunt nc bine caracterizai. Cu toate acestea comun multor celule rmne expunerea fosfatidilserinei pe faa extern a membranei plasmatice, acest fosfolipid, prnd a fi recunoscut ntr-o manier stereospecific de ctre subseturi de macrofage, de ctre celule melanoma, de celule musculare netede din pereii vaselor de snge i de celule Sertoli. n mod normal, fosfolipidele de membran sunt distribuite asimetric. Macrofagele sunt fagocite profesioniste care ndeprteaz celulele i corpii apoptotici, dar la acest proces pot participa i alte tipuri celular, ca, de exemplu, celule epiteliale i tumorale care pot ngloba celule apoptotice vecine. n timpul nglobrii celulelor apoptotice, macrofagele nu elibereaz ageni de tipul cicosanoizilor i citokinelor (70). Lipsa acestui rspuns, pare a fi determinat de mecanismul prin care celulele apoptotice sunt ingerate, dat fiind c celulele apoptotice, opsonizate pentru a putea fi preluate de receptorii Fc ai macrofagelor, induc, de exemplu, eliberarea de tromboxan. Totui, dac celulele apoptotice nu sunt preluate de ctre macrofage, ele se umfl i se dezintegreaz, eliberndu-i coninutul. Dac ar avea loc un astfel de eveniment pe parcursul clearance-ului neutrofilelor din situsurile inflamate, eliberarea coninutului granulelor citoplasmatice ar avea consecine nefaste. Mai mult dect att,
18

evadarea nedorit a materialului nuclear din leucocitele moarte, poate fi de asemenea periculoas, nucleozomii eliberai din limfocitele apoptotice neingerate pot stimula sinteza din ADN i imunoglobuline n limfocitele viabile (71). Prin urmare este posibil ca dezintegrarea limfocitelor apoptotice (presupus neingerate) s constituie o surs de ADN nucleozomal circulant, observat de altfel la anumii pacienii cu lupus sistemic eritematos, contribuind la stimularea policlonal a celulelor B tipic pentru aceast afeciune autoimun i intind autoanticorpi ctre pturile vasculare, cum ar fi glomerulii renali, n care componentele nucleozomale circulante s-ar putea lega (72). Exist mai multe mecanisme posibile de recunoatere a celulelor apoptotice de ctre fagocite i, de asemenea, mai multe statusuri int etalate de celulele apoptotice. Lectinele fagocitelor Un mecanism obinuit de interacie intercelular l reprezint legarea carbohidrailor de la suprafaa celular a unei celule de lectinele altei celule, mecanism care poate fi inhibat specific de ctre zaharuri simple recunoscute de lectine. Unele din consecinele apoptozei sunt reprezentate de modificrile specifice ale carbohidrailor de pe suprafaa membranei celulare. Se presupune c pierderea, printr-un mecanism nc necunoscut, a unui reziduu terminal de acid sialic din lanurile laterale glicoproteice ar putea s expun Nacetilglucozamina, N-acetilgalactozamina i galactoza, mascate n condiii normale, restituind aceste reziduuri accesibilitii interaciunii cu presupusele lectine macrofagice (73) (figura 7). Celula apoptotic

19

Fagocit
Figura 7. Trei mecanisme prin intermediul crora fagocitele ar putea recunoate celulele care intr n apoptoza.

Receptori trombospondinici ai fagocitelor Macrofagele umane derivate din monocite (HMDM) pot recunoate neutrofile i limfocite umane apoptotice prin intermediul receptorilor pentru vitronectina (VnR) v3 i receptorii scavenger din clasa B (CD36) (74). Aceti receptori se leag de trombospondina care servete drept punte ntre macrofage i celulele apoptotice. Se pare c aceast recunoatere este independent de expunerea fosfatidilserinei la suprafaa membranei celulei apoptotice i pare a fi legat de fenotipul macrofagului i nu de tipul celulei apoptotice. Receptorii pentru fosfatidilserina Este clar c macrofagele pot recunoate fosfatidilserina ntr-o manier dependent de doz i de stereospecificitate, fapt care sugereaz existena receptorului pentru FS. Au fost descrii o serie de receptori cu rol n medierea recunoaterii FS i anume CD68, CD14, anexinele, receptorii scavenger, beta2 glicoproteina I i gas-6. Exist i date care sugereaz recunoaterea FS de pe celulele apoptotice de ctre fagocite amatoare. Nu se tie totui dac aceti receptori sunt specifici pentru FS. Cel mai probabil este ca mai muli receptori pot lega FS, dar rmne nc sub semnul ntrebrii dac ei pot recunoate FS pe suprafaa celular. Foarte muli ani, semnificaia fagocitrii celulelor intacte nedorite a fost subestimat. Pn nu demult, nglobarea celulelor apoptotice a fost considerat ca o nlturare protectiv a celulelor nedorite (75). Recent

20

clearance-ului celulelor apoptotice i-a fost atribuit o nou semnificaie.n funcie de context,nlturarea celulelor apoptotice de ctre fagocite poate supresa inflamaia, poate modula deleia direcionat a celulelor gazd sau a paraziilor invadani de ctre macrofage i poate regla rspunsul imun (figura 8).

Figura 8. Clearance-ul fagocitic al celulelor apoptotice.

7. Genetica apoptozei n pofida numeroaselor progrese care s-au realizat n cercetarea tiinific este foarte dificil identificarea moleculelor responsabile de apoptoza cu ajutorul demersurilor biochimice i moleculare n sistemele mamaliene. Din fericire, nematodul Caenorhabditis elegans reprezint un model particular de studiu al reglrii genetice a apoptozei extrem de util (76). Pe parcursul dezvoltrii embrionare i larvare a nematodului sunt eliminate 131 din 1090 celule n cadrul unui program foarte bine caracterizat, invariant din punct de vedere spaio-temporal. Astfel s-a identificat un numr mare de mutaii care afecteaz stadii specifice ale procesului apoptotic i genele corespunztoare care au fost ordonate ntr-o schem genetic (figura 9). Aceste gene sunt implicate n decizia de a intra pe calea morii, n execuia acestei ci, n nglobarea celulelor muribunde i n degradarea resturilor celulare din cadrul nglobrii. Dou dintre aceste gene, ced-3 i ced-4 sunt necesare pentru toate formele de apoptoz din cadrul dezvoltrii i se consider a codifica efectorii finali ai cii apoptotice. O alt gen reglatoare cheie, ced-9, este necesar pentru supresia apoptozei n celulele programate s supravieuiasc (77). Aceste gene codific o protein omologa cu familia Bcl-2 din sistemul uman. Mai mult dect att, expresia lui
21

Bcl-2 poate inhiba apoptoza n nematode i poate chiar substitui parial pierderea funciei lui Ced-9, ceea ce indic faptul c cel puin cteva componente ale cii apoptotice sunt conservate n evoluie. Mutaiile survenite n 6 gene afecteaz nglobarea corpilor apoptotici de ctre celulele vecine nonprofesionale. Proteinele intracelulare Ced-2, Ced-5 i Ced-10 semnalizeaz ntro manier comparabil cu omologii lor mamalieni Crkll, DOC 180 i Rac , mediind reorganizarea i extensia citoscheletului celulei nglobatoare, posibil n transportul transmembranar de lipide. Ced-1 este analog receptorilor scavenger din sistemul mamalian; ced-7 i Ced-1 promoveaz, probabil, nglobarea interacionnd cu proteina adaptoare de semnalizare Ced-6 (78).

Figura 9. Schema genetic a apoptozei n C. elegans. Au fost izolate mutaiile din 14 gene diferite care afecteaz apoptoza n diferitele ei etape. Mutaiile care influeneaz decizia de a muri afecteaz doar un numr mic de gene. Genele implicate n etapele ulterioare sunt comune tuturor celulelor somatice din organism angajate pe calea morii. Activitatea ced-3 i ced-4 promoveaz moartea celular, iar ced-9 previne acest proces.

8. Semnificaia apoptozei n cancer i n terapia cancerului Implicaiile apoptozei n patologie Dereglarea procesului apoptotic, care are ca rezultat o moarte celular excesiv, insuficient sau prematur, constituie fundamentul iniierii i progresiei multor maladii umane. Se presupune c o exacerbare a apoptozei celulelor neuronale ar putea contribui la progresia i severitatea mai multor dereglri neurodegenerative care includ maladia Alzheimer, scleroza lateral amiotrofic, atrofia muscular spinal, maladia Parkinson, maladiile

22

neuromotorii i chiar atacul cerebral. Apoptoza excesiv la nivelul celulelor T circulante este corelat cu sindromul imunodeficienei severe i SIDA, n vreme ce manifestarea insuficient a acestui proces constituie mecanismul de declanare al anumitor boli autoimune i limfoproliferative. Inhibarea procesului apoptotic prin pierderea mutaiilor funcionale n genele activatoare ale morii sau ctigarea unor mutaii funcionale n genele supresoare de moarte este incriminat n transformarea neoplazic. Virusurile i-au dezvoltat mecanisme care manipuleaz calea apoptotic pentru a-i asigura perpetuarea propriei supravieuiri, inhibnd apoptoza celulelor infectate pentru a permite replicarea viral i activnd apoptoza mecanismelor celulare de aprare ale gazdei. innd cont de aceste realiti, manipularea cilor apoptotice prin intervenie farmacologic sau genetic promite noi oportuniti terapeutice pentru o serie de maladii. Circumstanele apariiei apoptozei se mpart n dou mari categorii. Apoptoza apare n esuturile normale, unde rspunde de deletia celulelor i este, de asemenea, observat n contexte patologice specifice. Cel puin ntr-o parte din situaiile din categoria a doua, poate fi susinut teoretic faptul c vine n sprijinul unei semnificaii biologice. Supravieuirea celulelor n curs de distrugere ar putea fi nociv gazdei. n contrast, necroza este totdeauna patologic fiind consecina lezrii majore a celulei i nu i poate fi atribuit nici o funcie homeostatic (9) Celulele rspund la leziune, dac pot, prin apoptoz. Dac un medicament induce apoptoza ntr-un limfocit, de obicei ne furnizeaz mai multe date despre celul dect despre medicament, deci astfel de experimente trebuie interpretate cu precauie. Implicaiile acestui proces n terapie sunt evidente: un medicament care inhib apoptoza poate fi folosit n prevenirea pierderii celulei acordnd timp altor forme de terapie s nlture infecia. n cancer, dimpotriv, va avea valoare terapeutic o cale de stimulare a apoptozei n celulele maligne. Modul de obinere al acestui efect cu specificitate adecvat reprezint o
23

provocare la fel ca n cazul agenilor chemoterapeutici uzuali. Desigur, celulele T citotoxice, una din cele mai strlucite invenii ale naturii, tiu cum s ucid specific. O alt potenial terapie e reprezentat de anticorpii declanatori ai apoptozei, dar foarte importante sunt i imunotoxinele care ascund liganzi care induc apoptoza. Concomitent cu explorarea potenialului terapeutic al apoptozei este necesar descoperirea mecanismelor i moleculelor implicate. Evoluiei i-au trebuit milioane de ani pentru dezvoltarea unui sistem desvrit, capabil s elimine celulele nedorite; nou ne revine dificil sarcina de a descoperi cum s inducem organismului comutarea procesului pe on sau off, la comand. Legturile intracelulare caracteristice formelor superioare de via nu ar fi posibile fr un mecanism de ndeprtare individual a celulelor care nu mai sunt necesare sau care nu mai funcioneaz normal. Reglarea defectiv a morii celulare programate ar putea juca un rol n etiologia cancerului, SIDA, bolilor autoimune i bolilor degenerative ale sistemului nervos central. Manipularea farmacologic a apoptozei ofer noi posibiliti de profilaxie i tratament acestor maladii. Transformarea malign Deoarece o celul trebuie s sufere o serie de modificri moleculare pentru a atinge fenotipul malign i datorit faptului c aceste schimbri sunt deseori induse de ageni sau tratamente care, n timp, altereaz celula, orice activeaz supravieuirea celulelor deteriorate sau iniiate promoveaz carcinogeneza. n majoritatea cazurilor, celulele canceroase sunt diferite de celulele normale din punct de vedere morfologic. Variaiile legate de mrimea i forma celulelor i a nucleilor lor corespund pleomorfismului celulelor tumorale.
24

Nucleul este deseori mrit, cu densiti inegale (hiper- sau hipocromatism), o membran nuclear neregulat, angulara, nucleoli proemineni, singulari sau multipli. Exist o cretere a raportului nucleo-citoplasmatic. Se observ i celule bizare, cu nuclei polilobai sau multipli i celule gigantice. Aceste modificri reprezint semnele citologice ale malignitii. Exist i excepii, n anumite varieti de cancer, celulele tumorale au un aspect morfologic foarte apropiat de celulele normale; ca urmare diagnosticul de malignitate este dificil de hotrt i n astfel de situaii se apeleaz la alte criterii, n particular arhitecturale. Majoritatea cancerelor se caracterizeaz printr-un numr mare de celule n diviziune. Aceste mitoze sunt uneori anormale, mitoze tri- sau multipolare. Indicele mitotic, definit prin numrul de mitoze pe unitatea de cmp microscopic, are o valoare data contribuind la evaluarea prognostic a tumorilor. n realitate, cancerele nu posed un indice mitotic ridicat, ca cel care se poate observ n patologia nontumoral. Totui, n anumite tipuri de cancer, diagnosticul de malignitate se bazeaz pe indicele mitotic (79). Apoptoza i cancerul Oncologii au fost tradiional preocupai n principal de proliferarea celular, cu toate acestea n ultimul timp atenia lor se ndreapt, cu un interes din ce n ce mai mare, spre studiul apoptozei (2, 11, 80). Observaia legat de apariia apoptozei n tumori nu este recent. Cu peste 20 de ani n urm, s-a sugerat ca apoptoz este responsabil de o mare parte din pierderile celulare care apar n tumori, observaii obinute n studiile cinetice, i nu mai este o noutate extinderea ei i activarea n tumori ca urmare a aplicrii bine cunoscutelor metode terapeutice: iradierea, chemoterapia citotoxic, ablaie hormonal (81, 82). Totui, n ultimii ani, extinderea cunotinelor despre controlul apoptozei la nivel molecular a dus la lrgirea semnificaiei ei potenial oncologic depind simpl alimentare a unei explicaii mecaniciste pentru deleia celulelor tumorale. n particular, descoperirea
25

faptului c apoptoza poate fi reglat de produii unor anumite proto-oncogene i de gena supresor tumoral p53, a deschis noi drumuri viitoarelor cercetri. Atunci cnd modificrile de la nivelul ADN cauzeaz acumularea anormal de celule se produce transformarea malign. Ratele comparative, ale morii celulare i ale diviziunii celulare, determin viteza de cretere a cancerului. Anumite celule canceroase se divid mult mai ncet dect celulele normale, dar cancerul continu s se extind datorit prelungirii timpului de via al celulei. Muli carcinogeni provoac rupturi ADN sau interfera cu enzimele necesare pentru replicarea corect a ADN. Celula poate rspunde la acest tip de alterare n mai multe feluri: poate ntrzia diviziunea celular pn la repararea leziunii, poate suferi apoptoza sau poate progresa fr ntrerupere n ciclul de cretere celular. Apoptoza este o metod eficient de prevenire a transformrii maligne deoarece ea ndeprteaz celulele care posed alterri genetice. Apoptoza anormal poate promova dezvoltarea cancerului, att prin permiterea acumulrii de celule n diviziune, ct i prin blocarea ndeprtrii variantelor genetice cu potenial malign ridicat. nc nu se cunosc factorii care determin celula s urmeze una din cele trei ci: intrarea n apoptoz dup leziune, repararea deteriorrii sau continuarea ciclului celular. Paradoxal, anumite gene care stimuleaz diviziunea celular, cum este c-myc, particip la deciderea cii de urmat (81). Concentraiile de ARN i proteina pentru c-myc crsc timpuriu n apoptoza i supraexprimarea acestor oncogene induce apoptoza n fibroblaste (82). Oncogena bcl-2 ar putea fi supresorul general al morii celulare pentru genele care regleaz direct apoptoza (83). Toate celulele hematopoetice i limfoide, multe celule epiteliale i neuronii conin gena bcl-2, ntlnit n special n membrana mitocondrial, nucleu i reticul endoplasmic. Limfoamele foliculare de celule B posed o concentraie crescut de protein Bcl-2, datorit
26

translocaiei [t(14:18)] care plaseaz gena bcl-2 sub controlul unui promotor puternic, cel al genei care codific pentru lanul greu al imunoglobulinei. Proteinele virusului Epstein-Barr cresc nivelul expresiei genei bcl-2 n celulele limfomuliu Burkitt (84). Comparativ cu limfocitele B normale, acelea care exprim bcl-2 supravieuiesc mai mult n cultur dup privarea de factori de cretere i sunt rezistente att la radiaii ionizante ct i la glucocorticoizi. De asemenea, concentraiile crescute de Bcl-2 protejeaz celulele de apoptoz indus de ctre c-myc (85). oarecii transgenici, care au fost inginerizai pentru a supraproduce protein Bcl-2, n limfocitele B, deseori dezvolt limfoame imunoblastice cu celule mari i difuze. La jumtate din aceste tumori cu grad avansat de dezvoltare se remarc translocaia genei c-myc (86). Produsul proteic al genei supresoare tumorale p53 poate ntrzia progresia ciclului celular naintea iniierii sintezei replicative de ADN. Multe cancere umane posed mutaii sau deleii la nivelul genei p53 (87). Proteinele codificate de virusurile oncogene pot, de asemenea, lega i inactiva proteina p53. Proasta funcionare a p53 poate promova dezvoltarea cancerului prin permiterea duplicrii DOAMNA n celulele cu mutaii secundare, nainte de o reparare complet. Totui p53 este doar un inhibitor al diviziunii celulare, n alte situaii se comport ca o apoptogen direct (o gen care cauzeaz apoptoza). Superproducerea proteinei p53 normale, n linia celular leucemic mieloid, induce rapid moartea celular prin apoptoz (88) (figura 10).

Figura 10. Relaia dintre proliferarea celular i apoptoza

27

n multe tipuri celulare, proliferarea necesit cel puin doi stimuli externi, uneori numii semnale de competen i progresie. Semnalele de competen declaneaz evenimentele metabolice comune att replicrii, ct i apoptozei; semnalul de progresie abate celula spre replicare, altminteri survine apoptoza. Apoptoza poate fi considerat o cale alternativ care distruge celulele incapabile s strbat punctul de vam nainte de replicarea ADN i se petrece n celulele competente activate, cnd un semnal de progresie este absent sau anormal sau cnd o celul nu-i repar o leziune ntr-o perioad critic. Majoritatea medicamentelor anticancerigene: inhibatori ai topoizomerazei, ageni alchilani, antimetabolii i hormoni antagoniti, produc apoptoza n celulele sensibile (89). n urma acestor observaii este subneles faptul c eficiena lor nu depinde totdeauna doar de interacia cu o int biochimic specific; un efect asupra evenimentelor metabolice conducnd la apoptoz poate, de asemenea, influena rspunsul la chemoterapie. S-a descoperit faptul c, n diferite cancere umane, concentraia endonucleazelor calciu dependente, care degradeaz ADN pe parcursul apoptozei, variaz enorm. Tendina unei celule cancerigene de a suferi apoptoza poate fi important n special pentru terapia tumorilor maligne cu o rat sczut de cretere, care sunt de obicei rezistente la ageni citostatici. Apariia spontan a apoptozei n tumori Apoptoza poate fi gsit n toate tumorile virtuale, netratate. Dei s-au efectuat puine studii cantitative precise (90), evalurile histologice indic faptul c extinderea apoptozei n anumite tumori umane se apropie de ceea ce s-a observat n esuturile cu involuie rapid, evideniind semnificaia sa cinetic, uneori considerabil. Factorii responsabili pentru apariia spontan a apoptozei n tumori sunt, indubitabil, diveri. Apoptoza, deseori este proeminent mai ales la locusul de confluen cu necroza, unde se presupune ca ischemia moderat este implicat
28

n iniierea ei, aceasta este o cauz cunoscut a activrii apoptozei n esuturile non-neoplazice (91, 92). S-a artat c TNF (factorul de necroz tumorql) induce apoptoza n liniile de celule tumorale in vitro, astfel, o serie de fenomene apoptotice observate in vivo n tumori ar putea fi atribuite eliberrii acestei citokine de ctre macrofagele infiltrante. n alte cazuri, apoptoza poate fi rezultatul atacului tumorii de ctre limfocitele T citotoxice. Totui un nivel ridicat al apoptozei este observat i n locusurile preneoplazice i n nodulii care se dezvolt n ficat dup administrarea de carcinogeni chimici (93), este improbabil c factorii menionat ar putea fi operativi n aceste circumstante. Este posibil ca prezumtivele mecanisme reglatoare ale populaiilor celulare, descrise mai sus, acioneaz ntr-o etap timpurie a procesului de carcinogenez, cu o apoptoz crescut care echilibreaz temporar creterea proliferrii celulare. n sfrit, nivelurile crescute de apoptoz n tumori pot fi rezultatul unui proces intrinsec al acestor celule. Ratele de apoptoz gsite n tumori similare difer, fiind rezultatul expresiei diferitelor oncogene. Bibliografie 1. T. S. Griffith, T. Brunner, S. M. Fletcher, D. R. Green and T. A. Ferguson, Science, 270, 1189-1192 (1995) 2. J. F. R. Keer, A. H. Wyllie and A. R. Currie, Br. J. Cancer 26, 239-257 (1972) 3. A. H. Wyllie, Cell death in Biology and Pathology, 9- 34 (1981) 4. C. Dive and J. A. Hickman, Br. J. Cancer 64, 192-196 (1991) 5. C. Dive, C. D. Gregory, D. J. Philipps, D. L. Evans, A. E. Milner and A. H. Wyllie, Bioch. Biophy. Acta 1133, 375-282 (1992) 6. H. M. Ellis and H. R. Horovitz, Cell 44, 816-829 (1986) 7. R. S: Malyapa and S. Sawada, Radiat. Res., 125, 134-140 (1991) 8. J. Y. Yuan and H. R. Horovitz, Dev. Biol. 139, 33-41 (1990)
29

0. A: H. Wyllie, J. F. R. Keer and A. R. Currie, Int. Rev. Cytol. 68, 251-305 (1980)

30