Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
PROFESOR COORDONATOR:
2012
CUPRINS
Capitol Pagina
1. Introducere...2 2. Caracterizarea general a microorganismelor...4 2.1. Microorganisme eucariote.5 2.1.1. Morfologia fungilor...5 2.1.2. Producerea de proteine de ctre fungi5 2.2. Microorganisme procariote.6 2.2.1. Morfologia bacteriilor...6 3. Metabolosmul bacterian.7 3.1. Consideraii generale. Catabolism. Anabolism 7 3.2. Catabolismul proteinelor i al aminoacizilor.7 3.3. Anabolismul .8 3.3.1. Biosinteza aminoacizilor cu ajutorul microorganismelor.9 4. Microorganisme utilizate la obinerea de aminoacizi....11 Bibliografie.....16
1. Introducere
Multe procese biotehnologice pot fi considerate ca avnd un nucleu alctuit din trei componente n care o parte se ocup cu obinerea celui mai bun agent biologic pentru o anumit funcie sau proces, a doua parte creeaz cel mai bun mediu pentru ca, agentul biologic s funcioneze, i a treia parte se ocup cu separarea i purificarea unui produs sau a unor produse eseniale din procesele de fermentaie. n majoritatea exemplelor efectuate pn acum, cea mai eficient, stabil i convenabil form de agent biologic pentru un proces biotehnologic este un organism ntreg i din acest motiv, cea mai mare parte a biotehnologiei se nvarte n jurul proceselor microbiene. Microorganismele pot fi vzute att ca fixatori primari ai energiei fotosintetice ct i ca sisteme pentru producerea schimbrilor chimice n aproape toate tipurile de molecule organi ce sintetice i naturale. mpreuna, ele au un imens lot de gene ce ofer un potenial aproape nelimitat, biosintetic i degradant. Mai mult, microorganismele pot avea rate de cretere extrem de rapide fa de organismele mai mari cum ar fi plantele i animalele. De aceea, cantiti mari de produse pot fi obinute n condiii de mediu corespunzator, n perioade scurte de timp.1 Diversele microorganisme utilizate n microbiologia industrial aparin principalelor tipuri cunoscute: bacterii, fungi (drojdii i mucegaiuri) i microalge. Microorganismele folosite n industrie trebuie s posede urmtoarele caracteristici:
1
S fie culturi pure, att lipsite de alte microorganisme vizibile la microscop, ct i lipsite de virusuri; S cresc rapid i viguros dup inoculare, pentru a obine cantiti mari de inocul, nainte de procesul industrial; S creasc pe un substrat ieftin, pe care s l transforme n cea mai mare parte si ntr-un timp ct mai scurt; S tolereze cantitai mari de produs final fr sa l metabolizeze, permind acumularea lui n mediu i separarea uoar de ali produi; S nu produc substane toxice;
Vamanu A., Popa O., Cmpeanu G., Cmpeanu S., Vamanu E., Cmpeanu C., Biotehnologii microbiene, vol.2
S manifeste rezisten la contaminare, fie prin capacitatea de cretere la pH sczut sau la temperaturi ridicate, fie prin elaborarea rapid de inhibitori microbieni;
S fie stabile genetic, adic s-i conserve n timp caracterele biochimice, fr riscul variaiilor genetice.
Microorganismele care ndeplinesc aceste condiii pot fi izolate din natur sau obinute din colecii de culturi.
Celula este unitatea de baz a organismelor vii, multe dintre acestea fiind unicelulare, n timp ce altele sunt multicelulare, fcnd posibil specializarea celular. Toate celulele conin un fluid (matricea de baz), nconjurat de o membran citoplasmatic, alcatuit n principal din lipide i proteine. Acestea conin, de asemenea, acizi nucleici, cruii fizici ai informaiei genetice, alturi de ribozomi, care sunt implicai n sinteza proteic. Celulele se impart n dou categorii: procariote (fig.1), caracteriznd grupurile archae i eubacterii, i eucariote (fig.2), ce cuprind fungii, protozoarele, algele si alte plante, precum i animale.2
3. Metabolismul bacterian
6
3.1.
Celula bacterian, dei simpl ca structur, reprezint un sistem complex i organizat, capabil s si sintetizeze propriile macromolecule, plecnd de la monomeri cu greutate molecular mic. Energia necesar sintezelor celulare este asigurat, la cele mai multe bacterii, de oxidarea enzimatic a substratului lor nutritiv. Metabolismul bacterian poate fi, deci, definit ca totalitatea reaciilor biochimice prin care energia i substanele biogene sunt luate din mediu i utilizate pentru biosinteza componenilor celulari i cretere sau pentru alte activiti vitale (micare, luminiscen). Reaciile biochimice specifice metabolismului se ncadreaz n dou tipuri de ci metabolice. Reaciile prin care se elibereaz energia (exergonice) constituie catabolismul sau procesele de dezasimilaie, iar reaciile prin care se consum energie (endergonice) corespund anabolismului sau proceselor de asimilaie. Creterea celulei este rezultatul unei stnse interdependene dintre procesele metaboli ce, deoarece o parte din energia eliberat n urma catabolismului i unii metabolii intermediari cu un numr variabil de atomi de carbon sunt utilizai n biosinteza macromoleculelor celulare.
3.2.
Proteinele din mediul ambiant, sau de cultur, din cauza moleculelor lor mari, nainte de a ptrunde n celula bacterian, sunt hidrolizate enzimatic n peptide cu molecul mic. Enzimele proteolitice (exoenzime) sunt raspunztoare de hidroliza proteinelor n peptide, iar peptidazele (endoenzime) hidrolizeaz peptidele n aminoacizi. Ansamblul reaciilor care asigur hidroliza proteinelor pn la aminoacizi poart numele de proteoliz. Bacteriile care posed proteaze exocelulare i care sunt capabile s utilizeze proteinele ca unic surs de azot i chiar de carbon, se numesc proteolitice. Din acest grup fac parte att bacterii aerobe ( Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, unele tulpini de stafilococ i streptococ) ct i bacterii anaerobe, dintre care unele foarte active (Clostridium histolyticum, Clostridium sporogenes). Proteazele bacteriene prezint un interes industrial deosebit att n industria pielriei, textil i a detergenilor ct i n industria alimentar i farmaceutic. 7
Polipeptidele rezultate n urma aciunii proteazelor, vor fi hidrolizate, n continuare, n aminoacizi sub aciunea pentidazelor endocelulare. Unele specii bacteriene, aerobe i anaerobe, lipsite de proteaze, posed numai peptidaze ceea ce le permite folosirea peptonei ca unica surs de N i C. Aminoacizii eliberai n urma proteolizei sunt folosii n proteinosintez iar surplusul va fi catabolizat pe mai multe ci din care dezaminarea i decarboxilarea sunt cele mai importante.
3.3.
Anabolismul
Structurile eseniale ale celulei bacteriene sunt constituite dintr-un numar mare de macromolecule, pe care celula trebuie s-i sintetizeze plecnd de la monomerii mediului de cultur sau de la cei furnizai de cile metabolismului intermediar. Macromoleculele celulare sunt polimeri constituii dintr-un numr variabil de monomeri identici (homopolimeri) sau diferii (heteropolimeri), dispui linear sau ramificat. Prin hidroliz, polimerii elibereaz subunitaile (monomerii) constituente ceea ce dovedete c ei se formeaz prin reacii de deshidratare i c monomerii se asambleaz prin legturi anhidrice. ncorporarea lor n polimer (Tabelul nr.1).3 Tabelul nr. 1. Activarea monomerilor Polimerul Monomerul Monomer activat Proteine Aminoacizi Aminoacil-AMP Aminoaci-ARNt Polizaharide Monozaharid MonozaharidNDP Acizi nucleici Nucleozide monofosfat Nucleozide trifosfat NTP (nucleozid trifosfat) ATP Fosfodiester Glicozidic Agentul activator ATP,ARNt Tipul de legtur Peptidic n biosintez monomerii sunt n prealabil activai prin cuplarea lor cu o molecul macroergic, dupa care are loc
Vamanu A., Popa O., Cmpeanu G., Cmpeanu S., Vamanu E., Cmpeanu C., Biotehnologii microbiene, vol.1
Aminoacizii necesari pentru sinteza proteinelor de ctre microorganisme pot fi gsii ca atare, n mediu, de unde provin, de regul, din aciunea enzimelor proteolitice extra- sau intracelulare. n cazul microorganismelor cultivate pe medii cu azot anorganic sau cu un numr restrns de aminoacizi, toi aminoacizii sau respectiv cei care lipsesc, trebuie sintetizai n cursul metabolismului. Obinerea de aminoacizi cu ajutorul microorganismelor are urmatoarele particulariti: - Asemenea celor mai multe ci biosintetice, cile de biosintez ale celor aproximativ 20 de aminoacizi sunt, n cea mai mare parte, diferite de cele utilizate pentru degradare i se realizeaz prin intermediul unor secvene multienzimatice diferite, dintre care unele sunt foarte complexe; - Cile biosintezei sunt intricate cu cele ale catabolismului, deoarece muli acizi organici, care aparin metabolismului intermediar al glucidelor, sunt folosii ca precursori ai aminoacizilor; - Cu excepia histidinei, care urmeaz o cale de biosintez izolat, ceilal i 19 aminoacizi naturali sunt derivai pe ci biosintetice ramificate, avnd ca punct de plecare un numr relativ mic de precursori metabolici care pot fi grupai n funcie de originea lor biosintetic n 6 familii (Tabelul nr. 2.). Aceasta modalitate de biosintez prezint o serie de avantaje decurgnd n primul rand, din faptul c un numar limitat de compui servesc ca substrat pentru sinteza tuturor aminoacizilor, spre exemplu: oxalilacetatul este folosit pentru biosinteza a 6 aminoacizi, -cetoglutaratul pentru 4, iar piruvatul pentru 3. n acelai timp, acest mecanism limiteaz numarul enzimelor (aproximativ 100) care particip la formarea aminoacizilor naturali i favorizeaz intrarea n joc a mecanismelor de reglare (represia sintezei i retroinhibiiei), cnd formarea sau funcia lor este inutil. In sfrit, frecvent, cile metabolice ale biosintezei unor aminoacizi sunt parial comune ca, de exemplu, cele pentru familiile oxalilacetat i piruvat.
Aminoacizii produi Alanina, valina, leucina Acid aspartic, asparagina, metionina, treonina, izoleucina, lizina Glutamat, glutamina, arginina, prolina
-cetoglutarat
Glutamat
Serina Aromatica
----
Cile de biosintez au fost precizate cu ajutorul mutantelor bacteriene auxotrofe pentru unul sau mai muli aminoacizi, la care pierderea unei enzime dintr-o secven metabolic conduce ca regul general - la acumularea n mediu a precursorului imediat al etapei afectate de mutaie. De asemenea, un rol important n elucidarea acestor ci a avut-o urmrirea repartizrii atomilor marcai (14C) n produsul final al biosintezei sau n intermediarii si, precum i izolarea i purificarea enzimelor care catalizeaz diferitele etape ale procesului. S-a demonstrat c nevoile nutritive ale bacteriilor auxotrofe pentru un anumit aminoacid pot fi satisf cute nu numai de acest aminoacid, ca atare, ci i de precursorii si.
Microorganismele difer n ceea ce privete capacitatea lor de a sintetiza aminoacizi. Unele bacterii (de exemplu: Leuconostoc mesenteroides ) nu pot crete dect dac gsesc n mediu 16 aminoacizi diferii. Acest categorie de microorganisme nu se poate dezvolta dect n mediile bogate n aminoacizi preformai, prin descompunerea substanelor de provenien proteic. Alte bacterii, ca E. coli, pot sintetiza toi aminoacizii necesari pornind de la NH3. Dei cele mai multe microorganisme necesit o forma redus de N, ca amoniacul, numeroase bacterii i fungii pot utiliza, ca i plantele superioare, nitriii sau nitraii. Biosinteza aminoacizilor pune dou probleme fundamentale, reprezentate de sinteza scheletelui format din atomi de C i fixarea gruparii NH2. n unele cazuri, de exemplu, n sinteza alaninei de la piruvat, se sintetizeaz n primul rand scheletul de C, iar gruparea NH2 este adaugat ulterior printr-o reacie de transaminare.
Fig. 3. Sinteza alaninei de la piruvat n alte cazuri, scheletul de C deriv direct de la intermediari ai ciclului acizilor tricarboxilici, de exemplu, ac. aspartic de la oxalilacetat i ac. glutamic de la cetoglutarat. La rndul lor, aceti doi aminoacizi devin precursori ai altor aminoacizi. Biosinteza aminoacizilor aromatici ( L-tirozina, L-fenilalanina i L-triptofanul) este foarte complicat i este iniiat printr-o condensare ntre fosfoetanolpiruvat (PEP) i eritrozo-4-fosfat, pentru a produce un intermediar fosforilat cu 7 atomi de C. Acesta sufer o ciclizare, pentru a forma 11
acid 5-dehidroquinic, care devine ciclul aromatic al produilor finali. Adiia unei noi molecule de PEP la un ultim intermediar hidroaroatic acidul 5-fosfoshikimic furnizeaz atomii de C pentru lanurile laterale ale tirozinei si fenilalaninei. Produsul acestei a doua condensri, acidul chorismic este situsul primei divergene metabolice. n continuare, el poate fi convertit fie la acid prefenic, precursorul fenilalaninei i al tirozinei, fie la acid antranilic, precursorul triptofanului.4 Biosinteza Histidinei urmeaz o cale complet independent i este realizat de 9 enzime, care asigur formarea acestui aminoacid, pornind de la 5-fosforibazil-1-pirofosfat (PRPP), ATP i glutanin. Este probabil calea cea mai complicat din cauza naturii intermediarilor i a faptului c se suprapune unei pri din sinteza ciclului purinic. Acest fenomen este ilustrat i de originea atomilor de carbon i azot din structura moleculei histidinei, dintre care 5 atomi de carbon deriv de la riboz, un atom de la glutamin i un fragment C-N de la ATP, prin desfurarea ciclului adenin al acestuia (fig.4). Restul ciclului adenin al ATP poate fi reciclat, prin introducerea n calea de sintez a purinei i n refacerea ATP.
Fig. 4. Originea atomilor de C i N din structura histidinei (5 atomi de C de la riboz) Aceast cale, numai aparent neeconomic, asigur o conexiune intim ntre biosinteza histidinei i cea a nucleotidelor purinice: ATP este degradat n cursul sintezei histidinei, dar produsul acestei degradri poate reintra n calea de sintez a purinei ntr-o etap relativ avansat a procesului respectiv.
4
12
Biosinteza obinerii acidului glutamic. Acidul L-glutamic este primul aminoacid obinut prin biosintez. Este folosit n terapeutic n tratamentul unor afeciuni ale sistemului nervos central, n realizarea unor preparate farmaceutice antialergice i n boli de nutriie. Cel mai important microorganism producator este Micrococcus glutamicus cu caracteristici comune genului Corynebacterium i Brevibacterium, i anume: bacteria n form de bacili scuri, Gram + , imobili, aerobi; necesit biotin ca factor esenial de cretere. Forma bacteriilor variaz n funcie de compoziia mediului. Alte microorganisme producatoare pot fi Brevibacterium flavum i Brevibacterium lactofermentum. Biosinteza acidului glutamic de ctre Corynebacterium glutamicum se realizeaz pornind de la glucoz i ioni de amoniu. Glucoza este oxidat la citrat, iar acesta mai departe la -cetoglutarat (prin ciclul Krebs) care, prin aminare reductiv, se transform n acid glutamic. n cursul oxidrii de la citrat la -cetoglutarat, intervin dou NADP-dehidrogenaze specifice acestui microorganism, care actioneaz cuplat. Microorganismul poate folosi pentru degradarea glucozei pn la piruvat att ciclul glicolizei, ct i pe cel al pentofosfailor. n condiii de aerare predomin calea pentofosfailor, favoriznd acumularea acidului glutamic. n condiii anaerobe, predomin ciclul glicolizei i n acest caz se formeaz acid lactic. De aici reiese importana deosebit pe care o are aerarea de-a lungul procesului. n afar de condiiile de aerare, alt factor important este coninutul de biotin. Aceast vitamin are rol cheie n biosinteza i acumularea glutamatului n mediu. Un coninut maxim de biotin determin o cretere maxim a microorganismelor, dar descrete cantitatea de glutamat; invers, un coninut sczut de biotin, mergnd pn la deficient, determin acumularea unor cantiti mari de glutamat. Biosinteza producerii Lizinei. Lizina este un aminoacid utilizat n cantiti importante n alimentaia animalelor i a omului. Lizina a fost izolat n 1889 din hidrolizat de protein de ctre Drechsel. Se cunosc dou procedee de obinere a acestiu aminoacid: sinteza n dou etape i sinteza direct. Sinteza n dou etape se bazeaz pe obinerea, n prim etap, a acidului diaminopimelic, utiliznd o mutant de E. coli pornind de la glucoz, n cultur sub agitare i aerat. n a doua etap, acidul diaminopimelic obinut este supus aciunii unui al doilea microorganism. Enterobacter aerogenes, care posed diaminopimelic-decarboxilaz, enzim ce produce decarboxilarea acidului diaminopimelic la lizin; cultura de Enterobacter aerogenes este supus aciunii agenilor chimici (butanol, toluen) sau fizici (ultrasunete) pentru a elibera enzima. 13
Sinteza directa este cea mai utilizat metod i folosete un singur microorganism. Pornind de la Corynebacterium glutamicum i utiliznd ca ageni mutageni radiaii UV sau , s-au obinut o serie de mutante biochimice, toate fiind mutante auxotrofe pentru diferii aminoacizi. Cea mai util este o mutant de homoserin i biotin. Se utilizeaz i mutante auxotrofe de homoserin sau mutante reglatoare de Brevibacterium lactofermentum. La Corynebacterium glutamicum si Brevibacterium exist dou puncte critice, n care biosinteza poate fi limitat: 1. Producerea aspartatkinazei, a crei activitate poate fi inhibat printr-o inhibiie feed-back de prezena simultan a unui exces de lizin i treonin in mediu. Nici unul dintre aminoacizi nu exercit inhibiie separat, ci numai impreun; 2. Devierea de la homoserin, prin homoserin-dehidrogenaz. Pentru a fi eliminate aceste dou blocri printr-o singur mutaie, exist trei modalitai: Utilizarea mutantelor auxotrofe de homoserin sau homoserin-dependente; Utilizarea mutantelor sensibile la treonin sau metionin; Utilizarea mutantelor rezistente la un analog al lizinei: S-2-(aminoetil)-L-cisteina.
n prezent, prin tehnologiile de biosintez se obine un numr mare de aminoacizi, iar elucidarea mecanismului de biosintez a permis ridicarea randamentului n faza de fermentaie i optimizarea lui. Unii aminoacizi, printre care acidul L-aspartic, L-fenilalanina, sunt obinui prin procese enzimatice de bioconversie; alii, printre care L-izoleucina, L-triptofan, sunt produi n prezena unor precursori specifici, iar a treia clas de aminoacizi, printre care acidul L-glutamic, Llizina i L-valina se obin prin fermentaii submerse. Cei mai activi productori de aminoacizi de uz terapeutic sunt bacteriile din genul Arthrobacter, Mycobacterium, Micrococcus, Corynebacterium. La ora actual, producerea de aminoacizi se realizeaz cu tulpini slbatice (prototrofe), obinndu-se acidul L-glutamic, L-valina, D,L-alanina, L-Pro; cu mutante auxotrofe de aminoacizi, cnd se produc Lys, Tre, Leu, Pro, Val, Asp; cu mutante auxotrofe de biotin, rezultatul fiind acid L-glutamic; cu mutante reglatoare: Lys, Tre, Arg, Met; pornind de la precursori de biosintez. Ali aminoacizi importani pentru industria farmaceutic, produi cu ajutorul microorganismelor sunt: L-cisteina obinut cu tulpini capabile s hidrolizeze acidul 2-amino-2tiozolin-4-carboxilic: Pseudomonas sp., E.coli, Bacillus brevis, Micrococcus sodenonsis; L-alanina, obinut cu Pseudomonas dacunhae; L-arginina, utiliznd tulpini de Corynebacterium glutamicum i 14
Bacillus subtillis; L-glutamina cu mutante de Brevibacterium flavum; L-izoleucina, cu Serattia marcescens, Corynebacterium glutamicum sau E. coli.5
15
BIBLIOGRAFIE
1. Zarnea, G., Tratat de microbiologie general, vol.2, Editura Academiei Republicii Socialiste Romnia, Bucureti,1984, pag. 262-265 2. Florentina Matei, Microbiologie aplicat, Editura Printech, Bucureti, 2011, pag. 1315, 167-170. 3. Vamanu Adrian, Popa Ovidiu, Cmpeanu Gheorghe, Cmpeanu Sorin, Vamanu Emanuel, Cmpeanu Carmen, Biotehnologii microbiene, vol.1, Editura Ars Docendi, Bucureti 2003, pag. 13-15, 23,25,39,79,91,105-107 4. www.stireal.edu.md/biologie/candidat/microbiologie_ind.pdf 5. www.referateok.ro/referate/117_1211462183.doc
16