TRANSFORMAREA

GENETICA A CELULELOR
BACTERIENE
❑ transformarea celulelor de E. coli DH5α cu vectorul pGFP se realizează pentru
observarea transferului proteinei cu fluorescenţă verde şi dobândirii rezistenţei
la antibiotice (kanamicină)
❑ transformarea celulelor de E. coli DH5α poate fi realizată cu molecule de ADN
recombinant (pUC18/19 + ADN cromosomal de B. subtilis B2) pentru observarea
transferului rezistenţei la antibiotice (ampicilină) şi restabilirea capacităţii de
metabolizare a lactozei (lac+)

❑ scopul experimentului este transformarea celulelor de Bacillus licheniformis

B40 cu genotip amy- cu ADN cromosomal izolat de la o tuilpină de Bacillus
subtilis B2 cu genotip amy+
 Transformarea celulelor de Escherichia coli Transformarea celulelor de
Bacillus licheniformis
- se utilizează tulpina E. coli DH5α mutantă - se utilizează o cultură bacteriană de 18 h
(lac-) care se cultivă 18 h la 37oC în mediu obţinută în mediu lichid LB la 37oC;
LB; - se centrifughează 2 ml suspensie
- se centrifughează 2 ml suspensie bacteriană 5 minute la 6.000 rpm;
bacteriană 5 minute la 6.000 rpm
- sedimentul se reia într-un 1 ml soluţie - celulele depuse prin centrifugare se spală
sterilă rece de Tris HCl 10 mM (pH = 8) şi de 2-3 ori cu apă distilată sterilă sau cu
CaCl2 50 Mm soluţii slab ionice (glicerol 10%, sorbitol,
- se incubează 15 min. pe gheaţă, apoi PEG, glucoză) pentru îndepărtarea
celulele sunt depuse prin centrifugare şi urmelor de mediu;
reluate în 200 l din aceeaşi soluţie şi se - celulele se resuspendă într-un volum de
incubează pe gheaţă timp de 30 min., glicerol (1 ml) astfel încât concentraţia
pentru obţinerea celulelor competente celulară să fie 1x1010 celule/ml;
- se adaugă 10 l soluţie de ADN - se realizează amestecul pentru
transformant (pGFP sau pUC18/19 + ADN electroporare: 100 l celule
cromosomal de B. subtilis B2) şi se electrocompetente + 5 l ADN
continuă incubarea pe gheaţă 15 min. transformant ce conţine aproximativ 3 g
ADN şi se supune unui puls electric;
 Transformarea celulelor de Escherichia coli Transformarea celulelor de
Bacillus licheniformis
- amestecul se incălzeşte 2 min. la 42oC, - celulele transformate se reiau într-un 1 ml
apoi este diluat până la 1 ml cu mediu LB mediu LB şi se incubează 30 – 60 min. la
proaspăt; 37 oC pentru multiplicarea celulelor;
- suspensia se incubează 20 – 40 min. la - se fac diluţii zecimale 10-4 – 10-5 apoi se
37oC pentru multiplicarea celulelor însămânţează 100 l pe mediu simplu –
transformate; geloză (martor) pentru determinarea
numărului de celule supravieţuitoare şi
100 l pe mediu selectiv – geloză cu
amidon 1% şi se incubează 24 h la 37oC
- din amestec se fac diluţii şi se
însămânţează câte 100 l pe plăci Petri cu
mediu selectiv (geloză cu kanamicină
pentru evidenţierea coloniilor rezistente
la kanamicină şi fluorescente sau mediu
EMB cu 20 g/ml ampicilină pentru
evidenţierea coloniilor lac+ şi rezistente la
ampicilină);
- plăcile însămânţate şi etalate se incubează
24 – 48 h la 37oC, după care se apreciază
eficienţa transformării.
Transformarea celulelor de Escherichia coli

transferul de material
genetic exogen într-o
gazdă corespunzătoare
se bazează pe anumite modificări ale
învelişurilor celulare microbiene,
care permit penetrarea acestora de
către macromolecule

natură = fenomenul este posibil

datorită apariţiei unei stări fiziologice
temporare numită stare de
competenţă, care se instalează într-o
anumită etapă a ciclului de dezvoltare
a bacteriilor
 Bacillus • starea de competenţă este maximă la începutul fazei
subtilis staţionare şi durează şase ore

• starea de competeţă nu apare în mod natural, dar ea

poate fi indusă in vitro prin tratamente chimice şi
fizice: soluţii ce conţin săruri (CaCl2, RbCl) şi
Escherichia şocuri termice (0oC – 42oC)
coli • in urma acestor tratamente, celulele de E. coli devin
capabile să preia din mediu moleculele de ADN
exogen
 • adsorbţia ADN transformant la celula receptor
• în prima fază reversibilă, apoi ireversibila
Adsorbţia

• pătrunderea ADN transformant în celula receptor

Pătrunderea

• integrarea ADN transformant în cromosomul celulei gazdă receptor

şi exprimarea sa (obţinerea celulelor transformate)
• ADN exogen cromosomal va participa la procese de recombinare
genetică cu ADN al cromosomului gazdei
• ADN exogen plasmidial poate participa la următoarele tipuri de
procese: - două molecule monocatenare vor hibridiza şi vor
Integrarea reforma molecula dublucatenară;
- iniţierea sintezei replicative a catenei
complementare şi refacerea structurii dublucatenare.
• in absenţa recombinării, ADN exogen este degradat şi nu se exprimă
 pentru explicarea mecanismului de transport al
ADN exogen în interiorul celulei bacteriene a
fost emisă ipoteza transformasomului

➢ se consideră că după traversarea membranei plasmatice, ADN este preluat într-o veziculă
intracitoplasmatică numită transformasom, care transportă ADN până la nivelul
nucleoidului bacterian unde îl eliberează
➢ în cazul bacililor ADN transformant este convertit la forma monocatenară în cursul
transferului prin membrana plasmatică
➢ la E. coli (şi în general la bacteriile Gram negative), ADN transformant traversează
membrana plasmatică păstrându-şi forma dublucatenară
- ADN devine monocatenar doar în interiorul celulei, fiind protejat de nucleazele
gazdei de către transformasom
➢ ADN exogen transformant pătruns în celulă poate fi integrat în cromosomul gazdei în
urma unui proces de recombinare pe bază de omologie
➢ in absenţa recombinării, ADN transformant este degradat
➢ procesul de transformare se poate realiza atât cu ADN cromosomal, cât şi cu ADN
plasmidial
 Transformarea celulelor de Bacillus licheniformis cu
ADN heterolog prin electroporare

➢ modificarea genetică a microorganismelor în scopul obţinerii unor cantităţi

mai mari de enzime (proteaze, amilaze etc.) presupune transferul informaţiei
genetice de interes în celule acceptoare, care să permită selectarea tulpinilor
transformate

➢ bacilii pot fi transformaţi prin trei procedee:

- transformarea celulelor competente
- transformarea protoplaştilor
- electroporare (electrotransformare)
 ❖Transformarea celulelor competente

✓ la bacili, transformarea se bazează pe existenţa unei stări fiziologice tranzitorii

numită stare de competenţă, care este asociată cu anumite modificări la
nivelul membranei plasmatice ce permit pătrunderea în interiorul celulelor a
unor molecule de ADN exogen transformant

✓ starea de competenţă la bacili apare în cursul cultivării pe medii minimale, la

sfarşitul fazei exponenţaile şi începutul fazei staţionare

✓ deşi este relativ uşor de obţinut starea de competenţă, ea se utilizează mai rar
deoarece momentul apariţiei acestei stări variază în funcţie de tulpina cu care
se lucrează
 ❖ Transformarea protoplaştilor
✓ presupune utilizarea unor celule lipsite de perete celular (protoplaşti), care
sunt capabile să accepte molecule de ADN exogen

✓ peretele celular este îndepărat prin tratament enzimatic cu lizozim – acţionează

asupra componentelor peptidoglicanului hidrolizând legăturile dintre acidul N-acetilmuramic şi N-
acetilglucozamină

✓ deoarece protoplaştii sunt protejaţi doar de membrana plasmatică, ei sunt

foarte sensibili la condiţiile de mediu

✓ pentru a preveni degradarea acestora, trebuie menţinuţi în medii izotonice sau

hipertonice care să conţină un stabilizator osmotic (în cazul bacililor acesta este
sucroza în concentraţii mari 0,3 – 0,5 M)

✓ succesul experimentelor de transformare a protoplaştilor depinde nu numai de

obţinerea şi transformarea lor ci şi de posibilitatea regenerării peretelui
cellular, astfel încât celulele recombinate să poată fi menţinute şi utilizate în
condiţii normale de mediu (fără stabilizator osmotic)
- se elimină bariera de specie – pot fi
transferate molecule de ADN exogen
provenite de la specii neînrudite
filogenetic
- pentru transformare pot fi folosite
atât molecule de ADN cromosomal cât
şi molecule de ADN plasmidial

- fragilitatea protoplaştilor
- sensibilitatea la variaţiile condiţiilor
de mediu
 ❖ Electroporarea (electrotransformarea)

✓ a fost descoperită în urma studiilor efectuate asupra celulelor animale (hematii)

supuse acţiunii câmpurilor electrice

✓ constă în inducerea unei permeabilizări reversibile a celulelor procariote sau

eucariote prin utilizarea unui câmp electric

✓ in prezenţa unui câmp electric extern, componentele membranei celulare devin

polarizate şi membrana este traversată de un potenţial electric

✓ dacă diferenţa de potenţial depăşeşte o valoare prag, membrana se „rupe” în

anumite zone şi devine permeabilă pentru moleculele exogene

✓ dacă mărimea şi durata aplicării câmpului electric nu depăşesc o anumită

valoare critică limită, permeabilitatea este reversibilă, celula nefiind afectată

✓ electrotransformarea presupune introducerea de ADN cromosomal sau

plasmidial într-o celulă gazdă prin intermediul unui puls electric de tensiune
înaltă
❑ Factorii de care depind electroporarea sunt următorii:
• concentraţia ADN transformant (la bacterii eficienţa maximă de transformare este atinsă
cu 1 – 5 g ADN/ml)

• dimensiunea moleculelor de ADN (moleculele mai mici au eficienţă mai mare de

transformare)

• conformaţia moleculară a ADN (ADN supraîncolăcit este mai eficient decât cel linear)

❑ Randamentul de transformare este influenţat de:

• stadiul de creştere al culturii bacteriene
• compoziţia mediului de cultură a culturii bacteriene
• aerarea şi temperatura la care este menţinută cultura bacteriană
- se pot folosi atât protoplaşti cât şi celule
cu perete celular
- este o metodă rapidă şi eficientă

- sensibilitatea protoplaştilor la
tratamentul cu curent electric
- barierele de restricţie ale celulelor
receptoare
- posibila prezenţă în mediul de
electroporare a unor nucleaze nespecifice