Lp.

10
NUCLEUL ÎN TIMPUL DIVIZIUNII
MITOTICE- EVIDENȚIEREA CROMOZOMILOR
FAZELE DIVIZIUNII CELULARE MITOTICE
-Metode de citogenetica-
 OBIECTIV IMPORTANȚA
E STUDIULUI
• Studiul nucleului în mitoză
• Evidențierea fazelor • Evidențierea cromozomilor în
diviziunii mitotice diferite faze ale ciclului celular.
Model - meristemul radicular • Identificarea erorilor din timpul
de ceapă (Allium cepa) diviziunii (induse clastogenic) cu
• Calculul indicelui mitotic și a effect mutagenic.
duratei ciclului celular și a
fazelor mitotice
Mitoza la celule
animale
(renale)-
imagine în
microscopie cu
fluorescență
 IMPORTANȚA
Analiza cromozomilor este o metodă citogenetică de mare valoare
biologica și în practica medicală deoarece ne permite să stabilim:
o Numărul și caracteristicile morfologice ale cromozomilor la subiectul normal al
speciei
o Modificări de număr și structură cromozomială în diferite sindroame clinice sau cu
etiologie genetică sau presupus genetică
o Efectele citogenetice ale unor compuși chimici (naturali sau sintetizați) asupra
celulelor somatice și în special asupra aparatului cromozomic
o Cito-taxonomie comparată, precizarea originii unor specii prin evoluție cariotipică,
prin resinteză artificială.
 IMPORTANȚA
În domeniul medical evidențierea cromozomilor se poate face în orice tip
de celulă capabilă să se dividă, sau a cărei diviziune poate fi declanșată de
un stimulent mitotic.
În domeniul farmaceutic se urmăreste evidențierea modificărilor la nivel
citologic sau molecular sub acțiunea unor substanțe (sintetizate sau extrase
din țesuturi vegetale sau animale) care sunt testate pentru stabilirea
nivelului toxicității, pentru aplicații în domeniul sintezei medicamentelor.

Metodele citogenetice sunt folosite pentru studiul „in vivo” sau „in vitro” al
efectelor factorilor mutageni asupra cromozomilor umani, sau ca
modalitate de investigație paraclinica în diagnosticul sindroamelor
genetice.
 MATERIALE BIOLOGICE
FOLOSITE :
Celule umane sau animale folosite în cultură :
• Fibroblaștii din piele se folosesc pentru culturi de lungă durată.
Datorită sincronizării creșterii și diviziunii celulare, aceste culturi sunt
folosite pentru studiul „in vitro„ a efectelor agenților mutageni asupra
cromozomilor umani.
• Celulele epiteliale din lichidul amniotic provenite de pe suprafața Fibroblaști din piele umană (×
embrionului sau fătului (recoltate prin amniocenteză sunt folosite 100)
pentru diagnosticul prenatal pentru analiza aberațiilor prenatale). Nilforoushzadeh M A, Ahmadi Ashtiani H R,
Jaffary F, Jahangiri F, Nikkhah N, et al.
Dermal,2017
• Măduva osoasă servește pentru studiul aberațiilor cromozomiale din
celulele care „in vitro„ sunt capabile de diviziune permanentă. În acest
caz nu este necesară cultura de celule, evidențierea și analiza
cromozomilor din aceste celule se face prin metoda directă. Celule din
• Limfocitele din sângele periferic sunt folosite preferențial pentru măduva
osoasă
studiul efectelor agenților mutageni asupra cromozomilor umani.

https://www.lab.anhb.uwa.edu.au/
MATERIALE BIOLOGICE FOLOSITE :
Celule vegetale provenite din țesuturi
meristematice în care se găsește întotdeauna
un număr însemnat de celule în diferite faze
ale mitozei.
Aceste țesuturi pot fi:
• vârful radicelelor
• țesut meristematic foliar

https://www4.uwsp.edu/biology
 Aplicații
EVIDENȚIEREA NUCLEULUI ÎN FAZELE DIVIZIUNII MITOTICE LA MERISTEMUL
RADICULAR DE ALLIUM CEPA
Metoda rapidă de colorare a cromozomilor cu fuxină bazică (reactiv Schiff)

 Deoarece se urmărește studiul cromozomilor în mitoză, se va folosi țesut meristematic

radicular, în care se găsesc mare celule în diferite faze ale diviziunii mitotice.

Secțiune
longitudinală
prin varf
radicular
Principiul metodei
• Metoda a fost elaborată de Feulgen (1924) de unde și numele reacției
specifice țesutul fixat este hidrolizat cu acid clorhidric, după care
se tratează cu reactivul Schiff.
• Reacția Feulgen este considerată până în prezent cea mai specifică
reacție citochimică de evidențiere a ADN-ului.
• Hidroliza are ca scop îndepărtarea din celule a ARN-ului, nu și a ADN
cromozomial. De asemenea, se descoperă grupările aldehidice ale
dezoxiribozei prin separarea purinelor. Aceste grupe aldehidice,
reacționează apoi cu substanța colorantă.
• De asemenea, are loc macerarea structurilor vegetale prin dizolvarea
substanțelor pectice.
Efectuarea preparatelor
• Prelevarea materialului vegetal
Se vor tăia rădăcinuțele de 6-8 mm din porțiunea de vârf a radicelelor de Allium
cepa.
• Fixarea
Se face cu acid acetic 45%, fiolele cu fixatorul și rădăcinuțele se lasă la frigider 1-16
ore.
• Hidroliza atenuată
Se tratează materialul biologic cu HCl 1N, timp de 2-5 minute, la 60 ̊C.
• Colorarea
După hidroliză se îndepărtează acidul clorhidric din vase și se adaugă 2-3 ml de
reactiv Schiff. Durata de colorare este de regulă 10-15 minute.
Colorarea este gata când zonele de creștere ale rădăcinuțelor au devenit roșii –
violacee. Pentru siguranță timpul se va prelungi la 30-60 minute.
Etalarea materialului vegetal
Se vor efectua prin metoda squash astfel: se ia o lamă și se pune o picătură de acid
acetic 45%.
Din rădăcinuțe se va păstra zona de creștere (2-4 mm).
Se acoperă cu o lamelă și se presează cu un bețișor de lemn sau cu un creion cu
radieră până la o etalare evidentă a materialului radicular.
Acest lucru se observă prin întinderea uniformă și sub formă circulară a zonelor
colorate.
 Etape de obținere a preparatului

Recoltarea Hidrolizarea atenuată

radicelelor

Colorarea radicelelor Etalarea prin strivire manuală

 Într-un ciclu celular,
FAZELE DIVIZIUNII MITOTICE ȘI nucleului i se descriu două
ASPECTELE APARATULUI CROMOZOMIC stări funcționale:
1. Starea metabolică
(interfaza) în care se
desfășoară procesele
de sinteză care
Interfază – perioada dintre 2 diviziuni celulare, celulele pregătesc diviziunea
prezintă un nucleu bine conturat, colorat aproape celulară
2. Starea mitotică sau
uniform, sau prezentând granulații cromatice diviziunea
(cariozomi).

Nucleul bine conturat,

colorat uniform
 FAZELE DIVIZIUNII MITOTICE ȘI ASPECTELE APARATULUI CROMOZOMIC

Profaza
• Cromozomii sub formă de filamente colorate, lungi subțiri.
• În profaza incipientă sunt mai lungi si mai subțiri, cu cât profaza e mai
avansată sunt mai îngroșați, fiind bicromatidici.
Metafaza
• Cromozomii sunt scurti si grosi, bine colorati;
• Cromozomii sunt prinși cu centromerul de filamentele fusului nuclear în
partea lui centrală; au dispunere ordonată, fiind repartizați în planul
ecuatorial al celulei .

Profaza Metafaza
 FAZELE DIVIZIUNII MITOTICE ȘI ASPECTELE APARATULUI CROMOZOMIC
Anafaza
Cromozomii se separă,
Telofaza
Are loc transformarea cromozomilor monocromatidici în filamente;
încheierea diviziunii se consideră în momentul apariției membranei
celulare despărțitoare.

Anafaza Telofaza timpurie Telofaza avansată

 Modificari observate la nivel nuclear cu
importanta în evaluarea citologica
• Modificările din timpul diviziunilor duc la intarzierea migrării
cromozomilor formându-se punți cromozomiale sau cromozomi
retardati. Daca se formează peretele înaintea migrării unor
cromozomi acestia rămân în citoplasmă rezultând micronuclei.

Telofază cu punți, Telofază cu cromozomi

interfază cu retardați si punți (Popa &
micronuclei Leonte)
Determinarea indicelui mitotic si a duratei fazelor mitotice

Indicele mitotic reprezintă procentul de celule aflate în diviziune sau în diferite

faze ale sale față de totalul celulelor dintr-un preparat microscopic.
IMG (indice mitotic general) = Nm/Nt
Nm = numărul celulelor aflate în diviziune
Nt= numărul total al celulelor examinate din microscop

Se raportează procentual (%)

IMF (indicele mitotic pe faze)= Nf/Nt

Nf= numărul celulelor aflate într-o anumită fază a diviziunii
Nt= numărul total al celulelor examinate din microscop

Se raportează procentual (%)

 Modalitate înregistrare a datelor:
Număr Numărul celulelor din preparat Numărul
câmpuri analizate total de celule

interfaza profaza metafază anafază telofază

1 Exp.30 42 12 17 2 103

2            

Calculul duratei fazelor ciclului celular pe baza indicelui mitotic

Pentru determinarea duratei mitozei și a fazelor sale este necesar în prealabil să cunoaștem durata ciclului celular,
adică timpul scurs între momentul apariției unei celule și până la diviziunea sa. La Allium cepa se consideră că acest
ciclu se desfășoară în 20 de ore la o temperatură de 20 ͦC.
Pe acestă bază se poate calcula durata fazelor ciclului celular utilizând formula :

Df = 20 x IMF/100
Df= durata fazei
IMF = indicele mitotic al fazei
Imagini microscopice cu diverse faze ale diviziunii
mitotice
Interfaza

Profaza

Metafaza
Imagini microscopice cu diverse faze ale
diviziunii mitotice

Interfaza

Profaza

Anafaza
Imagini microscopice cu diverse faze ale
diviziunii mitotice

Interfaza

Anafaza

Telofaza
Imagini microscopice cu diverse faze ale
diviziunii mitotice
Interfaza

Telofaza

Profaza

Metafaza