Laborator 9

În marea lor majoritate, caracterele ereditare sunt determinate de gene localizate în

nucleu. Comportamentul acestor gene se supune legilor formulate de Mendel şi Morgan. În
unele cazuri însă, s-a constatat că unele caractere ereditare se transmit preferenţial pe linia unui
genitor, de regulă a genitorului matern, indiferent de structura genetică nucleară a acestuia sau
a genitorului patern (homozigotă dominantă - AA, heterozigotă –Aa sau homozigotă recesivă -
aa), ceea ce înseamnă că aceste caractere nu se supun legilor mendeliene ale eredităţii.
Asemenea caractere, nu sunt determinate de gene localizate în nucleu ci de gene
extranucleare localizate, în principal, în organitele citoplasmei celulei eucariote.
Principalele gene extranucleare sunt localizate în mitocondrii şi cloroplaste, organite
caracteristice celulelor eucariote. Organitele celulare sunt structuri specializate, din citoplasma
celulară, care îndeplinesc funcții specifice și care posedă membrană proprie.
Genomurile organitelor celulare, caracterizate până în prezent, sunt reprezentate de câte o
moleculă circulară de ADN, care a primit notaţia de ADNmt pentru mitocondrii sau de ADNcp
pentru cloroplaste.
Mitocondriile sunt organite celulare complexe specializate în respiraţia celulară şi
fosforilarea oxidativă, care prezintă un sistem genetic propriu şi implicit mecanisme specifice de
sinteză proteică. Mitocondriile au rolul de a stoca energia sub formă chimică sintetizând molecule
de adenozin trifosfat (ATP) care participă la majoritatea proceselor metabolice. În cadrul acestor
reacţii, ATP este degradat eliberând astfel energia stocată.
Au o formă sferică sau elipsoidală, cu un diametru de 0,3- 0,7 μ şi o lungime de 1-7 μ, cu
un inveliş dublu. Conţin ADNmt, ribosomi de tip procariot şi toate tipurile principale de ARN
(ARNm, ARNr, ARNt), ceea ce dovedeşte desfaşurarea unor procese de biosinteză proteică in
interiorul organitului (fig. 9 -1). Genele mitocondriale se transmit ereditar de la o generaţie la
alta non-mendelian, pe linie maternă.
Pentru studierea genelor mitocondriale sunt utilizate diferite tipuri de celule mutante. O
astfel de categorie de celule mutante sunt mutantele petite, denumite astfel datorită dimensiunii

1
reduse a coloniilor. În genomul mitocondrial de la drojdii, au fost indentificate diverse tipuri de
restructurări, mai ales deleţii, prin care apar tulpinile petite. Toate mutantele de acest tip, se
caracterizează prin pierderea funcţiilor mitocondriilor astfel că, tulpinile de acest tip supravieţuiesc
numai datorită capacităţii alternative a drojdiilor de a trăi în mediu aerob sau anaerob.

Fig. 9 -1. Mitocondrie

Mutantele petite pot apărea spontan (cu o frecvenţă a mutaţiei de 10- 5 per generaţie)
sau pot fi induse prin tratarea celulelor cu diferiţi agenţi mutageni chimici (de ex. bromura
de etidiu). Fenotipul respectiv este transmis generaţiilor următoare într-o manieră non-
mendeliană.
Examinarea microscopică a mutantelor petite a evidenţiat faptul că dimensiunea celulelor
este normală dar, deoarece ele cresc mult mai încet din cauza unor modificări respiratorii,
dimensiunea coloniilor este mai mică decât cea a celulelor normale.
Analiza genetică a mutantelor petite a permis evidenţierea a 3 clase de mutante:
- mutante petite nucleare (de segregare);
- mutante petite neutre ( ρ+) şi
- mutante petite supresive ( ρ - )
Mutantele petite nucleare (de segregare)- se datorează afectării unor gene cu localizare
nucleară. Ele prezintă o segregare de tip mendelian: prin încrucişarea lor cu celule haploide
normale se formează celule diploide normale, care în urma procesului de meioză, formează asce
în care raportul de segregare este de 1:1 (1/2 dintre coloniile haploide ce se formează prin
germinarea sporilor vor fi normale, iar ½ vor fi mutante).

2
 Mutantele petite neutre ( ρ+) – prin încrucişarea lor cu celule haploide normale se formează
celule diploide, din care după meioză, se formează spori haploizi ce vor genera exclusiv colonii
normale (raport de segregare 4 : 0;)
Mutantele petite supresive ( ρ -- ) – se datorează unor deleţii extinse ale ADNmt.
Încrucişările dintre aceste mutante şi celulele normaledetermină formarea de diploizi petite şi apoi
de ascospori mutanţi ce formează exclusiv colonii petite (raport de segregare 0 : 4).

Se foloseşte o tulpină de S. cerevisiae din care se realizează o cultură de 18 ore la 30oC, pe

mediu solid YPGA.
 Se prepară o soluţie de bromură de etidiu 10 mg/l în apă distilată, din care se plasează
un volum de 10 μl în centrul unei plăci Petri cu mediu agarizat;
 Se însămânţează cu ansa biomasa microbiană (reprezentată de cultura de S. cerevisiae)
în striuri, urmând 2 diametre perpendiculare ale plăcii. Plăcile se incubează 48 ore la
30oC;
 După incubare, urmează analiza plăcilor şi observarea apariţiei unei zone de inhibiţie a
creşterii, în jurul picăturii de bromură de etidiu.

Se ia cu ansa biomasa de la marginea zonei de inhibiţie şi se însămânţează în spot pe alte plăci cu

mediu YPGA, plăci ce vor fi folosite ca matriţă. Plăcile se incubează 48 ore la 30oC.
După incubare, se realizează o replică plating pe plăci cu mediu cu glicerol, care se incubează 48
ore la 30oC.
Se analizează plăcile identificându-se mutantele petite.

Medii şi soluţii utilizate

Mediu YPGA
Soluţie de bromură de etidiu (10 mg/l în apă distilată);
Mediu cu glicerol: 1 % extract de drojdie, 1 % peptonă, 0,1 % glucoză, 2 % glicerol.