.1.

r,"

Inginerie genetici, sem II LP3

TRANSFORMAREA GENETICA T,A PLAI\TE

Transformarea geneticl la plante a devenit posibih in yitro in urnr_e dese,operirii faptului cd o serie de bacterii din sol apar,tindnd genului Agrbbacterium sunt capibile sd determi*e introducirea in genomul vegetal a unei-secvenfe de ADN propriu. Acest ADN transferat notat ADN-T se gdsegte la nivelul unor plasmide (megaplasmide, mai mari de 100 kb) existente in speciile de Agrobacterlum iumefaciens (Ti) gi

rhizo

(Ri).

Plasmidele de la Agrobacterium tumefaciens se numesc Ti ,,tumor inducing,' pentru ci prezenfa ADN in celula vegetald este urmatd de aparilia la nivelul plantelor infuctate a unor tumori.

Plasmidele de la Agrobacterium rhizogenes se numesc Ri ,,root inducing', pentru c[ plantele infectate formeazf o serie de rlddcini adventive la nivelul unor organe unde in mod normal ele nu se formeaza (pe frunze, pe tulpind). Riddcinile determinate de Ri au un geotropism negativ. Plasmidele Ti sunt molecule de ADN dublucatenar circular, se afl6 in num6r mic de copii/celuli (l-2 copii/celulr) gi au dimensiuni mai mari de 100 kb (150 - 200 kb). La nivelul ADN-T se gtrsesc mai multe tipuri de gene: ' onc (sau tum) - codificl hormoni vegetali (auxine gi citokinine) ce modificd metabolismul; in celula vegetalI transformat[ .(ce conline ADN-T) prezenla genelor onc determind un aport suprimentar de hormoni vegetali, deci o multiplicare anormalE a celulelor respective gi formarea de tumori; ops (opine sintetase) - gene ce asigurd sinteza in celulele vegetale transformate a unor aminoacizi anormali numi{i opine (nopalina - nos gi octopina - ocs); iceste gene au promotor gi secvenf6 terminator proprii.(bacteriene) pe care echipamentul enzimatic al celulei vegetale Ie iecunoagte, ceea ce permite utilizarea acestor elemente reglatoare pentru clonarea sub controlul unor gene de
interes.

'

de secven,tele marginale Ts gi Tp cu lungime de 25 I ADN-T in celula vegetald, se gdsegte operonul vrr. licate in transferul conjugativ al ADN-T din celula lui vir, transferul ADN-T in celula vegetald este

Dimensiunile mari ale Ti gi Ri ca gi faptul cd determin[ un fenotip anormai, impiedicd utilizarea lor ca atare pentru transferul unor gene de inteies-in ptante. Pornind de la aceste plasmide au fost obtinuti rginale (Tr- qi Tp) din ADN:T. intre aceste secven{e selecfia celulelor transformate precum gi situsuri de de interes. Dintre genele marker eistente la nivelul

t l I

a ffi -

neomicinfosfotransferaza ce determind rezistenta la kanamicind; cloramfenicolaminotransferaza; gus p-glucuronidaza, permite utilizarea unui test histochimic de identificare a celulelor transformate - substratul cromogen incolor este convertit Ia un compus de culoare albastrd.; codifrci o proteini cu fluorescenfd verde.
cat

npt

II -

Pentru a testa capaci Agrobacterium izolate din dife

Testare

nor tulpini de Agrobacterium sau ridlcini adventive a unor tulpini de din urmdtoarele variante experimentall:

1.
SC

mercuricd 0,05Yo spal[ foarte bine cu apd distilatd din acest morcov setaie rondele gi
se

materialul biologic se sterilizeazl prin incubare timp de 30 de minute intr-o solufie de cloruri

parte

din

rondele se. inoculeaz8

st se

de agent de sterilizare

bacteriandlrondea), acestea constituind probele

cu s

i ce ingin

(cate

o,l ,-l

ap6"

agarizatd
suspensie

dupi incubarea la temperatura camerei timp de doud sdptimAni, se examineazd apariEia de tumorete/rdddcini adventive la suprafala disgurilor inoculate, comparativ cu discurile martor (neinoculate)
2.
SE

se spald cu ap6 distilati suprafala mai multor frwue sau o regiune din tulpina unei plante test cu un ac spatulat sterilizat se rdnegte planta

rinii se aplicd tulpina bacterianl testatii (prin utilizarea unei anse microbiologice) recomandd se ca locul rdnit gi infectat str fie protejat cdteva zile prin acoperireisa cu vatii umectat6 in apd distilatd sterili (pentru a s preveni deshidratrea gi suprainfectarea rfurii) dupd' 2-3 slptimdni se examine azt, apafifia de tumori/ridicini adventive Ia nivelu] locului infectiei tumorile/rEd6cinile aptrrute pot fi detagate, sterilizate gi trecute pe plici cu mediu de culturd ide obic_ei Murashige gi Skoog), fdri adaos de fitohormoni, deoarecelesutul tumoral este independent de fitohormonii exogeni (el fiind capabil si sintetizeze acste substanle carczultat al infectriei bacteriene)
la nivelul

rntroducerea unui vector de clonare in cerulele vegetale

Aeeste experimente au ca scop;

(pentru sinteza B-glucuronidazei bacteriene) exprirlarea genelor marker tn tesutul vegetal prin examinarea,rezistenfei la kanamicinl a celulelor vegetale transformate gi prin realizarea de teste histochimice (aparilia de spoturi sau zone albastre pe fragmentele de fesut transformat dupi incubarea acesiora intr-o solulie ce contine substrat cromogen) Experimentele de acest tip au, in principiu, dou[ etape: transferul vectorului de clonare in tulpini de A. tumifaciens infectarea plantelor cu tulpina de A. tumefaciens ce confine vectorul dorit

stabilirea metodologiei pentru introducerea in celulele vegetale a unor gene purtate de vectorul pBll2l; genele marker sunt npt /1 (pentru rezistenltr Ia la kanimicina) gi gzs

Se poate realiza prin:

Vectoriideclonareutiliza[ipentrut.-'fe[i,deobicei, tr Pvrruu !rqrilwrur ue 6srrs rrt esrur('r(' vtrB9liue sun[ menTlnu[L qe oDlcel, tulpini de E.coli, de unde sunt izolafi atunci iend ert. necesar. Pentru introducerea de gene de ll.9l".:" interes in celulele vegetale au fost elaborate numeroase
cu suspensia bacteriani vectorul de clonare speci Din acest motiv, este
corespunzdtoare de A. tumefociens. metode, dintre care, cele mai simple,

Tra

ideA.

p."ruiun

"o-

Metodologia de transformare a celulelor de A. ttumefaciens este relativ complicati (inghel erea unui vector de clonare dorit (cu sau ftr[ gend de
ca procesul de conjugare sd se realizeze este necesar sinteza pililor qi merlierea transferului) gi genele

mccocafsnff[

incepArad vu

oril).

,q
pBI121, fiind vector de clonare construit in vitro, nu con,tine asemenea funcfii rra gi _ -Plasmida mob- Pentru a se rcaliza totugi transferul s6u prin conjugare, se utiiizeazi sistemul conjugdrii ,'triparentale". Acea$a inseamni cE funcfiile necesare conjug6rii sunt furnizate de o a treia ptasttiiAa denumiti.,helperi purtat6 de o tulpind de E.coli specificd.-De asemene4 tulpina de A. tumefaciens utilizatf drept acceptor al vectorului de clonare trebuie sd fie gi ea ,,prelucrati". Astfel, plasmida Ti pe care o poarti este ,dezarmatl", adicl nu mai conline regiunea ADN-T, ceea ce inseamni cd ea nu mai poate transfera nici o gend in celulele vegetale. Aceastii plasmidd prezintd, doar operonulvir ce codific6 func{iile necesare transferului ADN-T (prezent in vectoruf de clonare) in celulele vegetale finti. Vectorul utilizat pentru transfer este pBll2l. Acesta confine marginile 1rSi Tp (secvenfele marginale de 25 pb) ale ADN-T (secvenfe esen]iale pentru ca transferul sd riugeasc6), intre care au i'ost clonate genele marker nptll $i8lts. A$a cum se poate observa in fig. 2, genago" Lrrc clonatd sub controlul promotorul 35S de la CaMV pi confine, in plug o secvenfd MCS la nivelul c6reia se pot introduce gene de interes. Acest sistem de clonare permite, in final, oblinerea de proteine de fuziune (iroteina codiflatd de gena de interes este produsi in formi fuzionald cu p-glucuronidaza).

Mod de lucru:
ryp"n^sii bacteriene proaspete oblinute prin cultivarea tulpinilor bacteriene timp de 18'24 ore la 30'3fC, in mediu LB cu kanamicinE sau rifampicinl (in funcfie de tulpine) de remarcat cd' A. tumefaciens creSte mai greu decdt E. coli, iar temperatura de cultivare este 30oC 2. se centrifugheazd.cdte 1,5 ml suspensie din fiecare cultura bacteiiand (5 mirrute la 4.000 rpm) 3. sedimentul celular se spal[ cu cdte I ml solufie MgSOa l0 mM (sterila), pentru a indepftta orice urmd de antibiotic 4. sedimentul celular oblinut dup[ centrifugare (5 minute la 4.000 rpm) este reluat in c6te I ml de solufie MgSOa l0 mM 5. se amestecd 750 pl suspensie deA. tumefaciens cu 150 pl suspensie de E. coli helper gi 150 pl suspensie de E. coli ce con{ine vectorul; amestecul se agiti suficient de bine 6. amestecul se incubeazd2 ore la 30oC 7. se insimdnfeazd' cdte 0,1 ml din amestecul respectiv pe pl6ci cu rnediu selectiv (Ml6 suplimentat cu antibiotice) 8. placile se incubeazd,la2SoC timp de 2-3 zile dupd care se examineazd aparilia coloniilor rezistente la arrtibioticele din mediu; acestea sunt reprezlntate de celule de A. tumefaciens in care a fost transferat vectorul pBI I 2 I

1.

se utilizeazA

prin utilizarea unor fragmente de fesut vegetal cure cultivdrii.

Mod de lucru:

Testarea capacit5lii transformante a transconjugan{ilor obfinuli prin conjugarea triparental[ se face

si

incubeazd,., iuspensL 6acterian6

metoda co-

2.

l.

se folosesc plante obginute

prin culturi in vitro

3'

4-

suspensia bacteriand de interes este obfinuti prin cultivarea bacteriilor timp de 24 orela 30oC se utilizeazl fragmente de tulpini sau frunze de la plante crescute in vitro iar fragmentele obfinute se introduc in suspensia bacteriand

5.

menfinere pe acest mediu se fac pasaje pe mediu selectiv (suplimentat cu celotaxim

kanamicind).

fesutul vegetal se incubeaz6 in suspensia bacterianl cdteva ore (2-4 ore); atunci cdnd se utilizeazd alt tip de ,tesut decdt cel de la plante de tutun sau se testeazd diferite-tulpini de A. nou izolate, timpul de incubare este mai lung (p6n[ la 48 de ore la 20-25oc,la intunericj dupd incubare, fragmentele de lesut vegetal sunt trecute mai intdi pe placi cu mediu de culturd (MS) ce conline cefotaxim (pentru indepdrtarea bacteriilor contaminante), iar dup6 o siptimdnd de
gi