iZOLAREA I SORTAREA CELULAR

Majoritatea tehnicilor de analiz biochimic presupun izolarea celulelor din contextul lor tisular.
n acelai timp, pentru o analiz cantitativ i calitativ coerent, este necesar un numr relativ mare
de celule. Dac pornim investigaia de la un fragment de esut, problema ntmpinat const n
faptul c acest fragment conine un numr mare de specii celulare amestecate. Este, deci, necesar
extragerea diferitelor specii celulare urmat de o sortare n funcie de diferite criterii; dac numrul
de celule este satisfctor, se poate trece la destructurarea celular n vederea analizei coninutului;
dac numrul de celule este insuficient, se poate proceda la multiplicarea acestora n cadrul unor
culturi celulare, din care vor fi prelevate mostre pentru o analiz ulterioar.
Izolarea celular din esuturi
Cele mai accesibile esuturi animale pentru izolare celular sunt cele fetale sau neonatale, n care
dinamica i multiplicarea celular sunt accentuate iar stabilitatea jonciunilor intercelulare ca i
cantitatea de matrice extracelular sunt reduse. Desigur, celulele izolate trebuie s-i pstreze
viabilitatea fie c este vorba de o tentativ exploratorie fie c vor fi supuse cultivrii ulterioare.
Primul pas n vederea izolrii celulare este reprezentat de denaturarea conexiunilor intercelulare i
a liantului reprezentat de matricea extracelular. Jonciunile intercelulare sunt dependente de
prezena ionilor de Ca. Astfel, un chelator (agent de ndeprtare) al calciului cum este EDTA (acid
etilen-diamino-tetra-acetic) aplicat fragmentului de esut de investigat, va determina desfacerea
jonciunilor menionate, cu eliberarea celulelor. Matricea extracelular (incorect denumit anterior
substan fundamental) poate fi denaturat prin tratamentul fragmentului tisular cu enzime
proteolitice ca tripsina sau colagenazele (al cror rol este de a digera componentele ale matricei
extracelulare cum ar fi colagenul sau proteoglicanii). Dup tratarea unui fragment tisular prin
tripsinizare (cu tripsin) i EDTA, de obicei este suficient o uoar agitare a eantionului pentru a
disocia celulele viabile. n eprubeta de lucru se obine o mixtur celular, format din celule izolate,
n suspensie.
Al doilea pas este separarea i sortarea celulelor n suspensie, obinute prin izolarea din esuturi.
Procedurile de separare implic metode fizice, cum ar fi centrifugarea, care va fi descris la metodele
de separare a organitelor celulare, pentru care a fost iniial conceput. Alte proceduri de separare se
bazeaz pe capacitatea celulelor de a adera mai mult sau mai puin la diferite tipuri de suprafee
(sticl sau plastic).
Una din cele mai interesante tehnici de sortare este bazat pe posibilitatea utilizrii anticorpilor
specifici. Aceti anticorpi (proteine specifice sintetizate de celulele sistemului imun, ca rspuns la
structuri non-self) pot fi ataai la suprafaa celulelor, n mod diferenial i pot interaciona adeziv cu
diferite suporturi organice (colagen, polizaharide, microsfere de plastic. Aceste suporturi organice
formeaz o suprafa de afinitate la care celulele marcate cu anticorpi vor adera. Dup aderare,
celulele pot fi desprinse fie prin agitare uoar, tratament cu tripsin (tripsinizare) pentru a denatura
proteinele care au mediat fenomenele de adezivitate sau tratament cu enzime care denatureaz
substratul de tip matriceal (colagenul pentru care utilizm o colagenaz).
Una din tehnicile cele mai avansate de sortare a celulelor utilizeaz cuplarea cu anticorpi urmat
de marcajul fluorescent al acestora. Celulele marcate astfel (cu anticorpi marcai la rndul lor cu
fluoroforul specific) sunt separate de un sistem de sortare prin activarea fluorescenei. Celulele
marcate circul prin acest sistem de sortare n flux laminar iar fluorescena fiecrei celule este
msurat precis. Un subansamblu de sonicare formeaz picturi microscopice care conin cte o
celul sau nu conin deloc celule. Aceste picturi microscopice sunt ncrcate pozitiv sau negativ n
momentul formrii, n funcie de pozitivitatea sau negativitatea fluorescenei. Apoi, picturile trec

printr-un cmp electric care le deviaz traiectoria n funcie de ncrcarea electric. Astfel, picturile
cu ncrcare pozitiv (i care conin celule marcate fluorescent) sunt depozitate ntr-un recipient fiind
separate de cele ncrcate negativ. Particulele i picturile nencrcate i continu parcursul n mod
gravitaional, ajungnd n recipientul de deeuri. Astfel de sisteme de sortare au o capacitate de 5000
de celule pe secund.
Celulele obinute prin aceast metod de sortare pot fi supuse direct analizelor biochimice sau pot
fi direcionate spre alte metode de multiplicare celular culturi tisulare i stabilizarea de linii
celulare.
Culturi tisulare i celulare
Prin definiie, culturile tisulare reprezint totalitatea tehnicilor de meninere i n unele situaii
de cretere i multiplicare in vitro a unor mici fragmente tisulare extrase de la plante sau animale.
Culturile tisulare sau celulare sunt necesare pentru studiul efectelor unor substane endogene sau
exogene asupra sistemelor vii. Culturile de esut sunt utilizate pentru a iniia culturi celulare.